Name: זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד שיטה לכימות דינמיקת ענפים דנדריטיים בנוירונים מתפתחים של Drosophila באמצעות הדמיה חיה ותוכנת סימון תלת-ממדית. הפרוטוקול מאפשר מעקב אחר קצות הענפים ומספק תובנות לגבי מורפוגנזה דנדריטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, המכונים הלאומיים לבריאות. . פרויקט מספר 1ZIANS003137

זהירות: פרוטוקול זה כולל את השימוש של מחלקה IV לייזרים ידרוש הכשרה נאותה והנחיות בטיחות לעקוב. להימנע עין או חשיפה לעור לאור לייזר ישיר או מפוזר. הערה: הפרוטוקול כולל שישה שלבים. זרימת העבודה מוצגת באיור 1א.
1. תיוג נוירונים בודדים באמצעות טכניקת פליפ-out
הערה: התיוג היחיד של LNvs מושגת על ידי הבעת mCD8:: GFP ב-LNvs בודד באמצעות בזלזול-בתיווך סטוכסטי תיוג. הגנוטיפ של קו הזבוב הוא: hs-flp; Pdf-Gal4; Uas-frt-CD2-להפסיק-frt-mCD8:: gfp11,12,13. תדירות השגת היחידה המסומנת בתווית אחת היא כ -10%. מניות הזבוב נשמרות במדיום הסטנדרטי בcircadian-ומבוקרת לחות של 25 ° c.
<ol><li>לאסוף 100-200 ביצים בתוך 2 החלון h הפריה העמוד על צלחת מיץ ענבים עם תוספת שמרים. מחדש את העוברים ב 25 ° צ' עבור 24 שעות ולאסוף הזחלים הראשונים שבקע הראשון לשלב הבא.</li>
	<li>מחממים את הזחלים הראשונים שבקעו ב-37.5 ° c במשך 40 דקות, עם תקופת החלמה של 40 דקות באמצע.</li>
	<li>תרבות הזחלים ב -25 ° c עם שולטת מעגליות ולחות לשלב ההתפתחותי הרצוי.</li>
</ol>2. מתנגדים והרכבה זחל המוח הגובר
<ol><li>נתח מוחות זחל בתמיסה הפיסיולוגית החיצונית (120 מ"מ מילימטר, 4 מ"מ MgCl2, 3 מ"מ kcl, 10 Mm נחקו3, 10 מ"מ סוכר, 10 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ, 10 מ"מ Hepes, 2 מ"מ Ca2 +, PH 7.2) תחת מיקרוסקופ לנתיחה (4.5 x הגדלה כוח) עם שני זוגות של #5 מלקחיים לחיתוך בקצה הרגיל (11 ס מ). השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הזחל הגוף במקום והשני כדי לנתח בזהירות את המוח. שמור על דיסקי העין, אונות המוח וחוט העצב הגחוני. הסר את השרירים המחוברים כדי למזער את התנועות לדוגמה במהלך ההדמיה.</li>
	<li>להכין שקופית זכוכית (25 x 75 x 1.0 מ"מ3) ולהשתמש במזרק כדי לצייר תא מרובע עם שומן ואקום.</li>
	<li>הוסף 20 μL של פתרון מלוחים חיצוניים לחדר מרובע עם מחסומי גריז.</li>
	<li>להעביר את המוח הזחל גזור לתוך התא על שקופית זכוכית באמצעות מלקחיים. התאימו את מיקום המוח מתחת לטווח החיתוך כדי להבטיח את הפנים הצדדיות.</li>
	<li>כסו את החדר עם כיסוי זכוכית (22 x 22 x 0.15 מ"מ3). המוח הזחל מותקן כעת על השקופית בתוך חדר מלא בתמיסה מלוחים חיצונית (איור 1ב). הערה: הקשה בעדינות על הכיסויים מגבילה את המוח ומפחית את מדגם הנסחף בהפעלת ההדמיה הבאה.</li>
</ol>3. הזמן פקיעה הדמיה חיה
