Name: שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו שיטה לשורש עגבניות המרה וחיסון ב-Ralstonia solanacearum לניתוח גנטי של מחלת וילט חיידקי. הפרוטוקול מאפשר מחקר מהיר בפתולוגיית צמחים עם ציוד מינימלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי המעבדה של המעבדה המאצ לדיונים מועילים, אלווארו לופז-גרסיה לייעוץ סטטיסטי, ולקסיג'יו ג'יאן לסיוע טכני ומנהלי במהלך עבודה זו. אנו מודים PSC Cell ביולוגיה מתקן הליבה לסיוע עם הדמיה פלואורסצנטית עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר עדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (גרנט XDB27040204), מרכז שנגחאי עבור ביולוגיה לחץ הצמח (סינית האקדמיה למדעים ותוכנית הכשרונות הסינית 1000.

הערה: חלקים חשובים של שיטה זו כרוכים בטיפול בחומרים צמחיים, ולכן חשוב לשמור על התנאים הסטריליים במהלך כל ההליכים הללו, כולל ההדמיה של הקרינה הפלואורסצנטית של Dsred . במהלך כל תהליך השינוי, שתילי עגבניות לגדול ב 25-28 ° צ' ו 16 h/8 h אור/כהה (130 μm בפוטונים מ-2s-1 אור). הצלחות חתומות בסרט מיקרונקבוביות כדי להקל על החלפת הדלק והדיות.
1. הכנת צמחי עגבניות ואגרואכטריום
<ol><li>לחטא זרעי עגבניות (Solanum lycopersicum Cv. MONEYMAKER, LA2706, עגבניה מרכז משאבים, TGRC) עם 5% (v/v) היפוכלוריט נתרן עבור 5 דקות. לשטוף 4-5 פעמים עם מים סטרילי מזוקקים ולשמור את הזרעים לרעוד לאט במים סטרילי לאורך הלילה כדי להקל על נביטה.</li>
	<li>להעביר את זרעי עגבניות מורראשיג בחצי כוח ו Skoog (1/2 MS) בינונית ללא סוכרוז (2.21 g/L MS, 8% w/v אגר). שמרו את הזרעים בחשיכה ב -25 עד 28 ° צ' במשך שלושה ימים (איור 1א). הערה: סביב 40 הזרעים נדרשים בדרך כלל עבור כל מבנה.</li>
	<li>אוטוקלב 8.5 ס מ2 מסנן משבצת מסמכים. מניחים את הניירות מסנן ריבוע בתוך 9 ס מ2 מנות פטרי מרובע המכיל 1/2 MS בינונית (במקום את הנייר על גבי אגר) ובמקום שש זרעי עגבניות מונבטים על כל צלחת (איור 1B). לאטום את הצלחת עם סרט מיקרונקבוביות ו מודקת את הזרעים מונבטים ב 25-28 ° c עבור 3 לארבעה ימים.</li>
	<li>גדל Agrobacterium MSU440 בינונית LB מוצק (עם אנטיביוטיקה המתאים) ב 28 ° c יומיים לפני שינוי הצמח. הערה: מסופק על ידי ד ר חואן אנטוניו לופז RÁEZ, EEZ-Csic, גרנדה, ספרד. בניסוי המתואר במאמר זה, שימשו את הpK7GWIWG2_II-RedRoot:: CESA6 או וקטור ריק, כפקד, בשימוש. pK7GWIWG2_II-RedRoot מכיל גן עיתונאי, Dsred, מונע על ידי האריידרופסיס thaliana היזם (pAtUBQ10), ו לדון התנגדות Spectinomycin (50 μg/mL). ניתן להשתמש בווקטורים אחרים להבעת גנים, כפי שדווח לפני5. בעבודה זו, הגברה של הקטע הספציפי עבור SlCESA6 השתקה הושגה על ידי שעתוק הפוכה (RT) PCR באמצעות RNA מבודדים מעגבניות (S. Lycopersicum cv. moneymaker) ו להכניס לתוך p-ENTR/D-topo וקטור (שולחן 1). לאחר מכן, המקטע SlCESA6-RNAi שוכפל בווקטור הבינארי של PK7GWIWG2_II-RedRoot.</li>
</ol>2. התמרת ובחירת צמחים
<ol><li>באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את הרדילה ואת החלק התחתון של ההיפוטיל של שתילי עגבניות (איור 1ג, ד).</li>
