Name: חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו חיתוך שרירי טיסה מסומנים ב-GFP מזחלי Drosophila melanogaster לניתוח אומיקס. השיטה מייצרת דגימות עשירות באיכות גבוהה עם מינימום פירוק RNA, מתאימות ל-RT-PCR וספקטרומטריית מסה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לאנדריאס לדבנר ולפרנק שנוררר לתמיכה נדיבה. אנו מודים סנדרה Esser לסיוע טכני מעולה Akanksha Roy ליצירת מידע ספקטרומטר המסה. אנו מכירים במרכזי המניות של בלומינגטון ווינה לאספקת זבובים. אנו מודים למרכז הביודמיה של מיתקן לעזרה עם דימות ממוקד ו Zentrallabor, פרוטאינאנליטיק לניתוח של דוגמאות ספקטרומטר המסה, הן במרכז הביו-רפואי LMU (מרטיסריד, DE). העבודה שלנו היתה נתמכת על ידי הגרמני Forschungs Geמיישלסירכתיים (MLS, SP 1662/3-1), המרכז למדעי החלבון המשולב במינכן (מינכן) ב לודוויג-מקסימיליאן-אוניברסיטת מינכן (MLS), הפרדריק באוור Stiftung (MLS), והמקס הבינלאומי בית הספר למחקר פלאנק (EN).

1. היערכות לגלמים
<ol><li>העלאת הזבובים של גנוטיפ הרצוי בבקבוקים (איור 1E). או לעשות היפוך טרי של מלאי החיתוך או להגדיר צלב עם לפחות 20 בתולה נקבה זבובים. לשמור על הבקבוקים עד הזבובים מתחילים להחטה.</li>
	<li>איסוף מראש הגלמים עם מכחול מוצוף והעברה לנייר סינון בצלחת פטרי 60 מ"מ (איור 1F).</li>
	<li>סקס הגלמים, איסוף המין המתאים לניסוי (איור 1גר'). הזכרים מזוהים על ידי נוכחות של האשכים, אשר מופיעים ככדורים שקופים בגולם האטום האחר.</li>
	<li>סמן את צלחת פטרי עם הזמן, התאריך והגנוטיפ, ולאחר מכן הקלד את הגלמים לשלב הרצוי (איור 1ח). הערה: שמירה על צלבים/מניות וגלמים בחממה מבוקרת טמפרטורה (כלומר, 25 ° צ' או 27 ° צ' לצלבים RNAi, כמו Gal4 פעילות מוגברת בטמפרטורות גבוהות יותר מגביר את יעילות הדופק40). ודא כי הלחות גבוהה מספיק כך שהגלמים לא יבשים כאשר מזדקנים מספר ימים.</li>
</ol>2. ניתוח IFM לפני 48 h APF
<ol><li>להרכיב את הציוד הדרוש כולל שני #5 ביולוגיה כיתה מלקחיים, פיפטה, טיפים פיפטה, קרח יבש, ו (עבור דגימות RNA) בידוד מגיב (ראה לוח חומרים). בנוסף, לצנן את הצלחות שחור (ראה שולחן חומרים), 1x פוספט מתכלה מאגר (PBS) באגירה, ו 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות על הקרח.</li>
	<li>באמצעות מברשת צבע, העבירו את הגלמים הממווים לצלחת מבתר שחורה, מלאה בשני שלישים עם הערוץ ה-PBS הקרים (איור 2א, ב). . מעבר למיקרוסקופ פלורסנט הערה: השתמשו בכמה שיותר גלמים כפי שניתן לגזור בחלון זמן של 30 דקות. בהתאם לניסיון, נע בין 3 ל-15 גלמים. ראה שיטות משלימות לדיון בחלופות לניתוח שחור.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים #5, דחפו את אחד הגלמים לתחתית מיכל מבתר שחור והתאימו את מיקרוסקופ הזום והתמקד בבהירות לראות את הגולם (איור 2ג).</li>
	<li>אחוז בחלק הקדמי של הגולם עם מלקחיים אחד (איור 2ד), ואז לתקוע את הגלמים עם קצה אחד של המלקחיים האחרים מעט מחוץ למרכז בבטן, ממש מאחורי בית החזה. זה מחזיק את הגולם במקומו ומונע מ-IFMs לנוע לתוך הבטן (איור 2E). הערה: התחל בתזמון אורך הניתוח מנקודה זו, ברגע שהיושרה של גולמי מופרת. השתמש באורך מוגדר של הניתוח (לדוגמה 20 – 30 דקות) כדי למזער את מוות השריר ושינויים הקשורים הטרנססקריפט והפרוטאומית. לנתח כמו זבובים רבים ככל האפשר בתקופה זו של זמן.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים הראשון, להסיר את החצי הקדמי של המקרה גולמי (איור 2F).</li>
	<li>השתמשו באותו מלקחיים כדי לצבוט את הגלמים החשופים ממש מאחורי החזה, ולהפריד את הבטן מהחזה (איור 2G).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לסחוט בעדינות את החלק הקדמי של החזה (עבור < 35 h APF) או לקרוע את החזה כדי לחשוף את התווית הפלואורוסקופים (איור 2h). אם Ms בקלות להתנתק מן האפידרמיס, כמו ההחזקות גיד בזמן המוקדמות נקודות שבירות. להשליך את הגווייה הנותרת באמצעות מלקחיים כדי לדחוף אותו לצד הנגדי של המנה.</li>
	<li>שלבים חוזרים 2.3 – 2.7, מנתחים גלמים נוספים.</li>
	<li>לאסוף את סיבי IFM עם מלקחיים ולארגן אותם לתוך ערימה בתחתית הצלחת מבתר שחור (איור 2I, J). להסיר את כל הפסולת על ידי דוחף אותו מתוך שדה התצוגה באמצעות מלקחיים. הערה: עם התרגול, עצות מלקחיים ניתן להגיע קרוב מבלי לגעת זה בזה. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לתפוס באופן רופף IFMs בלי להרוס אותם. שיטות חלופיות כוללות לדחוף בעדינות או להרים את IFMs עם קצה אחד או מלקחיים סגורים לחלוטין, או לקחת קצת שומן או רקמה אחרת עם IFMS והסרת השומן כפי שמתואר בשלב 2.10.</li>
	<li>איכות לשלוט בדגימת שריר IFM, באמצעות מלקחיים כדי להסיר שרירי שאינם IFM, שומן, קוטיקולה, וכו ' מן המדגם (איור 2K, L). הערה: עם Mef2-Gal4, IFM היא בעלת תווית חזקה יותר מאשר סוגי שרירים אחרים בזמן מוקדם נקודות (איור 2K, k '), המאפשר הסרה של שריר לקפוץ ושרירי זחל מבוסס על עוצמת הזריחה ואת הצורה שריר. שומן, רקמת קוטיקולה נראה שונה לא מתויג על ידי תווית פלואורסצנטית ספציפי שריר (איור 2k, k '). עיין בסעיף הדיונים עבור שורות Gal4 אחרות המתווית את IFM.</li>
	<li>באמצעות קצה הצינורות החתוכים, להעביר את ערימת IFMs לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מלא 250 μL של מקורר 1x PBS (איור 2M-O). . המשך מיד למחלקה 4 הערה: דגימות IFM עלול לאבד רק על ידי היצמדות לצד הקצה של הפיפטה. ללטף מאגר למעלה ולמטה מספר פעמים לפני איסוף IFMs יכול לעשות טיפים סטנדרטיים פחות דביק, וסיליפיזציה או perfluoroalkoxy (לראות את הטבלה חומרים) עם מתחים פני השטח התחתון יכול לעזור למנוע אובדן לדוגמה.</li>
