Name: בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: למדו לבודד מיקרו-כלי דם ממערכת העצבים המרכזית בחולייתנים ליסנצפליים וגירנצפליים. שיטה זו מאפשרת השוואה אזורית ללא צורך באולטרה-סנטריפוגה או פירוק אנזימטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד ר קרוז-Orengo נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, בית הספר לרפואה וטרינרית להתחיל כספים.

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

Bbb כולל את המאפיינים הייחודיים של המוח מיקרוקובלטורה בתאי השלד בשילוב עם ארכיטקטורה מתוחכמת של הדוק, חסיד-, "יתד-שקע"-צמתים, ולוחיות הדבקה קריטי עבור הומאוסטזיס2,3,19. המאפיינים של תאים אנדותל הם המושרה ומתוחזק על ידי קרום הלב ואת התהליכים המקיפים את הרגל הקצה astroglia2,3,19. מיקרוטבקוטבלטורה BBB מציגה קוטביות (כלומר, תבנית ביטוי סימט...

המוח שלנו הוא האיבר. החשוב ביותר בגופנו מסיבה זו, שמירה על הומאוסטזיס המוח למרות גורמים חיצוניים שעלולים לעורר סטייה מנורמליות היא עדיפות. על פי כמה חוקרים, כ 400-500 מיליון שנה לפני1, בעלי חוליות פיתחו את מה שאנחנו יודעים כעת כמכשול הדם במוח (bbb)2,3. זה "גדר" המגן מפעילה את ההשפעה הגדולה ביותר על פני מערכת העצבים המרכזית (CN) הומאוסטזיס ופונקציות על ידי ויסות היטב את ההובלה של יונים, מולקולות, תאים בין דם לבין המערכת המרכזית של ה-CN. כאשר BBB מופרת, המוח הופך להיות פגיע חשיפה רעילה, זיהום, ודלקת. לפיכך, bbb בתפקוד משויך רבים, אם לא כולם, הפרעות נוירולוגיות התפתחותית נוירולוגית4,5,6.
הפונקציה המתוחכמת של bbb מיוחסת למערכת העצבים הייחודית של היחידה לנוירוכלי (nvu)2,3. תאים אנדותל מיוחדים מאוד, קרום הלב, ו astrocytic הרגליים הקצה הם הרכיבים הסלולריים של nvu2,3. מטריקס החילוץ שנוצר על ידי תאים אלה הוא גם חיוני הפיזיולוגיה של nvu ו bbb2,3. למרות שרכיבים סלולאריים ומולקולריים חיוניים של nvu נשמרים בין החוליות, טרוגניות מדווחת בקרב הזמנות ומינים7,8. עם זאת, מגבלות טכניות לעכב את היכולת שלנו לשקול באופן מלא את ההבדלים הללו בנוירוביולוגיה, ביו-רפואית, או מחקר הטרנסלבותית.
בגלל זה, הרחבנו את האזור בידוד מיקרוכלי ספציפי שיטה ספציפית כדי להפוך אותו לרלוונטי למינים רבים מכל חמשת קבוצות בעלי החוליות: דגים, דו-חיים, זוחלים, ציפורים ויונקים. הפרוטוקול מתואר לשימוש בחוליות lissencephalic קטנות וגדולות, כולל מינים עם רלוונטיות טרנסלתית9. בנוסף, אנו כוללים אזורים אחרים של ה-CN שאינם נחקרים לפני בהקשר זה, אלא רלוונטיים לנוירופיזיולוגיה ועם השלכות קליניות עצומות: ההיפותלמוס, יותרת המוח והחומר הלבן. לבסוף, בדקנו את היכולת של שיטת בידוד זו ככלי אמין כדי לזהות שינויים בביטוי החלבון לאורך nvu ו/או bbb9,10,11. כהוכחה למושג, הצגנו כיצד לקבוע שינויים בביטוי VCAM-1 ו-JAM-B במהלך השנה, תוך שימוש בשיטת הבידוד ולאחריה immunofluorescence.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>משמש לחסימה ודילול נוגדנים.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15713-S</td><td>משמש כקיבוע (4% PFA)</td></tr> <tr><td>70,000 MW Dextan</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>משמש לתמיסת MV-2</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11006-12</td><td>משמש להסרת שרירים ועור</td></tr><tr><td>Adson Ocps, איכות הסטודנט</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>זהה לאמור לעיל אך זול יותר</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>משמש לתמיסת MV-3, חסימה ומדלל נוגדנים</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu; מסננת תאים m</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m מסננת תאים</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג עבודת שולחן טיפים מחייבים נמוכים</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>זהה למטה אך זול יותר.</td></tr><tr><td>Cultrex פולי-D-ליזין</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>משמש לציפוי שקופיות</td></tr><tr><td>חמור נגד עיזים IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>חמור נגד חולדות IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>פיק רקמות דו-שיניים</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>משמש להסרת קרומי המוח ומקלעת הכורואיד</td></tr><tr><td>Dumont #3c מלקחיים</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>משמש לטיפול ברקמות CNS עדינות ו/או קטנות יותר (כמו יותרת המוח)</td></tr> <tr><td>Dumont #7 מלקחיים</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>משמש לדיסקציה וטיפול במערכת העצבים המרכזית</td></tr><tr><td>Dumont #7 מלקחיים, סטודנט</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>זהה לאמור לעיל אך זול יותר</td></tr><tr><td>EP Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>איכות טובה יותר מהטיפים לעיל (יקר יותר).