	<li>בציר A. ריזוזוגנים ביומסה מפני השטח של מדיום LB באמצעות עצות פלסטיק או להב אזמל ולטבול בזהירות את שתילי עגבניות לחתוך ביומסה חיידקי (איור 1E).</li>
	<li>לאחר החיסון עם . ריזוזוגנס, כסו את שתילי העגבניות בנייר מעגלי בגודל 2 ס"מ וחצי עגול (איור 1F), על מנת לשמור על לחות גבוהה ולהקל על ההישרדות ופיתוח השורש החדש.</li>
	<li>לאחסן את שתילי העגבניות השתנו במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את השורשים המתעוררים החדשים (איור 1G, H; בשלב זה, השורשים אינם משתנים עדיין) ולאפשר לשתילים לייצר שורשים חדשים שעירים.</li>
	<li>לאחר הדור השני של השורשים השעירים החדשים מופיעים (איור 1I), להסיר את נייר הסינון על גבי השתילים, ולחתום את הצלחת עם קלטת מיקרונקבובית שוב. הערה: בשלב זה, הנוכחות של סמן הפלורסנט DsRed בווקטור השינוי מאפשרת להמחיש את יעילות השינוי בשורשים החדשים.</li>
	<li>כדי להמחיש את הקרינה הפלואורסצנטית האדום, השתמש stereomicroscope או כל ציוד אחר עבור המפעל vivo הדמיה (איור 1J). סמן את חיובי (פלואורסצנטית אדום) הופך שורשים ולהסיר את השורשים הלא משתנה שלילית (אין זריחה אדומה) באמצעות אזמל סטרילי.</li>
	<li>להעביר את השתילים מראה פלואורסצנטית אדום לצלחת חדשה המכילה 1/2 MS בינונית, כדי להקל על פיתוח של השורש ההפוך כמו השורש הראשי (איור 1K). שמור את השתילים שאינם מראים ניאון אדום באותה צלחת כדי לבדוק את הופעתה של שורשי פלורסנט (איור 1L) בנקודות זמן מאוחרות יותר.</li>
	<li>שיטה חלופית המבוססת על בחירה אנטיביוטית<ol>
<li>חלופה לשלב 2.5, להכין חצי מלא9 ס מ לוחיות הריבוע המכיל 1/2 MS בינוני עם אנטיביוטיקה המתאים. שיפוע לוחות כ 5 ° במהלך תהליך ההכנה כדי ליצור חלל ריק ללא בינונית (איור 2א), המאפשר נצרי לצמוח להימנע ממגע עם אנטיביוטיקה.</li>
		<li>חלופה לשלב 2.6, לאחר חיתוך השורשים השעיר הראשון שאינו שינוי התפתחה (שלב 2.4), להעביר את השתילים ללא שורשים הצלחות חצי מלא באמצעות ניירות מסנן עם הגודל המתאים (איור 2B). הערה: בתור שליטה חיובית, מומלץ להפוך מספר שתילים עם פלסטלינה המכיל את העמידות לאנטיביוטיקה זהה גן עיתונאי (בפרוטוקול זה, pK7GWIWG2_II-RedRoot; כולל 50 μg/mL).</li>
		<li>חלופה לשלב 2.7, לתת לשתילים לפתח שורשים שעירים חדשים ולגזור אלה שורשים שאינם במגע ישיר עם פני השטח של מסנן סנדוויץ הניירות, מאז שורשים אלה יכולים להימנע בחירה אנטיביוטית. הערה: בשל אפקט האנטיביוטיקה, פיתוח השורש עשוי להיות איטי יותר מאשר בצלחות ללא אנטיביוטיקה. שורשים שעירים חדשים מופיעים בתוך 14 עד 18 ימים לאחר העברת השתילים ללא שורשים ללוחות חצי מלאים (שלב 2.8.2) (איור 2ג-ה).</li>
	</ol></li>
	<li>מכסים את השתילים עם נייר 2 ס"מ x 4 ס מ מסנן לחצי עיגול, לאטום את הצלחת ואת השתילים שתילים לתת להם לפתח שורשים חדשים שעירים. הערה: אין צורך לחסל את הא. ריזוזוגנים באמצעות אנטיביוטיקה. נייר הסינון על גבי המדיום הטרשת הנפוצה והיעדר הסוכות מעכבים את התפשטות החלק העליון של מבנה ה-"לוחית 5".</li>
	<li>חמישה עד שבעה ימים לאחר בחירת השורש הראשונה, חזור על תהליך הבחירה כדי לבחור שורשים חדשים שעברו טרנספורמציה ולהסיר שורשים שאינם משתנים. להעביר את השתילים המכילים שורשים השתנה לצלחת חדשה המכילה 1/2 MS מדיום.</li>