</ol>3. הניתוח IFM לאחר 48 h APF
<ol><li>להרכיב את הציוד הנדרש כולל שני #5 ביולוגיה כיתה מלקחיים, מספריים משובחים, רגיל מיקרוסקופ זכוכית מגלשות, נייר דבק כפול, פיפטה, טיפים פיפטה, קרח יבש, ו (עבור יישומי RNA) בידוד מגיב (ראה לוח חומרים). לצנן את הצינורות 1 x PBS ומיקרוצנטריפוגה על הקרח.</li>
	<li>באמצעות מכחול קל, העבירו את הגלמים המבווים לרצועה של סרט דביק כפול-דו-צדדי רכוב על שקופית מיקרוסקופ (איור 3א). מניחים את הגלמים בקו מכוון בכיוון זהה (למטה ולמטה לכיוון תחתית השקופית). הערה: היזהרו לא להשתמש ביותר מדי מים על מכחול או מסנן, או הגלמים לא יהיה טוב. אם הגלמים אינם נדבקים, מייבשים אותם על ידי העברה ראשונה לסינון יבש או לנייר טישו. הר כמו הגלמים רבים ככל שניתן לגזור בתוך 30 דקות חלון זמן, באופן אידיאלי ~ 10 הגלמים.</li>
	<li>הסר את הגולם מהתיק הפופל. השתמש מלקחיים להקניט לגזרים ולפתוח את המקרה גולמי מעל נושפות הקדמי (איור 3ב).</li>
	<li>השקופית בעדינות זוג מלקחיים דורסלי לכיוון האחורי, חיתוך המקרה גולמי כמו מלקחיים להעביר (איור 3ב '). היזהר שלא לקרוע. את הגולם הבסיסי שחרר את הגולם מהתיק הפתוח והעבר אותו מיד לירידה של 1x PBS בשקופית מיקרוסקופ שנייה (איור 3ב', ג).</li>
	<li>חזור על שלבים 3.3 ו-3.4 עבור כל הגלמים בשורה, ולאחר מכן הגדר את שקופית הסרט מקל כפול בצד.</li>
	<li>בעזרת המספריים העדינים, חתכו את בטן הגולם הרחק מבית החזה ודחפו אותו לערימה נפרדת (איור 3ד, ד). חזרו על הגלמים הנותרים. הערה: התחילו את הזמן את אורך הניתוח עם שלב 3.6, ברגע שהשלמות גולמי מופרת. לנתח כמו זבובים רבים ככל האפשר בתוך 20-30 דקות כדי למנוע מוות של תאים והקשורות החלפת הטרנססקריפט והפרוטאומית. כאשר מדובר במבוגר אחד או ב> 90 מעלות הגלמים, נוח לעתים קרובות לצעדים מאוחרים יותר כדי להסיר בנוסף את הראש עם המספריים העדינים.</li>
	<li>באמצעות נייר טישו, להסיר את רוב 1x PBS (בדרך כלל מעונן עם שומן מושעה), כמו גם את ערימת בטנם (איור 3E). הוסיפו טיפה של הערוץ החדש, מקורר 1x PBS לשאר הצירים.</li>
	<li>השתמשו במספריים כדי לחתוך את בית החזה במחצית (איור 3f, f ') על ידי חיתוך מהראש לאורך ציר הגוף האורכי בתנועה אחת. לחילופין, אם הראש הוסר, הכנס תחילה את המספריים שבהם הראש היה מחובר וחתך את החצי העליון של longitudinally החזה בין השניים. ואז, חותכים את הצד הגחוני של בית החזה עם חתך נוסף באותו אוריינטציה.</li>
	<li>חזרו על שלבים 3.7 ו-3.8 לגזור את כל הגלמים, היוצרים ערימה של מפרבית החזה בסמוך למרכז השקופית. ודא שיש מספיק מקורר 1x PBS על השקופית, כך המירות לא להתייבש. הערה: לאחר 48 h APF, IFMs הם גדולים מספיק כדי להיות גלויים תחת מיקרוסקופ מבתר רגיל לעין מיומן. בשלב זה בפרוטוקול, ניתן להעביר שרירים עם תווית פלורסנט לתוך ניתוח פלורסנט כדי לסייע בזיהוי IFM או למטרות הכשרה, אך אין צורך בכך.</li>
	<li>. לנתח את היציאה מתוך החזה לבודד את אחת ההדמיעות באמצעות מלקחיים #5 (איור 3G, H). בעדינות להוסיף את קצות מלקחיים אחד מעל ומתחת לאמצע של IFMs (איור 3G, H '). בעוד מחזיק את הלקחיים הראשונה עדיין, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך קצה אחד של IFM הרחק מן הקוטיקולה והגידים. ואז, לחתוך את הקצה השני של IFM חינם מן הקוטיקולה (איור 3G ', H ' '). הערה: בהתאם לכיוון החזה לאחר החתך הראשון של IFM, היא שימושית לסובב את החזה 180 °, כך שחיתוך השני של IFM יהיה קל יותר לביצוע.</li>
	<li>הסר את צרור IFM מן החזה עם מלקחיים (איור 3G ' ', H' '), העברת אותו לקצה של בועת PBS להשתמש במתח המים כדי להחזיק אותו במקום (איור 3I). תדחוף את הגווייה. לצד השני של המגלשה חזור על הפעולה הנותרת בבית החזה, הפקת אוסף של לגזור. הערה: אם ה-IFMs לא יישאר בערימה מסודרת, הסר חלק מ-1x PBS עם רקמה. היזהרו לא לתת את כל ה-PBS להתאדות, ולוודא את הגזור את הניתוח ואת המיטוררים להישאר מכוסים על ידי המאגר.</li>
	<li>לאחר ניתוח כל הטרשת הנפוצה, במהירות לבצע בקרת איכות על השריר בגזור. באמצעות מלקחיים #5, להסיר כל שריר לקפוץ או שברי הקוטיקולה שאולי מצאו את דרכם לתוך המדגם (איור 3J-K '). הערה: שריר הקפיצה מופיע שונה מ-IFM. אם מבתר Mef2-Gal4 התווית שריר תחת פלואורסצנטית, שריר לקפוץ יש זריחה חלשה יותר צורה ומרקם שונים. תחת האור הרגיל, היא נראית כמעט שקופה בעוד שה-IFMs מהווה אטום, צהוב חלבי (איור 3j-j ', K).</li>
	<li>שימוש במתח מים, לכידת (אך לא מחצו) הגזור את החלק השני בין זוג מלקחיים (איור 3ליטר). העבר את IFMs לצינור 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה ממולא מראש עם 250 μL של מקורר 1x PBS (איור 3M). . המשך מיד עם סעיף 4 הערה: כאשר טיפים מלקחיים מובאים בסמיכות זה לזה והרים מתוך פתרון מאגר, מתח מים גורם בועה של מאגר להילכד בין טיפים מלקחיים. אם אם Ms נמצאים גם בבועה זו, הם יכולים להיות הרים מתוך הפתרון והועברו בקלות לשקע אחר מלא מאגר. חשוב לסחוט את המלקחיים כדי להביא את הטיפים הסמוכים אחד לשני בלי לגעת זה בזה, כדי למנוע את רקמת הרקמה שנתפסו בועה מאגר.</li>
</ol>4. גלולה ולשמר את דגימת IFM
<ol><li>גלולה IFMs על ידי תפרידו 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת עבור 3 – 5 דקות ב 2,000 x g ב צנטריפוגה שולחן בטבלה (איור 4a, B).</li>
	<li>הסר את המאגר באמצעות עצת פיפטה (איור 4ג).
