בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר השוואה של microvasculature בין אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית, כמו גם בין אנשים שונים. טכניקת בידוד microvessel זה ניתן להשלים בתוך יום אחד, וזה מבטל את הצורך אולטרהצנטריות דיסוציאציה אנזימטית. הסרת קרום המתים ואת מקלעת choroid יכול להיות קשה.

הקפד לעבוד לאט ובזהירות כדי להבטיח הסרה מלאה של כל רקמה. עבור ניתוח רקמת מערכת העצבים המרכזית מדגימה קטנה של בעלי חוליות lissencephalic, למקם את המוח שנקטף לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל פתרון MV-1 על קרח, ולהשתמש במלקחיים כדי לאחזר את בלוטת יותרת המוח מן sella turcica של הגולגולת. מניחים את בלוטת יותרת המוח בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר של פתרון MV-1 על קרח, ולהסיר את העור והשרירים כדי לחשוף את עמוד החוליות.

לאחר הסרת הגפיים, בית החזה והאיברים הפנימיים, השתמש במזרק 10 מיליליטר המצויד במחט 18 מד כדי לשטוף את עמוד החוליות עם פתרון MV-1 טרי, בכיוון caudal-to-rostral ברחבי אבות החוליות המותניים. לאחר מכן מניחים את חוט השדרה בצינור 5 מיליליטר המכיל פתרון MV-1 טרי. לאחר מכן, מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולהסיר את קרום המוח עם שמוק כפול שיניים.

הקפד לבדוק את חוט השדרה כדי לוודא כי לא חתיכות של קרום המוח נשארים. השתמש במקלות כדי להפריד את ההיפותלמוס, המוח הקטן, גזע המוח וקליפת המוח. בעת הצורך, השתמש מלקחיים ואיריס ומספריים באביב כדי להוציא את נורות הריח ואת התלמוס, ולהשתמש שמוק כפול שיניים כדי להסיר את כל מקלעת choroid מכל חדרי המוח.

עבור ניתוח רקמת מערכת העצבים המרכזית מדגימה גדולה של בעלי חוליות gyrencephalic, השתמש במיקרוסקופ מנתח ושמוק כפול שיניים, מלקחיים ומספריים איריס וקפיץ כדי להסיר את קרום המוח מכל רקמת מערכת העצבים המרכזית, דואג להסיר את כל חתיכות מקלעת choroid מאבי המוח. עבור הומוגניזציה של רקמות CNS שנקטפו, טחון כל אזור CNS לחתיכות אחד עד שני מילימטר בתוך מנות פטרי בודדות. כדי הומוגניזציה רקמות מערכת העצבים המרכזית מדגימות חוליות קטנות, להשתמש פיפטה העברה להוסיף מיליליטר אחד של פתרון MV-1 להשעות את הרקמה הטחון.

לאחר מכן השתמש באותה פיפטה העברה כדי לוותר על קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית, וחוט השדרה חתיכות לתוך בודדים 10 מיליליטר רקמת זכוכית מטחנות, ולהשתמש עלה PTFE וחמישה מיליליטר של פתרון MV-1 לטחון כל קבוצה של רקמות במשך כ 10 משיכות. להעביר כל תרחיף רקמה לתוך צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר על קרח, ולהשתמש במקלפים כדי למקם את ההיפותלמוס ואת בלוטת יותרת המוח ב 100 microliters של פתרון MV-1, בצינורות בודדים 1.7 מיליליטר. לאחר מכן, בזהירות הומוגניזציה כל רקמה עם micropestle זכוכית.

כדי להומוגניזציה של דגימת חוליות גדולה, השתמשו בפיפיט העברה משופע לחתוך כדי להעביר את הרקמה הטחונים למטחנת רקמת זכוכית 55 מיליליטר, ולחבר את המטחנה לערבב תקורה. הוסף מחצית מהנפח המומלץ של פתרון MV-1 בהתאם לחלק הספציפי של CNS להיות הומוגני כפי שצוין בטבלה, ולהדליק את stirrer תקורה כ 150 סיבובים לדקה. בזהירות להזיז את צינור הזכוכית למעלה ולמטה במשך כ 30 שניות לפני כיבוי stirrer תקורה להוסיף פתרון MV-1 יותר עבור הומוגניזציה נוספת, עד תרחיף הומוגני מתקבל.

ואז להעביר את הרקמה הומוגנית לצינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. עבור טיהור microvessel, גלולה רקמת ה-CNS homogenates על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את supernatants. לבידוד מיקרוווסל חוליות קטן, פיפטה קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית וכדורי חוט השדרה, בחמישה מיליליטר של פתרון MV-2 טרי וקר כקרח לכל מדגם, בערך 10 פעמים, לפני הוספת חמישה מיליליטר נוספים של פתרון MV-2 קר כקרח לכל צינור.