</ol>3. העברה לחיסונים
<ol><li>הכינו את משטח השורשים לפני שהמשטחים ייחשפו לחיידק החיידקי: משרים את כלי החיסונים במים, יוצקים את כל המים העודפים, ומניחים אותם במגש לזריעת פלסטיק. העבירו את השתילים הנבחרים עם שורשים שהפכו לחיסונים בעזרת מלקחיים (איור 3א).</li>
	<li>כסו את המגש עם עטיפת ניילון או מכסה שקוף ושמרו אותם בגובה 25 עד 28 ° צ' ו 65% לחות (16 h/8 שעותאור/ כהה; 130μ:00), כדי לשמור על רמה גבוהה של לחות באיור 3B). הסירו את הכיסוי. לאחר חמישה או שישה ימים הערה: צמחי העגבנייה הפכו להיות מוכנים לחיסונים שבועיים-שלושה לאחר העברתם לקרקע (איור 3ג). במהלך הגידול על הקרקע, צמחי עגבניות עשויים לייצר שורשים חדשים שאינם משתנים. כדי לקבוע את מידת התופעה, הפלואורסצנטית האדום היה דמיינו בשורשים של שלושה שבועות בן צמחים עגבניות שהפכו. רוב השורשים (80%-100%) הראה פלואורסצנטית אדום, המציין כי הם אכן הפכו (איור 3D, E).</li>
</ol>4. אדמה-החיסון
<ol><li>לגדול ר solancearum (זן GMI1000 בפרוטוקול זה) במדיום נוזלי פי (שולחן 211) ב שייקר מסלולית (200 rpm) ב 28 ° צ' עד השלב הנייח.</li>
	<li>לקבוע מספרים חיידקיים על ידי מדידת הדחיסות האופטית של התרבות החיידקית ב 600 ננומטר (OD600). לדלל את התרבות החיידקית עם מים כדי OD600 של 0.1 (בתנאים המשמשים כאן, זה מתאים כ 108 יחידות המושבה ויוצרים [cfu]/ml).</li>
	<li>מניחים 16-20 מפעלי עגבניות שעברו שינוי במגש (29 ס מ x 20 ס מ; איור 4א).</li>
	<li>יוצקים 300 mL (~ 15 מ"ל לכל מפעל) של חיידקים (OD600 של 0.1) לתוך המגש המכיל את החיסונים. תנו להם לטבול באינוסינה במשך 20 דקות (איור 4ב').</li>
	<li>הכינו מגש חדש עם שכבה של אדמת השתילה. להעביר את הסירים מחוסן לתוך המגש החדש (איור 4ג) ומניחים את המגשים בחדר הגידול עם 75% לחות, 26-28 ° c, ו photoperiod של 12 h אור ו 12 h החושך (130 μ:4 מתוך הפוטונים m-1 אור).</li>
</ol>5. קביעת פרמטרים לזיהום וניתוח סטטיסטי
<ol><li>ציון תסמיני המחלה כפי שתוארו בעבר12,13, באמצעות סולם החל מ -0 (אין סימפטומים) כדי 4 (להשלים ווילטינג) (איור 4D-H), כל יום אחרי ralstonia החיסון לשבועיים. הערה: נתוני אינדקס המחלה נאספים מאותה יחידה ניסיונית (כל צמח) לאורך זמן.</li>
</ol>6. ביטוי גנטי ניתוח
הערה: הביטוי של הטרנסוגן או השתקה של גן היעד ניתן לקבוע על ידי RT-PCR או על ידי RT-pcr כמותי (רביעיית-PCR).
<ol><li>לאסוף דגימות ולחלץ RNA מחלק נציג של מערכת השורש השתנה (כדי להעריך את ההשפעה על הגן היעד) ועלים (כמו שליטה פנימית).</li>
	<li>לסנתז cDNA באמצעות 1 μg של הכולל מטופלים DNase-RNA.</li>
	<li>לנתח את הביטוי הגנטי של גנים היעד על ידי רביעיית-PCR. לחשב את רמות התמלול יחסית באמצעות 2-ΔΔCT שיטה14, באמצעות slefα-1 כתחזוקת גן15. הערה: רצף תחל מופיע בטבלה 1.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
<li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+JB+%22Compendium+of+Tomato+1094+Diseases%22">Compendium of Tomato 1094 Diseases</a>. , APS Press. St Paul, MN. (1991).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