</li>
	<li>עבור יישומי RNA, השהה מחדש את הגלולה IFM ב-50-100 μL של מאגר בידוד ה-RNA הרצוי (ראה טבלת חומרים, איור 4ד). . אחרת, המשך לשלב 4.4 הערה: IFMs יכול להיות יבש קפוא לאחר שלב 4.2 עבור ההכנות ספקטרומטר המסה או בידוד של RNA עם ערכות מסחריות (ראה תוצאות מייצגות). עבור יישומי RNA, תוצאות טובות יותר מתקבלות על ידי השעיית מיידית והקפאת הגלולה IFM בבידוד מאגר.</li>
	<li>הקפא דגימה על קרח יבש או הקפא בחנקן נוזלי (איור 4E). חנות ב-80 ° צ' עד מוכנים לצעדים הבאים בהכנה לדוגמא לניתוח במורד הזרם. הערה: לאחר הקפאת ההזמנה, דגימות ניתן לאחסן במשך כמה חודשים לפני העיבוד לחקירה במורד הזרם.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את הטכניקה הבסיסית לנתח את דרוסופילה ifms מפני גלמים מוקדם ומאוחר לבידוד של חלבון, DNA, RNA או קרו אחרים. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול לנתח IFM מזבובים למבוגרים. אנו מדגימים את השירות של פרוטוקול הניתוח שלנו עבור mRNA-Seq, פרוטאומיקס ו-RT-PCR יישומים. עם שיפור מתמשך של טכנולוגיות omics כדי לאפשר ניתוח של דגימות עם חומר התחלתי פחות וריכוזי קלט נמוך, הניתוחים הללו יהיו בעלי ערך רב עבור יישומים נוספים רבים. כמו ifms הם מודל מבוסס עבור האדם myopathies4,24 ו-סוג שריר הפיתוח הספציפי9,12, אנו לדמיין, למשל, אם מועשר טבולומיקס, חקירות של כרומטין קונפורמציה באמצעות 3C או 4C, החדרת הערכה לרשת באמצעות האינטראקציות של CLiP או של פוספהו-פרוטאומניקס של myofibrillogenesis.
חשוב לשקול שניתוח זה מפיק דוגמה מועשרת עבור IFM במקום דגימת IFM טהורה. זה בלתי נמנע עקב מנוע העצב המנוע, ההחזקות גיד והחדירה הקנה של סיבי שריר. ניתן להשתמש בניתוח ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים או החלבונים המועשר של IFM, אך ניסויים נוספים נדרשים להדגים כי הם בעצם הינם ספציפיים ל-m. טוהר לדוגמה יכול להיות הרים באמצעות סמנים ספציפיים רקמה שפורסמה כגון פס45 (גיד), Act79B4,44 (שריר הכרישים), Act88F15 (ifm), או syb46 (ספציפי עצבי). ייתכן שיהיה ניתן להשתמש בסמנים כגון לנרמול ערכות נתונים לתוכן הספציפי ל-IFM, אך משתמשים מהזהרתי כי השינויים הטמפורלית בביטוי הגנים המשמשים לנורמליזציה, לדוגמה גנים ספציפיים של IFM או טובולין, עלולים להיות מוטה בגישה כזו.
מקודד גנטית שיטות תיוג ספציפי לתוויות, לדוגמה EC-תיוג47,48 או פאבפ-תוויות49,50 עבור בידוד RNA פותחו בשנים האחרונות, אשר עשוי לסייע להשיג באמת דגם RNA ספציפי לרקמות. עם זאת, התיוג EC דורש הזנה מתמדת של זבובים47 ולכן אינו ישים במהלך שלבים גולמי. הרגישות והשלמות של ההמרה המסומנת ב-פאבפי התווית עשויות להיות בעלי מגבלות51. FACS גישות לבידוד סיבי שריר בודדים הם מסובכים על ידי גודל גדול והאופי הסינציאני של IFMs. 52שלמים,53 גישות בסגנון ניתן להחיל על בידוד מסוימים בתאי הסלולר של ifms, אשר עשוי להוכיח שימושי עבור בידוד אוכלוסיות טהורות של הגרעין ifms או המיטואום. ניתוח ידני הוא עדיין התקן הנוכחי להשגת רקמות IFM שלמות עבור רוב יישומי במורד הזרם.
איכות הדוגמה תלויה במספר שלבים קריטיים בתהליך החיתוך. הניתוח מאוד תובעני, עם מהירות החיתוך וטוהר המדגם הולך וגובר עם ניסיון. מבתר לפרקי זמן קצרים (20 – 30 דקות) במאגר מקורר ללא חומרי ניקוי והקפאה מיידית מסייעת לשמר את השלמות לדוגמה, כפי שנצפתה בעבר עבור גיד העכבר בידוד54. IFMs ניתן בהצלחה יבש-קפוא לאחר הסרת כל מאגר מתוך הגלולה, אבל במיוחד עבור בידוד RNA, הקפאת דגימות במאגר בידוד נוטה להפיק תוצאות טובות יותר. אם ms מתוך עד 20 הניתוחים הנפרדים משולבים לפני RNA או חלבון בידוד, המאפשר לטפס למעלה ואיסוף חומר מספיק, אפילו מנקודת זמן מוקדמת או מוטציות16,32, עבור ניתוח במורד הזרם.