הערה: אנו מבצעים ניסויים בהדמיה בזמן שימוש במיקרוסקופ מוקדי המצויד בלייזר רב-פוטון. יש לכוונן את פרמטרי הרכישה לצורך הגדרות דימות אחרות.
<ol><li>זיהוי מתקני המוח המכילים נוירונים המסומנים בנפרד באמצעות מטרה טבילה במים 40X (NA 1.3) ו מקור אור פלורסנט. עבור אוסף תמונות, השתמש בלייזר שני פוטון מכוון 920 ננומטר וגלאי שאינו מקובץ (NDD).</li>
	<li>לאסוף תמונות ב 512 x 512 פיקסלים לכל מסגרת ו 1 דקות לכל Z-מחסנית עבור 10 דקות. כוונן את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציה מספקת של x-y-Z תוך הקפדה על הכיסוי של הארבור הדנדריטים כולה בתוך 1 דקות (איור 2, וידאו משלים 1). ההגדרות יוצרות תמונות ברזולוציה של x-y-z טיפוסית של 0.11 x 0.11 x 0.25 יקרומטר3.</li>
	<li>לאסוף את הזמן סדרת תמונה בתוך 30 דקות של קרע במוח. נתונים עם סחיפה מוגזמת או הידרדרות מורפולוגית ברורה צריך להיות מחוץ לעיבוד וכימות.</li>
</ol>4. תיקון ופירוק הסחף
הערה: בהתאם לאיכות התמונה, שני השלבים הם אופציונליים אך מומלצים מאוד.
<ol><li>פתח קובץ תמונה שנרכש עם תוכנת תיקון סחיפה. ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים כדי להתאים לאלה המשמשים לניסוי. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), לחץ על עריכה | ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים. קבע סוג מיקרוסקופ כשדה שטח עבור תמונות בשתי פוטון אם אין אפשרות לשני פוטונים ופעל בהתאם לזרימת העבודה המוגדרת על-ידי התוכנה. לדוגמה, פתח את הלשונית לפירוק | מייצב אובייקטובחר באפשרות ' ייצוב מסגרות זמן'.</li>
	<li>פתח את התמונה מתוקנת להיסחף בתוכנה לפירוק ובצע את זרימת העבודה שלה. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), בחר את התמונה הייצוב ולאחר מכן לחץ על פירוק | לפירוק האקספרס. כדי לקבל תוצאה טובה יותר, כוונן בצורה משופרת את הפרמטרים באמצעות אשף פירוק.</li>
	<li>שמור את התמונה לפירוק בסוג קובץ הנתמך על ידי התוכנה ביאור תמונה הבאים מסוגל לנתח נתונים 4D ודיווח על קואורדינטות מרחבית של נקודות מוגדרות בתמונה (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>5. ביאור תמונה
<ol><li>פתחו את התמונה לפירוק בתוכנת הביאור של התמונה. בדוק וסמן עצות בענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת הביאור של התמונה מדווחת ומאחסנת את הקואורדינטות המרחבית והטמפורלית של תיאורי הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ. csv לצורך חישובים עוקבים. הערה: שני השלבים הבאים הם ספציפיים לתוכנת הביאור בה השתמשנו (ראה טבלת חומרים). ייתכן שזרימת העבודה שונה עבור תוכנות אחרות.</li>