Ralstonia סולאליום מהווה איום חשוב לחקלאות; עם זאת, האינטראקציה שלה עם המארחים הטבעי של החשיבות החקלאית הוא עדיין הבין באופן גרוע לעומת פתוגנים חיידקיים אחרים, במיוחד בגידולים מינים צמח. ברוב המקרים, ניתוח גנטי מפריע הזמן וההוצאות הדרושות כדי לשנות גנטית צמחים מארחים. כדי לטפל בבעיה זו ולהקל על ניתוח גנטי של הזיהום של R. sol, בעגבניה, פיתחנו שיטה קלה המבוססת על Agrobacteriumהתמרת-מתווך של שורשי עגבניות (איור 1), ואחריו מנקבים אדמה (איור 3</stro...

Ralstonia solanacearum, הסוכן הסיבתי של מחלת וילט חיידקי, היא קרקע הרסנית הנגרמת פתוגן כלי דם עם התפלגות עולמית שיכולה להדביק מגוון רחב של מינים צמח, כולל תפוחי אדמה, עגבניות, טבק, בננה, פלפל וחציל, בין השאר1,2. תשואה הפסדים שנגרמו על ידי Ralstonia יכול להגיע 80-90% של הייצור עגבניות, תפוחי אדמה או בננה, בהתאם זנים, אקלים, אדמה וגורמים אחרים3. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס syringae או קסטומונס spp. בנוסף, רוב המחקרים באינטראקציות הצמח-חיידק מתמקדים צמח המודל Arabidopsis thaliana. למרות שמחקרים המשתמשים במודלים אלה תרמו במידה רבה להבנת האינטראקציות של הצמחים-חיידקים, הם אינם מטפלים בצורך הנוכחי להבנת האינטראקציות הללו בצמחי היבול. מחקר ממוקד להבנת האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני כדי לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הישיר לאפיין את הרכיבים השונים של האינטראקציה. במיוחד, עגבניה, מארח טבעי עבור Ralstonia, הוא יבול הירקות השני החשוב ביותר ברחבי העולם והוא מושפע שפע של מחלות4, כולל מחלת וילט חיידקי. בעבודה זו, פיתחנו שיטה קלה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, באמצעות הפלואורסצנטית dsred כסמן בחירה5, ואחריו ralstonia קרקע-drenching של הצמחים וכתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו לבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi.
מגבלה פוטנציאלית של שיטה זו מורכבת מגידול שיורית של שורשים שאינם משתנים. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם השתמשו בפלסטלינה חסר גן עיתונאי המאפשר את הבחירה של שורשים שהפכו. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חלופית המבוססת על בחירה אנטיביוטית, אשר מעכב את הצמיחה של שורשים שאינם משתנים תוך מתן אפשרות לצמיחה של שורשים בריאים עמידים לאנטיביוטיקה השתנה. מאז ה -ריזוזוגנים לא מזרז את הטרנספורמציה של נצרי, הם רגישים לאנטיביוטיקה, ולכן הם צריכים להיות מופרדים ממדיום המכיל אנטיביוטיקה.
למרות התנגדות הצמח נגד ralstonia אינו מובן היטב, דיווחים מספר יש הקשורים קיר תא שינויים התנגדות משופרת חיידקיםוילט 6,7,8,9.6 הוצע כי אלה שינויים קיר התא משפיעים על פיתוח כלי דם, היבט חיוני לאורח החיים של Ralstonia בתוך הצמח10. מוטציות בגנים קידוד התאית סטנדרטים CESA4, CESA7 ו CESA8 ב arabidopsis thaliana הוכחו לפגוע שלמות הקיר התא המשני, גרימת עמידות משופרת RALSTONIA, אשר נראה קשור ל-ABA איתות8. לכן, כהוכחה למושג של השיטה שלנו, ביצעת גן RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 (Solyc02g072240), תא משני הקיר תאית סטנדרטים, ו אורתולוג של AtCESA8 (At4g18780). בעקבות הקרקע-drenching החיסון עם Ralstonia הראה כי השתקה SlCESA6 התנגדות משופרת לתסמינים וילט בקטריאלי, הרומז כי התא התנגדות מתווכת כדי ralstonia סביר להניח בעגבניה, ולאמת את השיטה שלנו כדי לבצע ניתוח גנטי של התנגדות וילט חיידקי בשורשי עגבניות. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.