עבור יישומי RNA, הצעד הקריטי ביותר עשוי להיות הבידוד של ה-RNA עצמו. גואנידיניום thiocyanate-פנול-כלורופורם בידוד (שיטה 1 מעל) מבצעת את רוב ערכות מסחריות נבדק, כפי שצוין קודם לכן, הוא הרבה פחות יקר55. ההבדלים שנצפו ב-RNA תשואות בידוד עם ערכות מסחריות הוא בהסכמה עם תצפיות קודמות56,57. אנחנו עוד להוסיף גליקוגן במהלך משקעים איזופנול כדי לעזור לשחזר את כל RNA. מעבר לתשואה RNA, חשוב לוודא שלמות RNA כדי להבטיח שמדגם לא היה מפוצל או מושפל במהלך תהליכי הניתוח והבידוד. זה חיוני גם לעבוד RNase-חינם. לבסוף, הבחירה של RT-kit יכול להשפיע על הרגישות של תהליך התמלול הפוכה. למרות שלא לעיתים קרובות דנו בפרטים, כל הנקודות האלה משפיעות על איכות המדגם IFM ואת הנתונים שהתקבלו מיישומים במטה.
מספר שינויים חשובים מגדיר את הפרוטוקול מלבד פרוטוקול ניתוח IFM קיים. למרות שפרוטוקול הניתוח המפורט לצורך החיסונית של IFM מתקיים ב-19, פרוטוקול זה מציג גישה שונה לניתוח פופל המאפשר בידוד מהיר יותר של רקמת ifm. הדבר מאפשר איסוף של כמויות גדולות של רקמת IFM (דיבור יחסי) עם זמני ניתוח מוגבל כדי למנוע שינויים בפרוטאום או בהמרה. פרוטוקולים אחרים מתארים את החיתוך של מבוגרים ifm עבור ויזואליזציה של כתמים gfp ב בודדים מיופיבריס39 או עבור כתמים של זחל גוף-השרירים הקיר58, אבל הם לא מטפלים בניתוח בשלבים גולמי או לבידוד של RNA או חלבון. גישה זו היא גם ברורה מן הפרוטוקול הקיים עבור מיקרוניתוח של גולמי ifms מ-קריוסעיפים38, אשר עשוי לייצר דוגמה לטהור ifms אבל הוא יותר עבודה אינטנסיבית ומייצרת פחות חומר. לעומת אחרים מהירה ביותר מהיר הפרוטוקולים ifm לנתיחה38,39, ifm מבודדים במאגר PBS ללא אבקת כדי להגביל אינדוקציה מתח ושינויים ביטוי העיקריים אחרים.
ההתקדמות המפתח בפרוטוקול זה היא הכללה של עיתונאי חי, פלורסנט, המאפשר בידוד של ifms בשלבים גולמי מוקדם. אנו משתמשים באופן בMef2-GAL459 נהיגה או uas-CD8:: gfp או Uas-gfp:: גמה60. זה מאפשר תיוג דיפרנציאלי של ifm (שרירי הטיסה הם בעלי תווית חזקה יותר בצורה שונה מאשר שרירי גולמי אחרים), כמו גם ביצועים של GAL4-uas מניפולציות מבוססי, למשל הצלה או ניסויים rnai. ניתן גם לשלב Mef2-GAL4 עם אמבטיה-GAL80Ts כדי להימנע rnai-הקשורים מוקדם למניעת הרמוניה או עם uas-Dcr2 להגדיל את היעילות rnai40.
ישנם מנהלי התקנים GAL4 נוספים או gfp-קווים זמינים המשתנים בספציפיות לסוג השריר, תבנית ביטוי זמני וחוזק מנהל התקן19,61 שניתן להשתמש בהם במקום Mef2-GAL4. לדוגמה, Act88F-GAL4 מבוטא לראשונה סביב 24 h apf, כך שלא ניתן להשתמש בו עבור נקודות זמן קודמות; עם זאת, זה מאוד לתייג IFM והוא עשוי להיות שימושי כדי להימנע RNAi-הקשורים מוקדם הקשורות. אותו-Gfp או Act88F-GFP התווית ifm, שוב עם הגבלות הזמן, אבל הם להימנע GAL4 התלות של ביטוי סמן יכול להיות שימושי בשילוב עם רקע מוטציה של עניין. רשימות של שורות סמן אפשריות אחרות זמינות19. יש לציין גם כי השימוש טרנסגנים ו GAL4/UAS מערכת עלולה לגרום לכלוכים ביטוי גנים, כך חשוב להשתמש בפקדים מתאימים, למשל קו הנהג חצה את זן הרקע מסוג פראי, כך חפצים כאלה הם ככל הנראה אותו הדבר בכל הדגימות.
עם הווידאו הנלווה, זה פרוטוקול מפורט שואפת להפוך גולמי ifm לבצע ניתוח נגיש יותר ולקדם את השימוש בגישות omics ללמוד פיתוח שרירים. הזיווג של הכוח של דרוזוהילה גנטיקה וביולוגיה של התאים עם הביוכימיה והאומניקס מציע נגישות דרך גזור ifm יש את הפוטנציאל לקדם הבנה מכניסטית של מיוגנזה ותפקוד השריר. מחקרים עתידיים המקשר בין מערכות תצפיות ברמה של בקרת השליטה והפרוטקות כדי פלטי מטבולית ופונקציונלי יספק הבנה עמוקה יותר של השריר סוג מסוים התפתחות הפתוגנזה של הפרעות שריר.

טכנולוגיות מודרניות מספקות תובנות חשובות לפיתוח שרירים ומנגנונים המשמשים כבסיס להפרעות בשריר האדם. לדוגמה, ניתוח של נתונים transcript בשילוב עם אימות גנטי וביוכימיים במודלים בעלי חיים חשף כי אובדן של גורם החדרת RBM20 גורם שריר הלב המורחבים בשל הרגולציה של רשת היעד של יותר מ 30 סרקומר גנים הקשורים בעבר עם מחלות לב, כולל titin1,2,3.
בדוגמה השנייה, מחקרים מתרבות התא, מודלים בעלי חיים, וחולים אנושיים הראו כי ניוון מיוטוני נגרמת על ידי שיבוש בתקנה RNA בשל קיבוע על של מוסקלעיוורים (mbnl) ו upregulation של CELF14,5. הדינמיקה בין הרגולציה והזמן בין MBNL ו CELF1 (נקרא גם CUGBP1 או ברונו-כמו 2) לעזור להסביר את דפוסי שחבור עובריים מתמשך בחולי ניוון מיוכי. בנוסף, רשת גדולה של מטרות מוסדרות עוזר להסביר את האופי המורכב של המחלה4,6,7,8. רוב מחקרים כאלה לנצל גישות omics באורגניזמים מודל גנטי כדי להבין את המנגנון הבסיסי מחלת השריר האנושי. יתר על כן, הם להדגיש את החשיבות של הבנה הראשון הזמני ורקמות מסוג ספציפי ביטוי גנים, שינוי חלבון, דפוסי חילוף החומרים בשריר בריא כדי להבין שינויים בשריר חולה או מזדקן.
