ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

טכניקה זו מקלה על התצפית בזמן אמת של פעילות סידן סינפטית כ פרמטר פיזיולוגי לתהליכים התאיים שבבסיס היווצרות הלמידה והזיכרון במלנוגסטר דרוסופילה. על ידי השוואת תגובות עצביות לריחות לפני ואחרי אימון אסוציאטיבי, אנו יכולים לצייר קשרים ישירים בין פעילות סינפטית לבין היווצרות עקבות הזיכרון בזבובי פירות בודדים. כדי לייצר זבובי פירות מהונדסים שבהם נוירונים ספציפיים של עניין מבטאים מחוון סידן מקודד גנטית חוצה זבובים נקביים-בתוליים וזכריים הנושאים את המבנים הרצויים של GAL4 ו- UAS, ומזדקנים את צאצאי הנקבה עד שלושה עד שישה ימים לאחר האקלוסיה.

כדי להכין זבוב להדמיה, השתמש במטסים עדינים כדי למקם זבוב הרדמה קרח לתוך תא הדמיה מוכן בהתאמה אישית. שימוש במיקרוסקופ מנתח כדי למקם את בית החזה והרגליים במגע עם חוטי החשמל בתחתית התא, ועם הראש שוכב שטוח. לתקן את הזבוב במקום עם סרט דבק ברור, ולהשתמש בלהב אזמל כירורגי לחתוך חלון בקלטת סביב הראש, משאיר את האנטנה מכוסה ורק את החלק הקדמי ביותר של בית החזה חשוף.

השתמש סיכת חרק מוחזק על ידי לסתות קעורות כדי להקיף בזהירות את הצדדים ואת החלק האחורי של הראש עם דבק ריפוי אור כחול. ולהשתמש באור כחול פולט מנורת LED כדי להגדיר את הדבק. כאשר הדבק מוגדר לחלוטין, לנקות כל דבק שאריות ללא פגע מפני השטח הגביים של ראש הזבוב ולכסות את קוטיקל חשוף של הראש עם טיפה של הפתרון של רינגר.

באמצעות סכין דקירה עדין מאוד להב, לחתוך דרך cuticle על פני האחורי של הראש, החל ocelli וחיתוך כל צד מתווך לעיניים כדי ליצור דש של קוטיקל כי ניתן לקרוע בקלות באמצעות מדפים. הסר כל קוטיקל עודף שעלול לחסום את אזור המוח של עניין ולהשתמש מדחפים עדין כדי לנקות בזהירות את פני הגב של כל קנה הנשימה, דואג למנוע הפרעה של רקמת המוח עצמה. הסר ורענן את הפתרון של הצלצול לפי הצורך כדי לנקות את האזור של פסולת רקמות.

ולמקם מחט מסירת ריח hypodermic כ סנטימטר אחד מראש הזבוב, דואג אין שום דבר שיכול לחסום את מסירת ריח לאנטנה. לאחר מכן חבר את תא ההדמיה למערכת מסירת הריח באמצעות מחט מסירת הריח ההיפודרמי. ולאפשר לטוס 10 דקות להתאושש מההרדמה והניתוח.

להדמיה של מחווני הסידן מבוססי GFP, כווננו את הלייזר של מיקרוסקופ רב-פוטוני המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים המותקנת על שולחן מבודד רטט לאורך גל עירור של 920 ננומטר והתקינו מסנן פס GFP. באמצעות כפתור ההתאמה של Z כמובן, לסרוק דרך ציר Z של המוח כדי לאתר את אזור המוח של עניין. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה רק באזור העניין, כדי למזער את זמן הסריקה.

ולסובב את תצוגת הסריקה כך הקדמי של הראש פונה כלפי מטה. לאחר מכן התאימו את גודל המסגרת ל- 512 על 512 פיקסלים ובחרו את האזור לסריקה. אם לוקחים בחשבון את זמן הסריקה המחושב עבור כל מסגרת, כדי להשיג קצב מסגרות של לפחות ארבעה הרץ.

עבור הדמיה ארעית של סידן מעורר ריח, ליזום חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר את התוכנה לרכישת תמונה ואת תוכנית אספקת הריח ולהתחיל את המדידה בתוכנת המיקרוסקופ למשך 6.25 שניות כדי ליצור ערך בסיסי F0. במערכת אספקת הריח, לספק גירוי ריח 2.5 שניות המצוין כאן על ידי תאורה של LED מופעלות על ידי פתיחה וסגירה של שסתומי ריח ספציפיים. לאחר מכן 12.5 שניות של הקלטה בסוף היסט הריח.

לאחר מכן חזור על המשלוח עבור ריח שני ושלישי באותו אופן. כדי לבצע מיזוג אסוציאטיבי בהתקנה זו, השתמש במערכת אספקת הריח הנשלטת על-ידי המחשב כדי להציג את הגירוי המותנה בתוספת ריח למשך 60 שניות לצד 12 90 וולט חשמליים. לאחר הפסקה של 60 שניות, מציגים את הגירוי המותנה במינוס ריח לבדו למשך 60 שניות ללא הלם חשמלי.

למדוד את ריח לאחר אימון עורר ארעיות סידן שוב על ידי חזרה על פרוטוקול גירוי ריח טרום אימון שלוש דקות לאחר סיום שלב האימון. לאחר מכן שמרו את קבצי ההדמיה בתבנית המתאימה לניתוח תמונה מאוחר יותר. כאן ייצוגית גוף פטריות גוף תמונות נוירון, שנרכשו כפי שהודגם ניתן לראות.

הביטוי המואר הספציפי של חיישן dHomer-GCaMP3, אשר אינו בא לידי ביטוי בתאים האקסוניים של הנוירון, מדגים אות מנוקד בתא הדנדריטי. ברור אם כי תגובות ריח משרעת נמוכה ניתן לראות זבובים המבטאים dHomer-GCaMp3, לעומת זבובים המבטאים GCaMP6f ציטוסולי. כאן, עקבות סידן מייצגים טיסה בודדת אחת מדגימה שונות ברמת הרעש משרעת שניתן להשיג בין הכנות בודדות.

טכניקה זו פתחה את האפשרות של הדמיה ברמה התת-תאית, כיצד ייצוגי חוש הריח מאופננים וכיצד שלבים בזיכרון נוצרים באמצעות מיזוג. ניסויים כאלה יהיו חיוניים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של מבנים מוחיים מורכבים כגון גוף הפטריות, ולאפיין כיצד זיכרונות אסוציאטיביים מאוחסנים על פני אוכלוסיות מבוזרות של נוירונים.