<table><tbody><tr><td>90 מ"מ מרובע פטרי צלחות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר אבקת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD (בקטון ודיקנסון)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חומצות קסמינו</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר</td><td></td><td></td><td></td>סינון</tr><tr><td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סירי ג'יפי ג'יפי</td><td>פרודקטס אינטרנשיונל A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קלטת מיקרופור</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige ו-Skoog בינוני (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצע Pindstrup</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמל ולהב</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספסל</td><td></td><td></td><td></td> נקי סטרילי</tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר ווטמן וואטמן</td><td>אינטרנשיונל בע"מ תמצית שמרי מלדסטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם ralstonia solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum היא אדמה הרסנית הנישאים פתוגן כלי דם שיכולים להדביק מגוון רחב של מינים צמח, גורם איום חשוב על החקלאות. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס Syringae ב arabidopsis. מחקר ממוקד כדי להבין את האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הפשוט לאפיין את המרכיבים השונים של האינטראקציה צמחים מארחים יליד. בתרחיש זה, פיתחנו שיטה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה, שורה טבעית של ralstonia. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, ואחריו ralstonia קרקע-drenching החיסון של הצמחים כתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו המבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi. כהוכחה למושג, השתמשנו בשיטה זו כדי להראות כי RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 בשורשי עגבניות הענקת עמידות לראסטוניה. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.