</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד,</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>משוננים המשמשים להסרת עצם</td></tr><tr><td>מספריים עדינים, חד</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>משמש להסרת חזיר ושק דוראלי</td></tr><tr><td>שק זכוכית עלי זכוכית 1.5 מ"ל הומוגנייזר מטחנת רקמות צינור מיקרוצנטריפוגה, חבילה של 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>משמש להיפותלוס קטן ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>עיזים אנטי-CXCL12, ביוטינילציה</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ: 1:20.</td></tr><tr><td>עיזים נגד JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>עיזים נגד PDGFR ובטא;</td><td>מו"פ D</td><td>AF1042</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe, קצה מעוקל, 1X2 שיניים</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>השתמש להחזקת רשת מסנן ניילון וניעור</td></tr><tr><td>HBSS, מאגר 1X עם סידן ומגנזיום</td><td>קורנינג</td><td>21-022-CM</td><td>משמש לתמיסת MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, מאגר נוזלי 1M</td><td>קורנינג</td><td>25-060-CI</td><td>משמש לתמיסת MV-1</td></tr><tr><td>איזולקטין GS-IB4-ביוטין-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (תרמו)</td> <td>I21414</td><td>גליקופרוטאין מבודד מקטניות Griffonia simplicifolia הקושר שאריות D-galactosyl של תאי אנדותל glycocalysx. משמש למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עופות וחזירים. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>LaGrange מספריים, משוננים</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>משמשים לדיסקציה של גולגולת וכריתת למינקטומיה (למעט חזיר ומקוק)</td></tr> <tr><td>Millicell EZ slide 8-well unit</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של פרימטים. ריכוז מומלץ: 16.5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עכבר anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-&אלפא;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>ניילון מסנן נטו, גליל</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>לייזר חתוך לדיסקים נטו מסנן בקוטר 13 מ"מ. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>רשתות סינון ניילון, 25 מ"מ</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנות, למעט ההיפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>רשתות סינון ניילון, 47 מ"מ</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS, למעט היפותלמוס והיפופיזה.</td></tr><tr><td>מגיב אנטי-דהייה זהב ProLong עם DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>משמש לכיסוי שקופיות.</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>ארנב נגד LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>ארנב נגד OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 1 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>חולדה נגד CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עכברים. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>חולדה נגד GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.</td></tr><tr><td>חולדה נגד VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>תמיסת צלצול סטרילי, תאגיד צפרדע</td><td>אלדון</td><td>IS5066</td><td>משמש להרדמה אמפיבית</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים, חדים</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>משמשים להסרת שרירים ועור</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים, חדים-קהים</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>משמשים לעריפת ראש (למעט חזיר ומקוק)</td></tr> <tr><td>מחזיק מסנן Swinnex, 13 מ"מ</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>שונה על ידי חיתוך לייזר. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swinnex, 25 מ"מ</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>שונה בחיתוך לייזר. משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס ויותרת המוח. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swinnex, 47 מ"מ</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>שונה בחיתוך לייזר. משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>משמש לחסימה ודילול נוגדנים.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td><td>VWR (ספק DWK Life Sciences)</td> <td>62400-904 (DWK #903475)</td> <td>משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS עם מטחנת רקמות של 55 מ"ל, למעט היפותלמוס והיפופיזה.</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 10 מ"ל</td><td>VWR (ספק DWK Life Sciences)</td> <td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 55 מ"ל</td><td>VWR (ספק DWK Life Sciences)</td> <td>14231-372 (DWK #357994)</td> <td>משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס והיפופיזה.</td></tr></tbody></table>

בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

בידוד של כלי מיקרו ממערכת העצבים המרכזית (CN) מבוצע בדרך כלל על ידי שילוב של רקמה קורטיקלית מבעלי חיים מרובים, לרוב מכרסמים. גישה זו מגבילה את חקירת מחסום הדם-מוח (BBB) לקליפה ואינה מאפשרת השוואה אישית. פרויקט זה מתמקד בפיתוח של שיטת בידוד המאפשר השוואה של יחידת נוירונימי (NVU) מאזורים מרובים של ה-CN: קליפת המוח, המח האופטי, האונה האופטית, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח, בראש וחוט השדרה. יתר על כן, פרוטוקול זה, שפותחה במקור עבור דגימות murine, הותאם בהצלחה לשימוש ברקמות המוח מפני מינים קטנים וגדולים של בעלי חוליות שמהם אנו גם מסוגלים לבודד כלי מיקרו מתוך מערכת האונה הלבנה חומר לבן. שיטה זו, כאשר היא משויכת לאימונואולבלינג, מאפשרת כימות של ביטוי חלבונים והשוואה סטטיסטית בין אנשים, סוג רקמה או טיפול. הוכחנו את הישימות הזאת על ידי הערכת שינויים בביטוי החלבון במהלך הencephalomyelitis הנסיוני הניסיוני, מודל murine של מחלה נוירודלקתית, טרשת נפוצה. בנוסף, כלי מיקרו מבודדים על ידי שיטה זו ניתן להשתמש עבור יישומים במורד כמו qPCR, RNA-seq, ואת האבן המערבית, בין היתר. למרות שאין זה הניסיון הראשון לבודד את כלי המיקרו-מיקרו-משתמשים ללא שימוש בדיסוציאציה האוטרטית או אנזימטית, היא ייחודית באופן מיוחד להשוואת אנשים יחידים ולאזורי ה-CN המרובים. לפיכך, היא מאפשרת חקירה של מגוון של הבדלים שעשויים אחרת להישאר מעורפל: מנות CN (קליפת, המוח התחתון, האונה האופטית, גזע המוח, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת השדרה), סוג של רקמת CN (חומר אפור או לבן), אנשים, קבוצות טיפול ומינים ניסיוניים.

מיקרואוניות הראו את כל הרכיבים הסלולאריים. הפנימיים של יחידת נוירונימי2,3 שימוש באחת מהטסיות של תא הדבקה של מולקולה 1 ("פקאם", הידועה גם בשם CD31) או isolectin IB4 (גליקופרוטאין המחבר את הגליקקליום של תאי האנדותל) לתאי האנדותל, טסיות הגדילה הנגזרת הצמיחה-β (PDGFRβ) או תא העצב-glial אנטיגן 2 (NG2) עבור קרום הלב ו aqu in-4 (AQP4) עבור הקצה של הרגליים astrocytic (איור 3a, B) ממחיש כי רכי...