דרוזופילה מלאנוסטר היא עוד אורגניזם מודל גנטי מבוסס. המבנה של סרקומר, כמו גם רכיבי סרקומר הפרט נשמרים מאוד מפני זבובים לחוליות4,9,10, ואת שרירי הטיסה עקיף (ifms) הפכו מודל רב עוצמה כדי ללמוד היבטים מרובים של פיתוח שרירים11,12. ראשית, שרירי הטיסה fibrillar הם מבחינה פונקציונלית ו מורפולוגית ברורים מפני שריריהגוף הכרישים 11,13, המאפשר חקירה של סוג שרירים מנגנונים התפתחותיים ספציפיים. גורמים שעתוק כולל Spalt מז (Salm)14, אקסטרדנטילה (exd), ו הומוחזה (hth)15 זוהו כמו fibrillar הגורל הרגולטורים. בנוסף, במורד הזרם של salm, CELF1 הומולוג Bruno1 (Bru1, רט) מנחה תוכנית שחבור מיוחדת לfibrillar,16,17.
שנית, ifms הם מודל חשוב להבנת התהליך של מיוגנזה עצמה, מן היתוך myoblast חוז ומיוטוטר מצורף myofibrillogenesis ו סרקומר התבגרות9,18,19. שלישית, הגנטיקה דרוזופילה מאפשרת חקירת תרומות על ידי חלבונים בודדים, תחומים של חלבונים וחלבון איזוforms למערך, תפקוד ומאפיינים ביופיזיים20,21,22 ,23. לבסוף, מודלים ifm פותחו למחקר של הפרעות שרירים אנושיים מרובים, כגון ניוון מיומני, myofibrillar myopathies, הפרעות ניווניות שרירים, actinopathies, וכו '24,25,26 ,27, וסיפקו תובנות חשובות למנגנוני מחלות ולטיפולים פוטנציאליים28,29,30. לפיכך, דרוזופילה הוא מודל שימושי לטיפול בשאלות פתוחות רבות בתחום המויוגנזה, כולל מנגנונים של תמלול מסוג שרירים, שחבור ורגולציה, כמו גם לתפקיד חילוף החומרים בהתפתחות השריר. היישום של טכנולוגיות omics המודרנית, במיוחד בשילוב עם מגוון רחב של גנטי, ביולוגי, הביוכימיים וביולוגיים הסלולר הזמין ב Drosophila ילה, יש את הפוטנציאל לקדם באופן דרמטי את ההבנה של השריר פיתוח, הזדקנות ומחלות.
Ifms הם השרירים הגדולים ביותר בזבוב, פורש כמעט 1 מ"מ על פני כל אורך החזה במבוגרים31,32. עם זאת, גודל קטן זה מייצר את האתגר של קבלת מספיק מדגם כדי להחיל טכנולוגיות omics ב Drosophila ילה באופן מסוים רקמה סוג. יתר על כן, ifms הם חלק השרירים מבוגרים שנוצר במהלך שלבים גולמי. הפתיל myoblasts חזיק ליצור מיופופרות, אשר לצרף הגידים סביב 24 שעות לאחר היווצרות puparium (apf) ולעבור שלב דחיסה הכרחי כדי ליזום myofibrillogenesis סביב 30 h apf (איור 1a-D)18,33, 34.
סיבי מיואז לצמוח לאורך כל אורכו של בית החזה, עם מיופילס עובר שלב הצמיחה הראשונית התמקדו סרקומר בנוסף עד כ 48 h apf, ולאחר מכן מעבר לשלב התבגרות, שבו סרקומר לגדול באורך וברוחב והם שופצה להקמת מתיחה הפעלה על-ידי 72 h apf (איור 1A-D)32,35. התחלתה של התבגרות סיבים הוא לפחות נשלט באופן חלקי על ידי salm ו-E2F32,36,37, ומספר מרובים של החלבון ifcomere הספציפי שחבור נשלט על ידי Bru1 משולבים במהלך זה שלב16,17. זבובים מבוגרים לאבד מ 90-100 h APF. משמעות הדבר היא כי כדי ללמוד פיתוח שרירים, ifm צריך להיות מבודד עם כמות מספקת, איכות, טוהר ממספר נקודות גולמי מרובים כדי להקל על ניתוח באמצעות omics גישות.
מספר פרוטוקולים לניתוח IFM פורסמו. למרות שפרוטוקולים אלה פועלים היטב עבור היישומים המיועדים שלהם, אף אחד מהם אינו אידיאלי לגישות של omics. פרוטוקולים השמרו על מורפולוגיה ifm עבור מערכת חיסונית של גולמי ומבוגרים ifm19, לבודד סיבי ifm עבור הערכה מכנית31, או לנצל מיקרוניתוח של גולמי ifm מ-קריוסעיפים38 הם מיוחדים מדי זמן ו עבודה אינטנסיבית כדי להשיג באופן סביר כמויות מספיקות של רקמות IFM עבור יישומים omics. פרוטוקולים אחרים פותחו לניתוח מהיר של במיוחד בוגרים ifm38,39, ולכן הם לא חלים על שלבים גולמי, ולהשתמש במאגרים שאינם אידיאליים או יכול להיות לא תואם, למשל, RNA בידוד. לכן, יש צורך לפתח גישות חדשות כדי לבודד גולמי ifm עבור יישומים ביוכימיה או omics.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח של ifm במהלך שלבים גולמי שנעשה בהצלחה עבור ניתוח mrna-Seq מ 16 h apf דרך מבוגרים שלבים16,32. הפרוטוקול מעסיק חלבון פלורסנט ירוק (gfp) תווית כדי לזהות את ifms בכל שלבי התפתחות גולמי ומבוגרים, המאפשר לבתר את החיים תחת מיקרוסקופ מנתח פלורסנט. הגישה הינה פחות אינטנסיבית לעבודה, עם תפוקה גבוהה יותר מאשר פרוטוקולי הניתוח הקיימים של IFM. זה מאפשר בידוד מהיר והקפאה של דגימות, יצירת חומר מספיק לאחר מספר סיבובים של ניתוח לגישות omics כמו גם עבור שרשרת סטנדרטית הפוכה בשרשרת התגובה (RT-PCR) או בלוק המערבי.