איור 5 מראה את ההתפתחות של תסמיני המחלה של צמחי עגבניות עם שורשים שהפכו עם וקטור ריק (EV), וצמחים עם שורשים השתנה עם בניית rnai מיקוד SlCESA6 (Solyc02g072240). נתוני מדד המחלה (איור 5א) נאספים מאותה יחידה ניסיונית (כל צמח) לאורך זמן, בהתאם לקנה מידה שרירותי מ -0 ל-4, ואינם עוקבים אחר התפלגות גאוסיאנית, ומשנה את השימוש במבחנים סטנדרטיים לנתונים פרמטרית. יתר על כן, יש מפעל מהותי לצמח וריאציה בסוג ...

כאן, אנו מציגים שיטה רב-תכליתית לשינוי בשורש העגבניות ולאחריה החיסון לביצוע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלות וילט בקטריאלי.

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר למדענים לבצע ניתוח גנטי פשוט של מחלת נבול חיידקי בעגבניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי המניפולציה של ביטוי גנים ובדיקות הבאות ניתן לבצע בזמן קצר עם הדרישות הקטנות של ציוד ומרחב גידול הצמח. זוהי שיטה היא מאוד תכליתי, וזה עשוי להיות מיושם על צמחי יבול אחרים לבצע הן חיסון פתוגן ומיסיונים פיזיולוגיים אחרים.כדי לשמור על סטריליות במהלך מניפולציה של שתילים במבחנה, חשוב לשמור על הצלחות סגורות כאשר הם מחוץ למכסה המנוע זרימה. זוהי טכניקה קלה, אבל זה דורש צעדים מרובים למניפולציה. הדמיה של שיטה זו תסייע לראות טריקים קטנים שקשה להסביר בכתב היד, ותסייע לחוקרים אחרים ליישם את השיטה במעבדות שלהם.עוזר להדגים את ההליך הזה יהיה Achen זאו, סטודנט לתואר שני. לאחר עיקור ושטיפת זרעי העגבניות, מעבירים אותם למדיום מוראשיג' וסקוב חצי כוח ללא סוכרוז. שמור את הזרעים בחושך בטמפרטורה בין 25 ל 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים.מניחים מסנני פטרי בגודל 8.5 ס"מ רבועים בתוך מנות פטרי בגודל 9 ס"מ מרובע המכילות מדיום מוראשיג' וסקוק בחצי חוזק, וממקמים שישה זרעי עגבניות נובטים על כל צלחת. לאטום את הצלחת עם סרט Micropore, ו דגירה הזרעים נבט ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים. לגדל את קנה שורש Agrobacterium MSU440 במדיום מוצק LB עם אנטיביוטיקה מתאימה במשך יומיים ב 28 מעלות צלזיוס לפני טרנספורמציה צמחית.באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את הרדן ואת החלק התחתון של hypocotyl של שתילי עגבניות. השתמש טיפים מפלסטיק או להב אזמל כדי לקצור ביומסה A.rhizogenes מפני השטח של מדיום LB, בזהירות לטבול את שתילי עגבניות לחתוך ביומסה חיידקית. לאחר מכן, מכסים את שתילי העגבניות בנייר מסנן חצי מעגלי באורך שני ס"מ על-ידי ארבעה ס"מ על מנת לשמור על לחות גבוהה ולאפשר הישרדות ופיתוח שורשים חדשים.חשוב לשמור על השתילים בלחות גבוהה בסביבה המאפשרת התרחשות. כדי לעשות זאת, לכסות את השתילים עם נייר מסנן, ולסגור את הצלחת עם סרט Micropore. אחסן את שתילי העגבניות שהשתנו במשך שישה עד שבעה ימים בתא צמיחה בטמפרטורה שבין 25 ל -28 מעלות צלזיוס.לאחר מכן השתמש אזמל סטרילי לחתוך את השורשים השעיר המתעוררים החדשים, ולאפשר שתילים לייצר שורשים שערים חדשים. לאחר הדור השני של שורשים שעירים חדשים מופיע, להסיר את נייר המסנן על גבי השתילים, ולאטום את הצלחת עם סרט Micropore שוב. כדי לדמיין פלואורסצנטיות DsRed או כל ציוד אחר עבור הצמח בהדמיה vivo, לסמן את השורשים השתנו חיובי, אשר ניתן לזהות על ידי פלואורסצנטיות אדומה.השתמש אזמל כדי להסיר את השורשים השליליים שאינם השתנו, אשר ניתן לזהות על ידי חוסר פלואורסצנטיות אדומה שלהם. מעבירים את השתילים ה מראים פלואורסצנטיות אדומה לצלחת חדשה המכילה חצי כוח Murashige ו סקוג בינוני על מנת להקל על הפיתוח של השורש השתנה כמו השורש העיקרי. שמור את השתילים שלא מראים פלואורסצנטיות אדומה באותה צלחת כדי לבדוק את הופעתם של שורשים פלואורסצנטיים בנקודות זמן מאוחרות יותר.