	<li>בתוך המודול ' נקודות ', לחץ על 'דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני' ובדוק את תיבת הסימון 'התחבר אוטומטית לספוט שנבחר' (איור 3א). עבור על המסגרות בסידרת הזמן ובחר ענף לביאור. החזק את המקש Shift ולחץ על קצה המסוף של ההסתעפות כדי להוסיף נקודה. לחץ על כל נקודות הזמן. הערה: תוכנת הביאור של התמונה מחברת בין הנקודות בין מסגרות ויוצרת מסלול באופן אוטומטי. המידע המרחבי והזמני של תיאורי הענף משויך כעת לנקודות מסומנות. חזור על שלבים אלה עד לקבלת כל תיאורי הסתעפות (איור 3ב).</li>
	<li>בתוך המודול ' נקודות ', לחצו על הכרטיסייה ' סטטיסטיקה ', בחרו באפשרות ' מפורט ' ובחרו ערכים ספציפיים | . בעמדהשלך מידע הקואורדינטות המרחבי והזמני המוקלט יוצג. לחץ על שמור בתחתית כדי לייצא מידע זה כקובץ Csv (איור 3ג).</li>
</ol>6. חישוב הענף הדנדריטים דינמיקה
הערה: באמצעות מידע הקואורדינטות, ניתן לחשב בקלות עקירה של עצות ההסתעפות ב-3D. במחקר שלנו, כל תנועות הענף הדנדריטי מסווגים כשלוחה או הנסיגה. השלבים שלהלן מתארים כיצד לעבד את קבצי ה-. csv באמצעות קבצי script מותאמים אישית של R (קובץ משלים) ועל-ידי הוספת המידע כווני באמצעות עריכה ידנית.
<ol><li>פתח את קובץ ה-. csv כגיליון אלקטרוני. בחרו בעמודת מזהה הרצועה , לחצו על האפשרות ' מיון קטן לגדול ביותר ' ולקבלת הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה הרצועה מזהה כל ענף דנדריטי ייחודי, וכתמים מאותו ענף חולקים את אותו מזהה רצועה. העמודה Time מאחסנת את המידע של מסגרות זמן שונות.</li>
	<li>בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק . חשב את המרחק של כל שני כתמים סמוכים באופן זמני באמצעות נקודות הציון שלהם ולשים את הערכים בעמודה המרחק (איור 4א).</li>
	<li>תנועות משניות ברמת voxel אחת. בהתבסס על הגדרות דימות, 0.3 יקרומטר הם בדרך כלל פריטים מתוך הביאור נסחף או ביאור תמונה לא מושלם. סנן תנועות אלה על-ידי איפוס ערכי המרחק הקטנים מ-0.3 יקרומטר ל-0. עבד קבצי. csv מרובים באופן ידני או השתמש בסינון עמודת ה-script של האצווה שלנו. R (קובץ משלים).</li>
	<li>צור באופן ידני עמודה חדשה בשם הזחה בגיליון האלקטרוני. העתק את הערכים מעמודת המרחק לעמודה הזחה . הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הארכה, השאר את ערך ההזחה ללא שינוי, שהוא ערך חיובי. אם זוהי הכחשה, שנה את ערך ההזחה המתאים לערך שלילי (לדוגמה, 0.35 to-0.35) (איור 4ב).</li>
	<li>צור עמודה חדשה בשם אירוע. בעמודה זו, סכם באופן ידני את ערכי ההזחה עבור אירועי הארכה והנסיגה הבודדים (איור 4ב).</li>
	<li>לעבד את הגיליון האלקטרוני שהשתנה ולכמת את הסיומת ואת אירועי הנסיגה בהתבסס על ערכי התזוזה שלהם באמצעות סיכום העמודה של האצווה הסקריפט. R (קובץ משלים). פרמטרי הפלט כוללים את מספר אירועי ההרחבה, מספר אירועי הנסיגה, אורך מצטבר מורחב, אורך מצטברושוב, אורך נטו השתנה, ואורך כולל נסע .</li>
</ol>