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את כלי המיקרו מאזורים מרובים של מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות lissencephalic וגירנאריים.

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר השוואה של microvasculature בין אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית, כמו גם בין אנשים שונים. טכניקת בידוד microvessel זה ניתן להשלים בתוך יום אחד, וזה מבטל את הצורך אולטרהצנטריות דיסוציאציה אנזימטית. הסרת קרום המתים ואת מקלעת choroid יכול להיות קשה.הקפד לעבוד לאט ובזהירות כדי להבטיח הסרה מלאה של כל רקמה. עבור ניתוח רקמת מערכת העצבים המרכזית מדגימה קטנה של בעלי חוליות lissencephalic, למקם את המוח שנקטף לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל פתרון MV-1 על קרח, ולהשתמש במלקחיים כדי לאחזר את בלוטת יותרת המוח מן sella turcica של הגולגולת. מניחים את בלוטת יותרת המוח בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר של פתרון MV-1 על קרח, ולהסיר את העור והשרירים כדי לחשוף את עמוד החוליות.לאחר הסרת הגפיים, בית החזה והאיברים הפנימיים, השתמש במזרק 10 מיליליטר המצויד במחט 18 מד כדי לשטוף את עמוד החוליות עם פתרון MV-1 טרי, בכיוון caudal-to-rostral ברחבי אבות החוליות המותניים. לאחר מכן מניחים את חוט השדרה בצינור 5 מיליליטר המכיל פתרון MV-1 טרי. לאחר מכן, מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולהסיר את קרום המוח עם שמוק כפול שיניים.הקפד לבדוק את חוט השדרה כדי לוודא כי לא חתיכות של קרום המוח נשארים. השתמש במקלות כדי להפריד את ההיפותלמוס, המוח הקטן, גזע המוח וקליפת המוח. בעת הצורך, השתמש מלקחיים ואיריס ומספריים באביב כדי להוציא את נורות הריח ואת התלמוס, ולהשתמש שמוק כפול שיניים כדי להסיר את כל מקלעת choroid מכל חדרי המוח.עבור ניתוח רקמת מערכת העצבים המרכזית מדגימה גדולה של בעלי חוליות gyrencephalic, השתמש במיקרוסקופ מנתח ושמוק כפול שיניים, מלקחיים ומספריים איריס וקפיץ כדי להסיר את קרום המוח מכל רקמת מערכת העצבים המרכזית, דואג להסיר את כל חתיכות מקלעת choroid מאבי המוח. עבור הומוגניזציה של רקמות CNS שנקטפו, טחון כל אזור CNS לחתיכות אחד עד שני מילימטר בתוך מנות פטרי בודדות. כדי הומוגניזציה רקמות מערכת העצבים המרכזית מדגימות חוליות קטנות, להשתמש פיפטה העברה להוסיף מיליליטר אחד של פתרון MV-1 להשעות את הרקמה הטחון.לאחר מכן השתמש באותה פיפטה העברה כדי לוותר על קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית, וחוט השדרה חתיכות לתוך בודדים 10 מיליליטר רקמת זכוכית מטחנות, ולהשתמש עלה PTFE וחמישה מיליליטר של פתרון MV-1 לטחון כל קבוצה של רקמות במשך כ 10 משיכות. להעביר כל תרחיף רקמה לתוך צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר על קרח, ולהשתמש במקלפים כדי למקם את ההיפותלמוס ואת בלוטת יותרת המוח ב 100 microliters של פתרון MV-1, בצינורות בודדים 1.7 מיליליטר. לאחר מכן, בזהירות הומוגניזציה כל רקמה עם micropestle זכוכית.