Name: בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למד בידוד מיובלסטים ראשוניים משריר שלד עכבר לחקר מטבוליזם תאי שריר אקס ויוו. הפרוטוקול מספק אוכלוסיית תאי גזע גדולה יותר ומאפשר מחקר פיזיולוגי מפורט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה ד ר מתיו וואט באוניברסיטת מלבורן וד ר אנסטסיה קראלי באוניברסיטת ג'ונס הופקינס לסיוע אימוץ פרוטוקול זה מבוסס על העבודה של מומבל ואח '6. אנו גם מודים לד ר סבין ג'ורדן על סיוע בפיתוח ואימוץ הפרוטוקול הזה במעבדה שלנו. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות R01s DK097164 ו DK112927 כדי K.A.L.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של סקריפס מחקר.
1. איסוף ועיבוד של הרחבות רקמת שריר
<ol><li>ביום שלפני הניתוח, לחטא את כל הציוד לחיתוך (מלקחיים, סכיני גילוח, ומספריים) ולהכין את כל המדיה הנדרשת: פוספט באגירה מלוחים (PBS), מדיה ציפוי MB (12.5 mL של DMEM זיכרון, 12.5 mL של בשר החזיר F12, 20 מ ל של בחום מופעל העוברי שור סרום (FBS), 5 מ ל של תוספת בינונית של נוזל השפיר), ואת פתרון ציפוי (24 מ ל של DMEM, 24 מ ל של החזיר F12, 1.7 מ ל של קולגן, 1 מ ל של מטריצות).</li>
	<li>היום של הניתוח, מעיל אחד 6-ס מ צלחת עם ציפוי פתרון לכל שריר להיות גזור. הוסף 2 מ ל של פתרון ציפוי על פני השטח של כל צלחת, לנענע בעדינות כדי ליצור מעיל אפילו על פני השטח, ו מודקת את הצלחות עם פתרון ב 4 ° c עבור 1 h.</li>
	<li>הסר פתרון ציפוי מהלוחות וחזור לפתרון המניה. הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון הציפוי לשישה חודשים ויש לאחסנם ב-4 ° c.</li>
	<li>לשטוף את הצלחות פעמיים עם 2 מ ל של PBS להסיר קולגן לא מאוגד מטריצות.</li>
	<li>מניחים את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח.</li>
	<li>הכינו תא לח על-ידי הצבת 2-3 גיליונות של נייר סופג סמיך לשקית ניילון או מנה סטרילית בגודל 15 ס מ והשתמשו בפיפטה כדי להרטיב את המשטח של הנייר במים סטריליים.</li>
	<li>מניחים את התא תחת אור UV עבור 5 דקות לחטא.</li>
	<li>לנתח את השרירים הרצויים מעכבר בן 4 עד 8 שבועות. כדי לעקר את רקמת השריר, לשטוף בעדינות ב-PBS המכיל 40 μg/mL gentamicin. הערה: . שריר אחד לכל צלחת עבור הסוליה, plantaris ו אדי, לשלב שרירים משתי הרגליים בצלחת אחת.</li>
	<li>השתמש מלקחיים סטרילי להעביר את השריר לצלחת פטרי מצופה 10 ס"מ ללא ציפוי. הוסף 0.5-1.0 mL של ציפוי מדיה על השריר כך הרקמה היא לחה אך לא צף (איור 1A).</li>
	<li>השתמש בסכין גילוח סטרילי או תער כדי לחתוך בעדינות את השריר לרסיסים קטנים (כ 1-3 מ"מ3). הערה: חשוב למזער את הטיפול ברקמת השריר לקבלת התוצאות הטובות ביותר.</li>
	<li>השתמש מלקחיים או פיפטה כדי להעביר את שברי שריר על פני השטח של צלחת מצופה מראש 6 ס מ. בעדינות רבה יותר 0.8 מ ל של ציפוי מדיה על הרקמה. צריך להיות מספיק מדיה כדי לשמור את חתיכות הרקמה רטוב אבל לא צף (איור 1B).</li>