<ol><li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li>
<li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316(2010).</li>
<li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input%3A+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+visual+system%3A+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362(2018).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li>
<li>del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47(2011).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+optical+imaging+of+nervous+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387(2017).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66(2013).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Urbančič, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodyan%3A+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי להקליט ולכמת את ההתנהגות הדינמית של ענפים דנדריטים באופן אינדיבידואלי התווית נוירונים במוח זחל דרוסופילה . בעיקר, פרוטוקול ההדמיה החי שלנו מכיל פרמטרים ספציפיים שמאפשרים לנו ללכוד את כל הארבור הדנדריטי של זחל החוצה ולספק תצוגה גלובלית של המצב הדינמי של הענפים הדנדריטים שלה. עם זאת, בגלל שיטות הקוונציות שלנו מסתמכות בכבדות על הביאור של מסופי הענף, נוירונים עם מבנים דנדריטים מורכבים והארבורידים מרוכז אינם נושאים מתאימים לניתוח זה.
הכנה לדוגמה, רכישת ...

הדנדריטים הם תאי עצבים מיוחדים המקבלים ומעבדים את הקלט החושי והסינפטית. המבנה המורכב והסטרמוקליד של סוכת דנדריטי כבר תחת חקירה אינטנסיבית מאז גילויו. מספר מערכות מודל, כולל הנוירונים האופטיים tectal אופטי, בחורה ברשתית גנגליון תאים, ו arborization הדנדריטים (da) נוירונים במערכת Drosophila ילה , הוקמו כדי ללמוד את הפיתוח, שיפוץ ופלסטיות של . דנדריטים כפתונטים1,2,3,4 דרוזופילה ונטלי נוירונים לרוחב (lnvs) הם קבוצה של נוירונים הקרנה חזותית מזוהה בתחילה עבור הפונקציות החשובות שלהם בוויסות אחראי של התנהגויות לטוס5. מחקרים גם חשפו את התפקיד של זחל החוצה כיעד הפוסט-סינפטיות הישיר של הזחל הפוטוקטורים (PRs)6,7. חשוב לעשות זאת, כאשר מדובר בפיתוח זחלים במשטרים אור שונים, משפיע בחריפות על גודל הארבורס הדנדריטי, הממחיש את ההתאמה של אינvs כמודל חדש לחקר הפלסטיות הדנדריטי7. העבודה האחרונה מהקבוצה שלנו מצביעה עוד על כך שהגודל של הדנדריטים המורק וההתנהגות הדינמית של הענפים הדנדריטים מציגים הפלסטיות התלוי בחוויית החוויה8,9. כחלק מעבודה זו, פיתחנו הדמיה חדשה ופרוטוקול הקוונפיקציה לבצע ניתוח על הדינמיקה הדנדריטים של lnvsמ 2 או 3 הזחלים סינטסיומאיה.
האופי השקוף של מוח הזחל דרוזוהילה הופך אותו לאידיאלי להדמיה חיה. עם זאת, סוכת הדנדריטים של lnvs ממוקמים בצפיפות innervated זחל אופטית נוירופיל (LON) במרכז האונה המוח זחל6. כדי ללכוד את התמונות של ענפים דנדריטים בסדר הרקמה ברקמת המוח שלמים, אנו מנצלים שני פוטון מיקרוסקופ, אשר מגדיל את העומק של חדירה אור ומפחית את הרעילות במהלך ניסויים הדמיה חיה10. באמצעות התקנה זו, בוצע בהצלחה ניסויים הדמיה חיה על LNvs במשך 30 דקות בלי להתבונן הידרדרות מורפולוגית הברורה של העצב. בנוסף, מניפולציות גנטיות באמצעות הטכניקה להעיף החוצה איפשר לנו לתייג את האינvs הבודד עם קרום מתויג gfp, אשר גם קריטי לניטור התנועות של ענפים בודדים11,12,13 .
כדי ללכוד את ההתנהגות הדינמית של כל הענפים על הארבור הדנדריטי עם הרזולוציה האופטית האופטימלית, הצלחנו לבצע הדמיה תלת-ממדית על-ידי הדמייה מוחית של זחל טרי עם רזולוציה מרחבית גבוהה ב 1 דקות לכל מסגרת עבור 10 עד 30 דקות. פיתוח מידע דנדריטים הם דינמיים מאוד, עם אחוז גדול של ענפים המציגים שינויים הנצפה בתוך החלון 10 דקות. זה מוביל לאחד האתגרים הטכניים העיקריים של לימוד הדינמיקה של הדנדריטים, התנהגות הענף ככמת מבוסס על ערכות נתוני התמונה 4-d. שיטות שנקבעו בעבר יש מגבלות שונות, כולל חוסר דיוק ודרישות זמן מופרז. לכן, פיתחנו למחצה אוטומטי שיטה המשלבת עיבוד לאחר התמונה, סימון ידני של מסופי הסניפים, ו-4D אוטומטי העקיבה באמצעות תוכנה ביאור תמונה. אנו מחשבים את התנועות של מסופי הענף בנקודות זמן שונות המבוססות על קואורדינטות 3D של הנקודות. לאחר מכן הנתונים יוצאו ונותחו כדי לייצר מדידות כמותיים של דינמיקת הענף. שיטה זו מעריך במדויק את המשך וההיקף של אירועי הארכה והנסיגה של ענפים קיימים, כמו גם היווצרות של ענפים חדשים, ומאפשר לנו לנטר את הדינמיקה של הדנדריטים במספר רב של נוירונים.