מכסים את השתילים בנייר מסנן חצי-עיגול באורך שני ס"מ על ארבעה ס"מ, אוטמים את הצלחת ודקרים את השתילים כדי לאפשר להם לפתח שורשים שערים חדשים. מכינים את סירי החיסון שבהם פני השטח של השורשים ייחשפו לאנוקולום החיידקי על ידי השריית סירי החיסון במים, שפיכת מים עודפים, ולאחר מכן הנחתם במגש נטיעת פלסטיק. באמצעות פינצטה, להעביר את השתילים שנבחרו עם שורשים טרנספורמציה סירי חיסון.מכסים את המגש בניילון נצמד או במכסה שקוף, ולשמור אותם בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס עם 65% לחות. הסר את הכיסוי לאחר חמישה או שישה ימים. לגדל רלסטוניה בחמישה LB נוזלי בינוני בשייקר מסלולית ב 28 מעלות צלזיוס, עם רעידות ב 200 סל"ד, עד השלב נייח.למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כדי לקבוע את מספרי החיידקים. לדלל את התרבות החיידקית עם מים כדי OD600 של 1. מניחים 16 עד 20 סירי חיסון המכילים צמחי עגבניות שהפכו למגש חיסון.לאחר מכן יוצקים 300 מיליליטר של אינוקולום חיידקי מדולל לתוך המגש, ומאפשרים לצמחים להשרות את inoculum במשך 20 דקות. לאחר מכן, להכין מגש חדש עם שכבה של אדמה שתיל. מעבירים את הסירים החוסנים למגש החדש, וממקמים את המגשים בתא צמיחה עם 75% לחות, טמפרטורה בין 26 ל -28 מעלות צלזיוס, ו photoperiod של 12 שעות של אור ו 12 שעות של חושך.כאן, שורשי עגבניות משתנים מחוסנים עם רלסטוניה לבצע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלת נבול חיידקי. התפתחות תסמיני המחלה נמצאת במעקב בצמחי עגבניות עם שורשים שעברו טרנספורמציה עם וקטור ריק ואלה שעברו טרנספורמציה עם מבנה RAI מיקוד עגבניות CESA6. נתוני מדד המחלה נאספים מאותה יחידה ניסיונית לאורך זמן על פי סולם שרירותי מאפס לארבעה ולא עוקבים אחר התפלגות גאוסיאנית, שוללים את השימוש בבדיקות סטנדרטיות לנתונים פרמטריים.כגישה סטנדרטית, נעשה שימוש בעקומות U Mann-Whitney, דו-זנביות ולא פרמטריות להשוואת עקומות הבקרה והזיהום. על פי ניתוח זה, ההבדל בין החציונים של שתי העקומות נראה לא משמעותי. ניתן גם לכמת את האזור תחת עקומת התקדמות המחלה, המאפשרת שילוב תצפיות מרובות של התקדמות המחלה לערך אחד.האזור תחת עקומת התקדמות המחלה מראה ערך גבוה יותר עבור צמחי בקרה לעומת צמחי עגבניות CESA6 RNAi בסוף תהליך ההדבקה, המציין כי צמחים מושתקים CESA6 עגבניות עמידים יותר לזיהום רלסטוניה מאשר צמחים בקרה. מרווחי בר-סמך מציעים דרך להעריך, בהסתברות גבוהה, טווח ערכים שבו נמצא ערך האוכלוסיה של משתנה נתון. כפי שניתן לראות כאן, האזור של מרווח הביטחון של 95% עבור עקומות הבקרה והזיהום מעריך סיכוי גבוה יותר להתנגדות כאשר CESA6 מושתק.ערכי מדד המחלה יכולים להפוך לנתונים בינאריים, בהתחשב במדד מחלה נמוך משניים המתאימים לאפס ואינדקס מחלות שווה או גבוה משניים המתאימים לאחד. זה מאפשר ייצוג של עקומת הישרדות לאחר חיסון רלסטוניה. ההבדלים בשיעור ההישרדות בין השליטה לצמחים הנגועים אינם מובהקים סטטיסטית על פי המבחן הסטטיסטי של גהאן-ברסלו-וילקוקסון.הביטוי של CESA6 מנותח לאחר מכן בשני שורשים שנבחרו באקראי שהשתנו לפני שלב החיסון, מה שמראה שההתנגדות המשופרת לרלסטוניה תואמת את הביטוי המופחת של CESA6. לאחר שני סבבי בחירה, ניתן להשיג שיעור המרה של 35 עד 40% וערך זה ניתן להגדיל על-ידי ביצוע סיבובי בחירה נוספים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על השתילים מכוסים בפיסת נייר סינון כדי לשמור על לחות גבוהה ולאטום את הצלחות עם Micropore כדי להבטיח החלפת גז.לאחר טרנספורמציית השורש, ניתן ליישם רבים מהטיפולים כדי לחקור את תגובת הצמח על ידי התבוננות בפיזיולוגיה של השורש או באמצעות ביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא או ביוכימיה. בעיקר, טכניקה זו תאפשר לחוקרים עם משאבים מוגבלים לבצע ניתוח גנטי של זיהום חיידקי בשורשי עגבניות.