	<li>מניחים את 6 ס מ מנות המכילות את שברי שריר בתוך החדר הלח ולחזור לאינקובטור (37 ° c, 5% CO2) עבור 48 h (איור 1ג). הערה: זה חיוני כי שברי שריר לדבוק פני השטח של הצלחת כדי לאפשר את מחוז myoblast. אין להזיז את לוחות/חדר לפחות 48 h.</li>
	<li>לאחר 48 h, בדוק בקפידה את לוחיות הרישוי כדי לוודא שרסיסי השריר הדבקו. שכבת עם 2 מ ל של ציפוי מדיה, מטפל לא להוציא את השברים. הערה: אם יש זיהום או פסולת גלויים על הלוחות, לשטוף בזהירות את חתיכות השריר. צלחת 2 מ ל של הפתרון PBS/gentamicin בקצה הצלחת וטיפ בעדינות לשטוף את רקמת השריר. הוצא את ה-PBS וחזור על שלב השטיפה. לאחר השטיפה השנייה, שכבת-על 2 מ ל של ציפוי מדיה.</li>
	<li>שמרו את הצלחות בחממה 37 ° c למשך 3 ימים נוספים (5 ימים מניתוח מקורי) לפני איסוף myoblasts. תבדקו בכל יום אחר. לצמיחה של מכשולים הערה: המראה של תאים המתעוררים השרירים שרירים יהיה משתנה הטרוגנית. מקוצר ראשי מופיע כתאים קטנים, עגולים ובהירים. עם זאת, אין צורך ולא אמין לזהות אותם לפי הופעתם בשלב זה (איור 2).</li>
</ol>2. קציר הולך וגובר
<ol><li>להכין ולחמם טרום מדיה Myoblast (17.5 mL של DMEM 17.5 mL של בשר חזיר F12, 10 מ ל של FBS, 5 מ ל של נוזל השפיר תוסף בינוני), טריפסין, ו PBS/. מעיל אחד T25 בקבוקון לקבוצה שריר להיות שנקטפו עם פתרון ציפוי וכמתואר בשלב 1.2 (ראה טבלה 1).</li>
	<li>הסר מדיה ציפוי ולשטוף בעדינות את explants שרירים עם 2 מ ל של PBS/. הסר במהירות את ה-PBS (לשטוף צלחת אחת בכל פעם ואל תיתן את הצלחת לשבת PBS בשלב זה).</li>
	<li>מוסיפים בעדינות 1 מ ל של PBS/gentamicin ומניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 1 דקות.</li>
	<li>השתמש בפיפטה P1000 כדי לאסוף תאים PBS בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ ל.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ג של טריפסין לצלחת וחזרו לאינקובטור 37 ° c במשך 3 דקות. הקש בעדינות על לוחיות הרישוי. לאסוף את טריפסין/תאים ולשלב עם אוסף PBS. הוסיפו 8 מ ל של המדיה של מיאובאל בשפופרת הצנטריפוגה והיפוך עדין לערבוב.</li>
	<li>כיסוי בעדינות 2 מ ל של פתרונות ציפוי על לוחיות השריר ולחזור לחממה 37 ° c.</li>
	<li>ספין צינורות צנטריפוגה המכיל תאים בצנטריפוגה עבור 3 דקות ב 200 x g.</li>
	<li>להיות זהיר כדי להימנע. מגלולה סלולרית הוסיפו בעדינות את Myoblast מדיה (ראו לוח 1) והעבירו את התאים לבקבוקון המצופה מראש ומניחים בחממה 37 ° c. . זה הקציר P0 אם נצפתה תחת מיקרוסקופ, ייתכנו מעט מאוד תאים (איור 3).</li>
	<li>חזור על הקציר המתואר מעל כל יום אחר עד שלוש פעמים. לאחר הקציר השלישי, למחוק את האקסוצמחים.</li>
</ol>3. התרחבות והעשרה של מפיצים מתרבים
הערה: הקציר P0 יהיה הטרוגנית (~ 60% myoblasts חזיק). שני המעברים הבאים משתמשים ב-PBS כדי לקצור את היבול הסלקטיבי. רבים של תאים מחסיד יותר יישאר מאחור את myoblasts מתרבים במהירות יהיה ≥ 95% טהור בתוך 2 מעברים. לאחר הקמת מכשולים, הם צריכים להישמר בצפיפות נמוכה כדי למנוע בידול ספונטנית.