<table><tbody><tr><td>זיקית Vision II לייזר מולטיפוטון</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td>79751-30</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 סריקת לייזר דו-פוטונית מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>קארל זייס</td><td></td><td>תצורה זקופה</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר מדעי</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר מדעי</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>לעיבוד קבצי .csv</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>לתיקון סחיפה ודה-קונבולוציה</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>להדמיה תלת מימדית והערת תמונה</td></tr><tr><td>< >ריאגנטים חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

מאוד מורצפת הדנדריטים הדנדרידיה נמצאים באופן נרחב בנוירונים בשלבים התפתחותיים מוקדם. הענפים הדינמיים הללו מדגימות את הסביבה ומפעילים אנשי קשר עם שותפים סינפטיים פוטנציאליים. למרות הקשר בין הדינמיקה של הענף הדנדריטי לבין synaptogenesis הוא מבוסס היטב, כיצד תהליכים התפתחותיים ותלויי פעילות לווסת את הדינמיקה ענף הדנדריטים אינו מובן היטב. זה בחלקו בשל הקשיים הטכניים הקשורים הדמיה חיה ניתוחים כמותיים של אלה מבנים בסדר באמצעות מערכת vivo. הקמנו שיטה לחקור את הדינמיקה של הדנדריטים באמצעות דרוסופילה זחל ונטולי לרוחב נוירונים (lnvs), אשר ניתן לתייג באופן אינדיבידואלי באמצעות גישות גנטיות ונגישים להדמיה חיה. ניצול של מערכת זו, פיתחנו פרוטוקולים כדי ללכוד את הדינמיקה הענף של הארבור הדנדריטים כולו של מסומן בודד באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה חי. לאחר מכן בוצעו לאחר עיבוד כדי לשפר את איכות התמונה באמצעות תיקון הסחף ופירוק, ואחריו ניתוח דינמיקת הענף ברמת הענף היחיד על ידי ביאור מיקומים מרחביים של כל מסופי הסניפים. לבסוף, פיתחנו R סקריפטים (קובץ משלים) ופרמטרים ספציפיים כדי לכמת את הענף דינמיקה באמצעות מידע הקואורדינטות שנוצר על ידי מעקב הטרמינל. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מאפשר לנו להשיג תיאור כמותי מפורט של הדינמיקה הענף של ארבור הדנדריטי העצבי עם הזמן הגבוה ורזולוציה מרחבית. השיטות שפיתחנו חלות בדרך כלל על נוירונים בעלי תוויות בדלילות הן בתוך מבחנה והן בתנאים vivo.

באמצעות פרוטוקול הדמיה חיה המתואר לעיל, אנו ללכוד ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה עבור ניתוחים וכימות הבאים. וידאו משלים 1 מראה את העוצמה המקסימלית מוקרן (mip) סדרת תמונה שנאסף נציג באופן אינדיבידואלי המסומן Lnv. איור 2B מציג את המיזוג המקביל של שמונה מסגרות של סדרת התמונות. בשני החלוניות, ראשי החצים מציינים אירועים וחיצים מציינים אירועי הרחבה.
לאחר מכן, אנו מבצעים מעק...

