מערכת מטריצה תלת-ממדית פיברובלסט הישימה בשיטת היווצרות שפופרת אנדותל

פרוטוקול זה מאפשר לראות סוגים שונים של תרבויות ולהתבונן באינטראקציות שלהם עם מטריצה ת"ל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי המטריצה שאתה מקבל הוא מחדש על ידי fibroblast וזה יהיה די דומה לאלה שנוצרו vivo. אנו מאמינים כי מחלה זו אינה רלוונטית בעת שימוש fibroblast מקבל מן כלי אפייה.

הקמת מטריצה מהתאים האלה יכולה להאיר את עינינו כיצד היא יכולה להשפיע, למשל, על מצב מתמשך. שיטות אלה ניתן ליישם גם, למשל, מחקרים פיזיים לניצולים מן ההגינות מטריצה. הדמיה של פרוטוקול זה חשוב לבחון טכניקת pipetting של השלבים שאתה צריך עוצר.

כאשר מנסים שיטות אלה בפעם הראשונה זה כנראה ייקח יותר זמן מהצפוי. העצה שלנו היא להכין כמה שאתה יכול מראש באמצעות תקופות משך להתכונן לשלבים הבאים. התחילו בהכנת 0.2% ג'לטין, 1% גלוטארלדהיד ותותני אתנולאמין טוחנים אחד בהתאם לכיווני כתב היד.

הקפד להפעיל כל פתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 לפני השימוש. לאחר מכן, להכין חומצה אסקורבית חיץ תיזה. לדלל את העט-סטרפטוקונטר PBS כמתואר בכתב היד ולהכין DMEM עם 10%FBS.

הכן חום denatured 2%BSA על ידי הוספת 2 גרם של BSA ל 100 מיליליטר של מים סטריליים וחימום אותו באמבט מים רותחים במשך שבע דקות. לאחר מכן, להשלים FBS עם פניצילין, סטרפטומיצין, גנטמיצין, ואמפוטריצין B.Culture טלומרים רקומביננטיים transfected הונצחו fibroblasts המין האנושי DMEM עם 10%FBS ושמר אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%פחמן דו חמצני. כדי להקים את התרבות fibroblast העיקרי, לחתוך את דגימות הרקמה לחתיכות קטנות של כ 2-3 מיליליטר קוביות זרעים אותם FPS עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה.

כאשר הפיברובלסטים הראשונים מופיעים, החלף את המדיום במדיום FBM לתחזוקת תאים. מוסיפים שני מיליליטר של תוסף ג'לטין 0.2% לכל באר של צלחת שש בארות ומדרגים אותה במשך שעה אחת ל-37 מעלות צלזיוס או ללילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שאפו את הג'לטין ושטפו כל באר עם שני מיליליטר של PBS.

מוסיפים שני מיליליטר של 1% של glutaraldehyde לכל באר ולדוג את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שלושים דקות אשר יצליב את הג'לטין. שאפו את הגלוטארלדהיד ושטפו את בארות בשני מיליליטר של PBS במשך חמש דקות. כדי לחסום את glutaraldehyde הנותרים, להוסיף שני מיליליטר של אתנולאמין אחד טוחן הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שלושים דקות.

שאפו את האתנולאמין וחזרו על השטיפה עם PBS. הוסף מיליליטר אחד של DMEM עם 10%FPS. אם המדיום הופך מיד ורוד, להסיר אותו, לשטוף את בארות פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS ולהוסיף מיליליטר נוסף של DMEM.

זרע מיליליטר אחד של השעיה fibroblast עם 5 x 10 לתאים החמישיים בכל באר ותרבות התאים עד 100%confluence הוא הגיע. לאחר מכן הסר את המדיום והחלף אותו ב- DMEM עם 10%FBS ו- 50 מיקרוגרם למיליליטר חומצה אסקורבית. החלף את המדיום כל יומיים במשך שישה ימים.

יומיים לאחר הטיפול האחרון בחומצה אסקורבית להסיר את המדיום ולשטוף את בארות עם שני מיליליטר של PBS. לאחר השטיפות, מוסיפים לאט מיליליטר אחד של חיץ תזה שחומם מראש וגוררים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש עד עשר דקות עד שהפיברובלסטים ניתוקים. מבלי להסיר את מאגר תיזה, בזהירות להוסיף שני מיליליטר של PBS לכל באר ולאחר מכן שאפו כ 2.5 מיליליטר.

חזור על תהליך זה פעמיים עבור סך של שלוש שטיפות. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים שני מיליליטר של PBS עם עט סטרפטוקומפ. לאטום את הצלחת עם הסרט ולשמור אותו בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים.

הגדל תאי HUVEC ו- EMB-2 עם 2%FBS עד להתכנסות מרבית. לאחר מכן החלף את המדיום עם EBM-2 ללא FBS במשך שמונה שעות. כדי להכין את מטריסות עבור זריעת תאים, להסיר אותם מהמקרר ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.

חוסמים את המטריצה על ידי הוספת שני מיליליטר של חום denatured 2%BSA ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, שאפו את ה-BSA ושטפו אותם בשני מיליליטר של PBS. זרעים 2 x 10 לתאי HUVEC החמישיים לכל באר של הצלחת מצופה מטריסות שמקורן פיברובלסט.

דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות ואז לבחון את המבנים דמויי צינור תחת מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי בהגדלה 20-40x. פרוטוקול זה שימש לבחינת ההשפעות של טיפול PDGF על היווצרות מטריצה שמקורה פיברובלסט. הפיברובלסטים השלישיים של BGH שנדגירה עם PDGF הראו התפלגות תאים מיושרת יותר במטריצה מאשר אלה שדגירה ללא PDGF.

קולגן 1 וביטוי חלבון פיברונקטין הוגדלה מטריצות נגזר פיברובלסטים מגורה PDGF וכתוצאה מכך עובי מטריצה הוגדלה. יתר על כן, היסטוגרמות כיווניות מראות כי קולגן 1 ופיברונאטין מראים דפוסים מקבילים. כאשר תאי HUVEC נזרעו על מטריסות דקולולריות שמקורן פיברובלסטים מגורה PDGF הם פיתחו מבנים דמויי נימים יותר מאשר בתנאים אף אחד מגורה.

אישור כי מטריסות נגזר PDGF-BB מגורה fibroblasts לקדם הפעלת תאים אנדותל. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין פתרונות מראש ולוודא שהתאים מוכנים לפני תחילתם. מלבד תאים אנדותל מחקרים מטריקס יכול גם להיות זרע עם תאי אפיתל ואת התגובה לגורמים חיצוניים כמו מצב במדיה או תרופות cytotoxic ניתן לראות.

הדור של מטריצה תכלית חיוני בתכנון ניסויי macroenvironment הגידול.