אנו מציגים את הפרוטוקול בשני חלקים, הדגמת כיצד לנתח במהירות ifms לפני 48 h apf (במהלך הגלגול המוקדם, כאשר קבצים מצורפים ifms הם יותר קלוש) ולאחר 48 h apf (כאשר תוכנית הגוף גולמי וקבצים מצורפים ifms מוגדרים היטב). אנו מדגימים כי אנו יכולים לבודד RNA באיכות גבוהה מ גזור IFMs בכל זמן והצגת נתונים על גישות שונות כדי בידוד RNA ושעתוק הפוכה. לבסוף, אנו מדגימים את היישום של פרוטוקול הניתוח ל-mRNA-Seq, ספקטרומטר מסה, ו-RT-PCR באמצעות CELF1 הומולוג Bruno1 כדוגמה. אנו מציגים ביטוי מיותר של החלבון סרקומר בנתונים פרוטקומקס מ Bruno1 מוטציה ifm ולבחון Bruno1 רגולציה של C-טרמינל אחוי האירוע של שרשרת כבדה רירן (mhc). תוצאות אלו מתארות כיצד הנתונים של omics יכולים לספק הבנה עמוקה יותר של תופעות ביולוגיות, ומשלימים ניסויים גנטיים וביוכימיים.

<table><tbody><tr><td>5x High Fidelity (HF) buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>F518L</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ כלי תרבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643084-600EA</td><td>כלי גריינר, 60 מ"מ x 15 מ"מ, מאוורר</td></tr><tr><td>כלי חיתוך שחור (זכוכית)</td><td>Augusta Laborbedarf</td><td>42021010</td><td>Lymphbecken, זכוכית שחורה, 4 ס"מ x 4 ס"מ</td></tr><tr><td>כלי חיתוך סיליקון שחור: אבקת פחם פעיל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9157</td><td>ניתן להשיג גם ברוב בתי המרקחת</td></tr><tr><td>כלים לניתוח סיליקון שחור: Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>הכלים מיוצרים על ידי ערבוב הסילגארד (~50 גרם) עם אבקת פחם פעיל (200 מ"ג) וריפוי בכלי פטרי (~4 כלי 60 מ"מ).</td></tr><tr><td>עלי כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td>כל עלי גלולה שניתן לעקר, ניתן להשתמש בו גם עם מטחנה מונעת</td></tr><tr><td>מצלמת טלפון סלולרי, Samsung Galaxy S9</td><td>Samsung</td><td>SM-G960F/DS</td><td>המשמש לתמונות שלא צולמו תחת מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,0500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי, Leica SP8X זקוף קונפוקלי</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי www.leica-microsystems.com, Zeiss LSM 780 קונפוקלי הפוך</td><td>Zeiss</td><td></td><td>www.zeiss.com</td></tr><tr><td>סרט מקל כפול</td><td>סקוטש/3M</td><td>3M ID 70005108587</td><td>סרט דו צדדי, זמין ברוב המטפלים בציוד משרדי</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Inox קצה ישר 11 ס"מ, דרגת ביולוגיה עם קצה 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ</td></tr><tr><td>EtOH (100%, RNase חינם)</td> מצלמת מיקרוסקופ פלואורסצנטי <td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>, מצלמת Leica DFC310 FX</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica Application Suite (LAS) גרסה 4.0.0</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>www.leica-microsystems.com זבוב: Bru1 [M2]</td><td></td><td></td> <td>מלאי זבוב; מאמר זה</td></tr><tr><td>זבוב: Bru1 [M3]</td><td></td><td></td><td>Fly stock; נייר זה</td></tr><tr><td>זבוב: Mef2-GAL4</td><td>מרכז המניות בלומינגטון</td><td>BDSC:27390</td><td>זבוב סטוק</td></tr><tr><td>זבוב: salm[1]</td><td>מרכז המניות בלומינגטון</td><td>3274</td><td>זבוב סטוק</td></tr><tr><td>זבוב: salm[FRT]</td><td></td><td></td><td>זבוב מלאי; ראה Spletter et al., Elife, 2018</td></tr><tr><td>זבוב: UAS-Bru1IR</td><td>מרכז המחקר וינה דרוזופילה</td><td>GD41568</td><td>זבוב, RNAi סיכת ראש</td></tr><tr><td>זבוב: UAS-GFP::GMA</td><td>מרכז המניות של בלומינגטון</td><td>BDSC:31776</td><td>זבוב סטוק</td></tr><tr><td>זבוב: UAS-mCD8a::GFP</td><td>בלומינגטון סטוק</td><td>סנטר BDSC:5130</td><td>זבוב סטוק</td></tr><tr><td>זבוב: w[1118]</td><td>בלומינגטון סטוק</td><td>סנטר 3605</td><td>זבוב סטוק</td></tr><tr><td>זבוב: weeP26</td><td></td><td></td><td>זבוב מלאי; ראה קליין ואחרים, גנטיקה, 2003</td></tr><tr><td>GFP זיהוי ריאגנט, GFP-Booster</td><td>ChromoTek</td><td>gba488-100</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה, פוטושופ CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>www.adobe.com</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>2-פרופנול</td></tr><tr><td>שיטה 1 (בידוד RNA): TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>תמיסה מונופאזית גואנידיניום איזותיוציאנט ופנול</td></tr><tr><td>שיטה 2 (בידוד RNA): שיטה 1 + TURBO ערכה נטולת DNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM1907</td><td>בידוד TRIzol ואחריו טיפול בערכה להסרת DNA</td></tr><tr><td>שיטה 3 (בידוד RNA): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td> בידוד RNA <td>R2070S</td> של <td>Zymo Research</td> R2070S <td>ב-TRIzol, אך מעל עמודות מסחריות במקום להשתמש בהפרדת פאזה. טיפול מומלץ ב-DNase שבוצע עם Monarch Dnase I במאגר התגובה של Monarch DNase I.</td></tr><tr><td>שיטה 4 (בידוד RNA): RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>השתמשנו בטיפול ה-DNase שסופק. כדורי IFM הומוגניים במאגר RTL כפי שהוצע לרקמות בעלי חיים.</td></tr><tr><td>שיטה 5 (בידוד RNA): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td>יישמנו את הפרוטוקול עבור ' טיהור RNA מרקמות סיביות'.</td></tr><tr><td>שיטה 6 (בידוד RNA): ערכת Monarch Total RNA Miniprep New</td><td>England Biolabs</td><td>T2010G</td><td>יישמנו את הפרוטוקול עבור רקמות/לויקוציטים וליזה ב-300 &mu; L של מגיב הגנת RNA.