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מקור: חסן, ג'יי.א., ואח'. זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות ל-Pseudomonas syringae pv. עגבנייה בעגבנייה באמצעות בדיקת שיטפון שתילים. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים שיטה לסינון עמידות חיידקים בזני עגבניות שונים באמצעות שתילים בני עשרה ימים המחוסנים בתרחיף חיידקים. הוא מסביר כיצד חיידקים פולשים דרך פיוניות, מספקים חלבונים אפקטורים לדיכוי חסינות הצמח, וכיצד תגובות הצמח שונות בין זנים רגישים ועמידים. התוצאה מוערכת על ידי התבוננות בהבדלי צמיחה גלויים, כאשר צמחים עמידים נשארים בריאים ורגישים מראים נזק...

בדיקת שיטפון שתילים לבדיקת עמידות חיידקים בעגבניות

מקור: Matthysse, A. G. היצמדות חיידקים למשטחי צמחים שנמדדה במעבדה. J. Vis. Exp., (2018)סרטון זה מדגים פרוטוקול למדידת התיישבות שורשים של שתילי עגבניות על ידי חיידקים פתוגניים מסוג בר וחסרי תאית. ספירות חיוניות של חיידקים הדביקים היטב מראות הידבקות גבוהה יותר ויצירת מיקרוקולוניות על ידי הזן הפראי, מה שמדגיש את תפקיד התאית ביציבות התיישבות שורשים.

הערכת התיישבות שורשים של שתילי עגבניות על ידי חיידק פתוגני באמצעות ספירות תאים ברות קיימא

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.

אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

למדו שיטה לשורש עגבניות המרה וחיסון ב-Ralstonia solanacearum לניתוח גנטי של מחלת וילט חיידקי. הפרוטוקול מאפשר מחקר מהיר בפתולוגיית צמחים עם ציוד מינימלי.

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

גלה סרטונים נוספים