בזהירות להפוך את הצינורות לערבב, ולהשעות מחדש את ההיפותלמוס כדורי יותרת המוח במיליליטר אחד של פתרון MV-2. לבידוד מיקרו-אווסל גדול של דגימת חוליות, הוסיפו 20 מיליליטר של פתרון MV-2 קר כקרח לקליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וכדורי המיקרו-אווסל של חוט השדרה, והשעו מחדש את כדורי האקדח באקדח צינור ב-40 סיבובים לדקה למשך כ-5 דקות. בסוף ההשעיה מחדש, להפריד את רקמת מערכת העצבים המרכזית lycates על ידי צנטריפוגה, ולאט לאט לסובב כל צינור כדי לאפשר supernatant לעבור לאורך הקיר כדי לנתק בזהירות את שכבת מירלין עבה וצפוף על ממשק נוזלי מקירות הצינור.

השליכו את הממשקים המאלין והנוזלים, ומחקו את הקיר הפנימי של כל צינור עם מרית עטופה בניגוב נייר עם מוך נמוך. לאחר מכן, השתמשו בניגוב נייר מעוות עם מוך נמוך כדי לספוג נוזלים עודפים, ולהשתמש בטיפים בעלי כריכה נמוכה כדי להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון MV-3. עבור אלוט וסינון microvessel, לערבב כמה מיליליטר של פתרון MV-3 טרי לכל תרחיף microvessel רקמת מערכת העצבים המרכזית, ותוך ערבוב כדי למנוע אגרגטים, מסננים כל השעיה דרך מסננת פרואיט לתוך צינורות חרוט בודדים 50 מיליליטר.

מקם מסנן רשת ניילון אחד של 20 מיקרומטר על מחזיק מסנן אחד שהשתנה לכל אזור של רשת העצבים המרכזית. מעבירים את מחזיק המסנן לצינור חרוט 50 מיליליטר, ומרטיבים את המסנן עם חמישה מיליליטר של פתרון MV-3 קר כקרח, מוודאים שהמאגר שופך את מחזיק המסנן, לתוך הצינור חרוט. מעבירים את המיקרו-אווסלים האלמותיים לכל מסנן רשת ניילון 20 מיקרומטר, ושטיפת המיקרו-אווסלים עם 5 עד 10 מיליליטר של תותב MV-3 קר כקרח.

השתמש במלקחיים כדי להעביר כל מסנן לתוך מקורים בודדים המכילים את פתרון MV-3 קר כקרח, בעדינות לנער כל מסנן במשך כ 30 שניות כדי לנתק את microvessels. לאחר המעבר לצינור חרוט 15 מיליליטר, לאסוף את microvessels על ידי צנטריפוגה, ולהשתמש פיפטה כריכה נמוכה להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון MV-3 קר כקרח. לאחר מכן, להעביר מתלים microvessel מדגימות חוליות קטנות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר עבור צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 20, 000 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס.

עבור דגימות חוליות גדולות, להעביר את ההשעיה לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים חמישה מיליליטר, ולהוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון MV-3 עבור צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. המרכיבים המהותיים של היחידה הנוירו-וסקולרית יכולים להיות מזוהים בתוך מיקרו-ווסלים, מבודדים כפי שהוכח, על ידי אימונולאבלינג עבור CD31, PDGFR-beta ו- aquaporin ארבע, כולל קליפת המוח, המוח הקטן, יותרת המוח, ההיפותלמוס, גזע המוח ומיקרוסלים של עמוד השדרה. כמו כן, הביטוי של חלבון צומת דבקים VE-cadherin, חלבונים צומת הדוק CLDN5 ו Zonula Occludens-1, אנגולין חלבון צומת tricellular, ו סימונים בזלית כימוקין ליגנד CXCL מוטיב 12, ו גמא-גלוטמילטרנספראז-1, ניתן לדמיין.

יתר על כן, רוב microvessels הם נטולי הביטוי של אלפא חלקה שריר actin, המציין כי פרוטוקול בידוד זה באופן סלקטיבי מטרות microvessels קליבר קטן. מיקרובסלים המתקבלים מחולייתנים קטנים אחרים, כמו ציפור, שקרן, צפרדע ודגים, חולקים כמה תכונות מורפולוגיות, מה שמרמז כי שיטה זו שימושית לאפיון נוסף של הבדלים ביחידות נוירו-וסקולריות בין מינים. כימות השינויים בביטוי החלבון חושף עלייה במולקולת הידבקות תאי כלי הדם 1, ומולקולת הידבקות צומתאלית B לאורך microvessels חוט השדרה, במהלך השיא של אנצפומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית.

עם זאת, מולקולת הידבקות בתאי כלי הדם אחד הוא גם גדל באופן משמעותי microvessels יותרת המוח, וירידה ההיפותלמוס ואת microvessels גזע המוח. בנוסף, שינויים נצפים במולקולת הידבקות בתאי כלי הדם ביטוי אחד במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית כרונית בכל רקמות מערכת העצבים המרכזית, ובמולקולת הידבקות צומת B ביטוי ההיפותלמוס ומיקרו-אווסלים יותרת המוח. ניתוחים כמותיים, כגון כתם מערבי, PCR ואימונוהיסטוכימיה, יכולים להתבצע בעקבות הליך זה כדי לחשוף תובנות על דפוסי ביטוי גנים וחלבונים בתוך מחסום הדם - מוח.

Paraformaldehyde הוא ריאה רעילה בחריפות, ותמיד צריך להיות מטופל תחת מכסה המנוע אדים תוך לבישת PPE הנכון.