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>AM12400</td><td>צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>תרמו פישר</td><td>12342108</td><td>שקופיות סטנדרטיות, לא טעונות, להבי מיקרוטום 1 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>PFM Medical</td><td>207500003</td><td>C35 נוצה 80 מ"מ</td></tr><tr><td>Monarch DNase I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>T2004-21</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNase I מאגר תגובה</td><td>חדש England Biolabs</td><td>T2005-21</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Thermo Fisher</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0480X</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Marabu</td><td>1910000000</td><td>Marabu Fino Round No. 0, או מברשת דומה מכל אספקת אמנות</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>טבליות מלח חוצצות פוספט לתמיסות 1 ליטר, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA PureTip קצות פיפטה</td><td>Elemental Scientific</td><td>ES-7000-0101</td><td>תחליף אופציונלי לקצות פיפטה סטנדרטיות להפחתת אובדן הדגימה; 100 מ"ל, פתח 0.8 מ"מ</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530XL</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5161</td><td>פיפטה אוניברסלית 200 מ"ל טיפים</td></tr><tr><td>Preomics iST 8x Kit</td><td>Preomics</td><td>P.O.00001</td><td>ערכת הכנת פפטידים לספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>Q ספקטרומטר מסה אקסאקטיבי</td><td>Thermo Fisher</td><td>725500</td><td>ספקטרומטריית מסה בוצעה ביחידת ניתוח החלבונים של המרכז הביו-רפואי LMU</td></tr><tr><td>Qubit ערכת בדיקת RNA Life</td><td>Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>רודמין-פלואידין</td><td>Invitrogen, בדיקות מולקולריות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10063052 ריכוז RNA גישה 1 & עקבות שלמות RNA, Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>ריכוז RNA גישה 2, Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNA ריכוז גישה 3, קיוביט 4 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA שבבי פיקו</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A7937</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא RNase, דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC מטפלים במים למשך הלילה ולאחר מכן אוטוקלאב, כדי להסיר את כל ה-RNase.</td></tr><tr><td>ערכת RT #1: ערכת תמלול הפוך Super Script III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td>ערכת תמלול הפוך</td></tr><tr><td>ערכת RT #2: ערכת</td><td>תמלול הפוך</td>של LunaScript <td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td></tr><tr><td>ערכת RT #3: ערכת תמלול הפוך של QuantiNova ערכת תמלול הפוך</td><td>Qiagen</td><td>205410</td><td></td></tr><tr><td>מאגר הרכבה לשקופיות, מעבדות וקטור Vectashield</td><td></td><td>H-1200</td><td>מכיל DAPI</td></tr><tr><td>תוכנה סטטיסטית: GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>תוכנה סטטיסטית: Microscoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>נרכש במסגרת החבילה: Office Home & סטודנט 2019</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>5405000760</td><td>Eppendorf צנטריפוגה 5425 או שווה ערך</td></tr><tr><td>רקמות / Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td>מגבוני טישו סטנדרטיים</td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350796</td><td>פיפטה מפלסטיק</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td> <td>קפיציים של VannasFine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>3 מ"מ קצה חיתוך, קוטר קצה 0.05 מ"מ, אורך 8 ס"מ</td></tr><tr><td>נייר Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004-070</td><td>עיגולי נייר סינון, כיתה 4, 70 מ"מ</td></tr></tbody></table>

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר תהליכים מגוונים כגון רגולציה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכנילוגיה, המשפיעים על פיתוח שרירים וmyofibrillogenesis. נתונים מסוג omics, כגון אלה המופקים על ידי ספקטרומטר מסה או רצף עמוק, יכולים לספק תובנות מכניסטיות חשובות לתהליכים ביולוגיים אלה. עבור גישות כאלה, מועיל לנתח דגימות ספציפיות לרקמות כדי להגביר את הסלקטיביות והספציפיות של טביעות האצבעות של האומניקס. כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי לייצר דגימות שריר מועשר ביותר עבור יישומים omics. אנו מתארים תחילה כיצד לנתח את שרירי הטיסה בשלבים גולמי מוקדם (< 48 h לאחר היווצרות puparium [apf]), כאשר השרירים ניתן להבחין על ידי חלבון פלורסנט ירוק (gfp) תיוג. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את השרירים מהגלמים המאוחרים (> 48 h APF) או מבוגרים, כאשר השרירים ברורים מתחת למיקרוסקופ מבתר. פרוטוקול הווידיאו הנלווה יהפוך את הניתוח התובעני של הניתוח ליותר נגיש בפני שרירים וקהילות מחקר . עבור יישומי RNA, אנו מתוך שיטת הכמות והאיכות של RNA שניתן לבודד בנקודות זמן שונות ובגישות שונות. אנחנו עוד מראים כי Bruno1 (Bru1) הוא הכרחי עבור משמרת זמנית בשרשרת רירן שרשרת כבדה (Mhc) שחבור, הוכחת כי השרירים ניתן להשתמש עבור mrna-Seq, ספקטרומטר המסה, והפוך שעתוק פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) יישומים. פרוטוקול הניתוח הזה יסייע לקדם ניתוחים ספציפיים לרקמות והוא יכול להיות מיושם בדרך כלל כדי ללמוד היבטים ביולוגיים מרובים של מיוגנזה.

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