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

פרוטוקול זה מספק גישה חדשה לכימות דינמיקת הענפים של הארבור הדנדריטי ופיתוח נוירונים באמצעות הדמיה בזמן אמת ותופס ביאור תמונה תלת-ממדית. טכניקה זו מדמה ומעקב אחר מסופי הענף ומספקת שיטה מהירה ויעילה למדידת ההתנהגויות הדינמיות של פילופודיה דנדריטית. מחקר בשיטה זו מספק תובנה להבנת האופן שבו פיתוח ופעילות מווסתים את מורפוגנזה דנדריט.השיטות שלנו ישימות לנוירונים המסווים בדלילות הן בהגדרות הפריה והן בהגדרות ה-vivo. בעת ביצוע הליך זה, זכור כי יש להתאים את פרמטרי ההדמיה בקפידה כדי להשיג רזולוציה זמנית ומחזורית מספקת. כדי לקצור מוחות מדרוסופילה זחל, תחת מיקרוסקופ מנתח להשתמש בזוג אחד של מלקחיים ניתוח קצה סטנדרטי מספר חמש להחזיק דגימת זחל במקום תוך שימוש השני כדי לנתח בזהירות את המוח, שמירה על דיסקיות העין, אונות המוח, ואת חוט העצב הגחוני.לאחר מכן להסיר את השרירים המצורפים כדי למזער כל תנועה של המדגם במהלך הדמיה. כאשר כל המוחות נקצרו, השתמש בשומן ואקום כדי לצייר תא מרובע על מגלשת זכוכית ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חיצונית לתא. השתמש במקלפים כדי להעביר את המוח לתא ולהתאים את תנוחות המוח מתחת למיקרוסקופ כאשר הצדדים הגביים פונים כלפי מעלה.מכסים את התא עם להחליק כיסוי זכוכית ולחץ בעדינות על החלקת הכיסוי כדי להפחית את הדגימה נסחף במהלך הליך ההדמיה. כדי לזהות מפלי מוח המכילים נוירונים המסומן בנפרד, בתוך 30 דקות מהניתוח בחר מטרת טבילת מים פי 40 ומקור אור אפיפלואורסצנטי. בחר לייזר פוטון שני מכוון 920 ננומטר גלאי שאינו Dscan ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה כדי לאסוף את התמונות ב 512 על ידי 512 פיקסלים לכל מסגרת ודקה אחת לכל מחסנית Z במשך 10 דקות.לאחר מכן, התאימו את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציית X, Y, Z מספקת תוך הקפדה על הכיסוי של כל האילנות הדנדריטית תוך דקה אחת. ההגדרות ייצרו תמונות ברזולוציית X, Y, Z טיפוסית של 0.11 על 0.11 על 0.25 מיקרומטר. לתיקון להיסחף, לפתוח את הקובץ של עניין בתוכנית תיקון להיסחף מתאים ולחץ על עריכה ועריכה של פרמטרים מיקרוסקופיים.הגדר את סוג המיקרוסקופ לשדה רחב עבור שתי תמונות הפוטון אם קיימת אפשרות של שני פוטון ועקוב אחר זרימת העבודה שהוגדרה על-ידי התוכנה. עבור deconvolution, לפתוח את התמונה לתקן להיסחף בתוכנת deconvolution ופעל זרימת העבודה. לאחר מכן, שמרו את התמונה המפותלת בסוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ביאור התמונה הבאה המסוגלת לנתח נתוני 4D ולדווח על הקואורדינטות המרחביות של נקודות מוגדרות בתוך התמונה.לביאור תמונה, פתחו את התמונה המפותלת בתוכנת ביאור התמונה ובדקו וסמן את קצות הענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת ביאור התמונה תדווח ותאמחסן את הקואורדינטות המרחביות והתזהיות של קצות הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ CSV לחישובים הבאים.במודול כתמים, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני וסמן את תיבת הסימון התחבר אוטומטית לספוט שנבחר. סקור את המסגרות בסדרת הזמנים ובחר ענף לביאור. החזקת מקש Shift לחוץ, לחץ על קצה מסוף הענף כדי להוסיף נקודה.