כדי להומוגניזציה של דגימת חוליות גדולה, השתמשו בפיפיט העברה משופע לחתוך כדי להעביר את הרקמה הטחונים למטחנת רקמת זכוכית 55 מיליליטר, ולחבר את המטחנה לערבב תקורה. הוסף מחצית מהנפח המומלץ של פתרון MV-1 בהתאם לחלק הספציפי של CNS להיות הומוגני כפי שצוין בטבלה, ולהדליק את stirrer תקורה כ 150 סיבובים לדקה. בזהירות להזיז את צינור הזכוכית למעלה ולמטה במשך כ 30 שניות לפני כיבוי stirrer תקורה להוסיף פתרון MV-1 יותר עבור הומוגניזציה נוספת, עד תרחיף הומוגני מתקבל.ואז להעביר את הרקמה הומוגנית לצינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. עבור טיהור microvessel, גלולה רקמת ה-CNS homogenates על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את supernatants. לבידוד מיקרוווסל חוליות קטן, פיפטה קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית וכדורי חוט השדרה, בחמישה מיליליטר של פתרון MV-2 טרי וקר כקרח לכל מדגם, בערך 10 פעמים, לפני הוספת חמישה מיליליטר נוספים של פתרון MV-2 קר כקרח לכל צינור.בזהירות להפוך את הצינורות לערבב, ולהשעות מחדש את ההיפותלמוס כדורי יותרת המוח במיליליטר אחד של פתרון MV-2. לבידוד מיקרו-אווסל גדול של דגימת חוליות, הוסיפו 20 מיליליטר של פתרון MV-2 קר כקרח לקליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וכדורי המיקרו-אווסל של חוט השדרה, והשעו מחדש את כדורי האקדח באקדח צינור ב-40 סיבובים לדקה למשך כ-5 דקות. בסוף ההשעיה מחדש, להפריד את רקמת מערכת העצבים המרכזית lycates על ידי צנטריפוגה, ולאט לאט לסובב כל צינור כדי לאפשר supernatant לעבור לאורך הקיר כדי לנתק בזהירות את שכבת מירלין עבה וצפוף על ממשק נוזלי מקירות הצינור.השליכו את הממשקים המאלין והנוזלים, ומחקו את הקיר הפנימי של כל צינור עם מרית עטופה בניגוב נייר עם מוך נמוך. לאחר מכן, השתמשו בניגוב נייר מעוות עם מוך נמוך כדי לספוג נוזלים עודפים, ולהשתמש בטיפים בעלי כריכה נמוכה כדי להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון MV-3. עבור אלוט וסינון microvessel, לערבב כמה מיליליטר של פתרון MV-3 טרי לכל תרחיף microvessel רקמת מערכת העצבים המרכזית, ותוך ערבוב כדי למנוע אגרגטים, מסננים כל השעיה דרך מסננת פרואיט לתוך צינורות חרוט בודדים 50 מיליליטר.מקם מסנן רשת ניילון אחד של 20 מיקרומטר על מחזיק מסנן אחד שהשתנה לכל אזור של רשת העצבים המרכזית. מעבירים את מחזיק המסנן לצינור חרוט 50 מיליליטר, ומרטיבים את המסנן עם חמישה מיליליטר של פתרון MV-3 קר כקרח, מוודאים שהמאגר שופך את מחזיק המסנן, לתוך הצינור חרוט. מעבירים את המיקרו-אווסלים האלמותיים לכל מסנן רשת ניילון 20 מיקרומטר, ושטיפת המיקרו-אווסלים עם 5 עד 10 מיליליטר של תותב MV-3 קר כקרח.השתמש במלקחיים כדי להעביר כל מסנן לתוך מקורים בודדים המכילים את פתרון MV-3 קר כקרח, בעדינות לנער כל מסנן במשך כ 30 שניות כדי לנתק את microvessels. לאחר המעבר לצינור חרוט 15 מיליליטר, לאסוף את microvessels על ידי צנטריפוגה, ולהשתמש פיפטה כריכה נמוכה להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון MV-3 קר כקרח. לאחר מכן, להעביר מתלים microvessel מדגימות חוליות קטנות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר עבור צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 20, 000 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס.עבור דגימות חוליות גדולות, להעביר את ההשעיה לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים חמישה מיליליטר, ולהוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון MV-3 עבור צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. המרכיבים המהותיים של היחידה הנוירו-וסקולרית יכולים להיות מזוהים בתוך מיקרו-ווסלים, מבודדים כפי שהוכח, על ידי אימונולאבלינג עבור CD31, PDGFR-beta ו- aquaporin ארבע, כולל קליפת המוח, המוח הקטן, יותרת המוח, ההיפותלמוס, גזע המוח ומיקרוסלים של עמוד השדרה. כמו כן, הביטוי של חלבון צומת דבקים VE-cadherin, חלבונים צומת הדוק CLDN5 ו Zonula Occludens-1, אנגולין חלבון צומת tricellular, ו סימונים בזלית כימוקין ליגנד CXCL מוטיב 12, ו גמא-גלוטמילטרנספראז-1, ניתן לדמיין.יתר על כן, רוב microvessels הם נטולי הביטוי של אלפא חלקה שריר actin, המציין כי פרוטוקול בידוד זה באופן סלקטיבי מטרות microvessels קליבר קטן. מיקרובסלים המתקבלים מחולייתנים קטנים אחרים, כמו ציפור, שקרן, צפרדע ודגים, חולקים כמה תכונות מורפולוגיות, מה שמרמז כי שיטה זו שימושית לאפיון נוסף של הבדלים ביחידות נוירו-וסקולריות בין מינים. כימות השינויים בביטוי החלבון חושף עלייה במולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1, ומולקולת הידבקות צומתאלית B לאורך microvessels חוט השדרה, במהלך השיא של אנצפומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית.עם זאת, מולקולת הידבקות בתאי כלי הדם אחד הוא גם גדל באופן משמעותי microvessels יותרת המוח, וירידה ההיפותלמוס ואת microvessels גזע המוח. בנוסף, שינויים נצפים במולקולת הידבקות בתאי כלי הדם ביטוי אחד במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית כרונית בכל רקמות מערכת העצבים המרכזית, ובמולקולת הידבקות צומת B ביטוי ההיפותלמוס ומיקרו-אווסלים יותרת המוח. ניתוחים כמותיים, כגון כתם מערבי, PCR ואימונוהיסטוכימיה, יכולים להתבצע בעקבות הליך זה כדי לחשוף תובנות על דפוסי ביטוי גנים וחלבונים בתוך מחסום הדם - מוח.Paraformaldehyde הוא ריאה רעילה בחריפות, ותמיד צריך להיות מטופל תחת מכסה המנוע אדים תוך לבישת PPE הנכון.

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים בידוד של כלי דם שלמים ממוחו של עכבר המהווים את מחסום הדם-מוח (BBB) יחד עם תאי עצב ותאי גלייה. כלי הדם המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה כדי לחקור את תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס מוחי.

בידוד כלי דם במוח של עכבר: פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים מדגימת מוח מורין

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד כלי הדם במוח מחולדות שעברו המתת חסד. הוא כולל דיסקציה של המוח, ניקוי הרקמה, ועיכול מכני, ואחריו צנטריפוגה חוזרת ונשנית כדי לבודד את החלק הטהור של microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור לבידוד של עורקים תוך-מוחיים (קבוצת כלי דם הכוללת עורקים פרנכימליים, עורקים חודרים ועורקים קדם-נימיים) מעכברים, לשימוש במיוגרפיה בלחץ, אימונופלואורסצנטי, ביוכימיה ומחקרים מולקולריים.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

למדו לבודד מיקרו-כלי דם ממערכת העצבים המרכזית בחולייתנים ליסנצפליים וגירנצפליים. שיטה זו מאפשרת השוואה אזורית ללא צורך באולטרה-סנטריפוגה או פירוק אנזימטי.

בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

גלה סרטונים נוספים