הפרוטוקול מקל על ניתוח של שריר טיסה עקיף שכותרתו GFP מ Drosophila בנקודת זמן שונים במהלך התפתחות גלמים כדי להעריך שינויים בביטוי גנים וחלבון. באמצעות טכניקות אלה, ניתן להשיג דגימת שרירי טיסה מועשרת גבוהה עם השפלה מינימלית של חלבון RNA המתאימה ל-RT-PCR, כתם מערבי או גישות אומיות. ניתוחים מיוחדים אלה דורשים תרגול ומיומנות, אך מספר הגלמים שניתן לנתח ואיכות הדגימות משתפרים עם הניסיון.הדגמה חזותית של ניתוח זה היא קריטית לקביעת האופן שבו ניתן להבחין בין שרירי טיסה לבין רקמות שאינן שרירים ולהקל על הבידוד המהיר של שרירי הטיסה מדגימות הפופאליות. כדי לביים את הגלמים, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי לאסוף ולהעביר לפני הגלמים לצלחת פטרי 60 מ"מ, וסקס הגלמים תחת מיקרוסקופ משקפת. זכרים מזוהים על ידי נוכחות של אשכים, המופיעים כגלובוסים שקופים על הגלמים אטומים אחרת.לאחר תיוג המנה עם השעה, התאריך והגנוטיפ של הזבובים, מזדקנים הגלמים באינקובטור של 25 עד 27 מעלות צלזיוס עד לשלב המתאים. עבור ניתוח IFM לפני 48 שעות APF, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי להעביר את הגלימה המבוימת כראוי לצלחת ניתוח שחורה בערך 2/3 מלאה ב- PBS מקורר. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, השתמש 5 מלקחיים כדי לדחוף את אחד הגלמים לתחתית צלחת ניתוח שחור.כוונן את גודל התצוגה של המיקרוסקופ והתמקד עד שניתן יהיה לדמיין בבירור את הגלמים. באמצעות זוג אחד של ממטרים כדי לתפוס את החלק העליון של הגולה, לתקוע את הגולה עם קצה אחד של זוג שני של מדפים, מעט מחוץ למרכז בבטן, ממש מאחורי בית החזה. השתמש בזוג המדפים הראשון כדי להסיר את החצי הראשון של מארז הגופל, ולצבוט את הגלם החשוף ממש מאחורי בית החזה כדי להפריד את הבטן מבית החזה.לאחר מכן, לסחוט בעדינות את החלק הראשון של בית החזה כדי לחשוף את IFMs שכותרתו פלואורסצנטי. לאחר מכן, השתמש במדפים כדי להשליך את הפגר הנותר לצד הנגדי של המנה, ול לנתח את הגלמים הבאים באותו אופן. כאשר כל הגלמים נותאו, השתמש במלקחיים כדי לאסוף את סיבי ה- IFM, וארגן את הסיבים לערימה בתחתית צלחת הת לנתח שחור.השתמש במטחנים כדי לדחוף את כל הפסולת מחוץ לשדה המבט, ולהסיר את כל השרירים שאינם IFM, שומן, cuticles, או רקמה לא רצויה אחרת מן הדגימות. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה קצוץ כדי להעביר את הערימה של IFMs לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 250 microliters של PBS מקורר. עבור ניתוח IFM לאחר 48 H APF, השתמש במברשת צבע רטובה קלות כדי להעביר את הגלימה המבוימת לרצועה של סרט דביק דו-צדדי המותקן על שקופית מיקרוסקופ.כוון את הגלמייה בשורה, צד הגחוני כלפי מטה, וחזיתי לכיוון תחתית השקופית. כאשר כל הגלמים הונחו, השתמש במטליות כדי להקניט ולפתוח את המארז הגומי הראשון מעל הצריחים האחוריים, ולהחליק בעדינות זוג מדפים באופן דורסי, לכיוון האחורי, חיתוך המקרה הגופל כמו המדפים לנוע. שחררו את הגלמים מהתיק שנפתח, ומיד מעבירים את הגלמים לירידה של PBS בשקופית מיקרוסקופ שנייה.כאשר כל הגלמים משוחררים, השתמש במספריים עדין כדי לחתוך את הבטן של הגלמים הרחק מבית החזה, ולדחוף את הבטן לתוך ערימה נפרדת. כאשר כל בית החזה הוסרו, להשתמש בפיסת נייר טישו כדי להסיר את רוב PBS ואת ערימת הבטן. מוסיפים טיפה של PBS טרי ומצונן לבית החזה הנותר, לפני השימוש במספריים כדי לחתוך מהראש לאורך ציר הגוף האורך בתנועה אחת כדי לחלק את בית החזה לשניים.כאשר כל הגלמים נותחו, השתמש ב- 5 המדפים כדי לבחור אחד מההמיות, והכנס בעדינות את קצות המדפים מעל ומתחת לאמצע ה- IFMs. מחזיק את הזוג הראשון של מדפים עדיין, להשתמש מספריים בסדר לחתוך קצה אחד של IFM מן קוטיקל וגידים, לפני סיבוב הגלמים 180 מעלות, כדי לאפשר את הקצה השני של IFM להיות חתוך חופשי מן קוטיקל וגידים. השתמש במדפים כדי להעביר את צרור IFM מבית החזה לקצה בועת PBS, באמצעות מתח מים להחזיק את החבילה במקום.לאחר מכן, לדחוף את הפגר לצד הנגדי של השקופית, ול לנתח את שאר IFMs באותו אופן. כאשר כל IFMs נאספו, להשתמש 5 מדפים כדי להסיר כל שריר לקפוץ או שברי cuticle שאולי מצאו את דרכם לתוך הדגימות. לאחר מכן השתמש במתח מים כדי ללכוד בעדינות את ה- IFMs שנותחו בין זוג ממטרים, והצב את ה- IFMs בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטר של PBS מקורר.נתוני ריצוף mRNA מ- BRUNO1 IR IFMs מציגים שינויים בביטוי ברמת יחידת הגנים בהשוואה לנתונים של רצף סוגי בר. באמצעות ספקטרומטריית מסת פרוטאום שלמה על IFMs נותחו, ויסות דומה נצפתה ברמות החלבון והחלבון. לאחר החדרת קו מלכודת חלבון לאנטרון הסופי של Mhc, ניתן לראות את שילוב החלבון המסומן ב- GFP ב- IFM כשתי נקודות משני צדי קו ה- M ב- 90 H APF, בעוד ברקמת שריר הרגל ניתן לראות את אות ה- GFP באופן אחיד לאורך קו ה- M sarcomere.בעת שימוש ב- RT-PCR ב- IFM שנותח, ניתן לזהות מתג isoform Mhc מהאקסון 34 עד 37 בעל התווית GFP לאירוע אקסון ללא תווית 34 עד 35, בין 30 ל -48 שעות לאחר היווצרות הפופריום ב 27 מעלות צלזיוס. מנתוני רצף mRNA, רקמות שריר הרגל והקפיצה מבטאות את כל שלושת האיזופורמים של Mhc, תוך שמירה על ביטוי האיזופורם המסומן ב- GFP בשריר בוגר. הן המוטנט הגדול Spalt והן BRUNO1 IR-IFM, לא הצליחו לכבות את הביטוי של isoform Mhc שכותרתו GFP כפי שהם מתפתחים, וכתוצאה מכך פרופיל ביטוי isoform דומה לזה של רקמת שריר רגל לקפוץ.זכור כי הניתוחים צריכים להתבצע בתוך פחות מ -30 דקות כדי למנוע השפלה RNA. וגם, כדי לדאוג להגביל את הזיהום על ידי סוגי תאים אחרים. שיטה זו מייצרת דגימות מועשרות ב- IFM המתאימות לגישות ביוכימיות כגון RT-PCR, או כתמים מערביים, כמו גם גישות בסגנון אומי, כמו ספקטרומטריית מסה, רצף תפוקה גבוה, לכידת קונפורמציה כרומטינית ומטבולומיקה.ניתוחים אלה יכולים להשלים את הגישות הגנטיות החזקות בדרוסופילה עם נתונים ברמת המערכות לחקירת המנגנונים הבסיסיים של פיתוח ווויסות גנים.

dissection-drosophila-melanogaster-flight-muscles-for-omics

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פרוטוקול זה מדגים כיצד...

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת השלמות המבנית של צמתים עצביים-שריריים בשרירי האורך הגביים של דרוזופילה. ההליך כולל צביעת נוירונים ושרירים בשני נוגדנים נפרדים והשוואת דפוסי פלואורסצנטיות בין זבובים מוטנטיים לזבובי בר. הפחתה בכתמים עצביים בזבובים מוטנטיים מצביעה על ניוון עצבי, בעוד מבנה השריר נשאר שלם.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

. מדווחים שיטה לכמת שרירים באזור, אשר היא שיטה עקיפה כדי לקבוע את מסת השרירים במבוגרים דרוזופילה . נדגים היישום של המתודולוגיה שלנו על-ידי ניתוח הטיסה עקיף השרירים במודל דרוזופילה ממחלת ניוון שרירים חולים Myotonic.

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למדו חיתוך שרירי טיסה מסומנים ב-GFP מזחלי Drosophila melanogaster לניתוח אומיקס. השיטה מייצרת דגימות עשירות באיכות גבוהה עם מינימום פירוק RNA, מתאימות ל-RT-PCR וספקטרומטריית מסה.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

גלה סרטונים נוספים