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה, בחר מפורט, ערכים ספציפיים ומיקום. המידע המתועד של קואורדינטות מרחביות וזמן יוצג. לחץ על שמור כדי לייצא את הנתונים כקובץ CSV.לחישוב מיקום תיאור הענף ב- 3D, פתחו את קובץ ה- CSV כגיליון אלקטרוני ובחרו בעמודה 'מזהה רצועה'. לחץ על מיין מהקטן ביותר לגדול ביותר וקבל את הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה רצועה יזהה כל ענף דנדריטי ייחודי והנקודות מאותו ענף חולקות את אותו מזהה רצועה.העמודה שעה תחסן את המידע ממסגרות זמן שונות.בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק ולהשתמש בקואורדינטות כדי לחשב את המרחק של כל שתי נקודות סמוכות זמנית. כדי למדוד תנועות משניות ברמת voxel בודדת, אפס את כל ערכי המרחק הקטנים מ- 0.3 מיקרומטר כדי לסנן כל ביאור תמונה לא מקובץ או לא מושלם. לאחר מכן, צור עמודת תזוזה והעתק את הערכים מהעמודה מרחק לעמודה תזוזה.הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הרחבה, השאר את ערך ההנעה החיובי ללא שינוי. אם זוהי נסיגה, שנה את ערך ההנעה המתאים לערך שלילי.לאחר מכן, בעמודת אירוע חדשה, סכם את ערכי ההנעה עבור אירועי הרחבה והתפטרות בודדים. בסרטון זה, ניתן לצפות בסדרת תמונות מוקרנת בעוצמה מרבית שנאספה מנציג המסוקרן בנפרד כנוירון גחוני. תמונות של מסגרת בודדת מאפשרות הערכה של אירועי הנסיגה וההרחבה.מעקב 4D Semiautomated של מסופי הענף מאפשר ביאור של מסופי הענף הדינמיים של נוירונים גחוניים המסומן בנפרד כמודגמים. חישוב הכיוון והמרחק של תנועות הענף בכל נקודת זמן מאפשר השוואה של דינמיקת הענף הדנדריטי לנוירונים גחונים המסווים בנפרד בשלבים התפתחותיים שונים. הצעד החשוב ביותר הוא שמירה על שלמות רקמת המוח ומורפולוגיה דנדריט במהלך ניתוח הרכבה.איכות סדרת התמונות הגולמיות היא גם קריטית למעקב וכמות מוצלחים. באמצעות טכניקה זו רכשנו את היכולת לבצע ניתוח כמותי של דנדריט פילופודיה בפיתוח נוירונים מרכזיים drosophila ולחקור את המכונות המולקולריות הקשורות התבגרות דנדריט ו synaptogenesis.

time-lapse-live-imaging-quantification-fast-dendritic-branch-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

מקור: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. הדמיית זמן-lapse של ארבוריזציה עצבית באמצעות תיוג דליל של וירוסים הקשורים לאדנו. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש דינמיקה דנדריטית בצמחי רשתית של עכבר חי. הוא מתאר את השלבים לייצוב הרשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ביצוע הדמיה אפיפלואורסצנטית כדי לדמיין אינטרנוירונים אמקריניים של התפרצות כוכבים, ולכידת תמונות תלת מימד בהילוך מהיר כדי לנטר שינויים במורפולוגיה דנדריטית אמקרינית.

הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

למד שיטה לכימות דינמיקת ענפים דנדריטיים בנוירונים מתפתחים של Drosophila באמצעות הדמיה חיה ותוכנת סימון תלת-ממדית. הפרוטוקול מאפשר מעקב אחר קצות הענפים ומספק תובנות לגבי מורפוגנזה דנדריטית.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

גלה סרטונים נוספים