<ol><li>עבור כל T25 בקבוקון של ~ 40-50% בתאים confluent מסעיף 2, מעיל אחד T75 בקבוקון עם 5 מ ל של פתרון ציפוי ומקום ב 4 ° c עבור 1-4 h.</li>
	<li>הסר פתרון ציפוי מתוך מבחנות ולחזור לפתרון המניה. לשטוף את מבחנות פעמיים עם 2 מ ל של PBS/gentamicin ומקום בחממה 37 ° c.</li>
	<li>מP0 את התקשורת. מצלוחיות T25 מאובאלי לשטוף את התאים בקצרה עם 2 מ"ל של PBS חם/gentamicin. . הייתי מבין את הPBS מהבקבוקון הערה: מטרת שלב זה (3.3) היא להפחית את האפשרות של זיהום חיידקי. אם מבוצע במהירות ובעדינות, זה לא צריך לגרום לאובדן של myoblasts. ניתן להשמיט אותו כדי למקסם את שימור מחוז myoblast אם תרצה.</li>
	<li>פיפטה 2 מ ל של PBS חם (לא טריפסין) לתוך כל בקבוקון המכיל myoblasts. מניחים את מבחנות עם PBS לתוך החממה 37 ° c עבור 3 דקות. הערה: מיאובלי צריך להתנתק בקלות מצלוחיות עם PBS. השימוש ב-PBS במקום בטריפסין בשלב זה הוא קריטי להפחתת הזיהום של אוכלוסיית myoblast חוז עם סוגי תאים אחרים.</li>
	<li>הסר את התאים מהאינקובטור 37 ° c ומצד הברז החזק של מבחנות כדי להוציא את התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ קל עבור מכשולים צף בחופשיות.</li>
	<li>מניחים את מבחנות זקוף במכסה התרבות רקמה ולשטוף את החלק התחתון של מבחנות עם 10 מ ל של Myאובלסט מדיה 2-3 פעמים כדי להבטיח את כל התאים הם במקומם.</li>
	<li>לאסוף את תערובת התא/מדיה בשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל. צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 200 x g.</li>
	<li>. להיזהר למנוע את הגלולה הסלולרית הוסף בעדינות כמות מתאימה של מדיית Myoblast לצינורית צנטריפוגה וערבבו בעדינות.</li>
	<li>הפץ את תערובת התא לצלוחיות T75 חדשות. הוסף 10 מ ל של Myoblast מדיה לכל חדש T75 בקבוקון. לנער בעדינות את מבחנות אופקית כדי לפזר את התאים ומניחים בחממה 37 ° c בלילה.</li>
	<li>יומיים לאחר מכן, מעבר פעם נוספת עם PBS, פיצול כל T75 בקבוקון לתוך שלושה T75 צלוחיות. הערה: אל תאפשר myoblasts להיות יותר מ 50%-60% confluent, כמו זה יגרום להם להתחיל להבדיל ולאבד קיבולת prolifaterive.</li>
	<li>למעברים נוספים, השתמשו בטריפסין. הפסנת פעמיים עם התשואות של PBS > 95% מקוצר; ניסיונות לשפר עוד יותר את הטוהר נוטה לגרום בידול עניים.</li>
</ol>4. הבדלה של מיאובלי ראשוני ליופופרות
<ol><li>לוחית P2 (או מעבר מאוחר יותר) myoblasts חזיק במדיה של מיאובלסט על צלחות מצופות (ראה שולחן 1 לציפוי מוצעים וכלי ציפוי ומספרי תאים). שניים או שלושה ימים לאחר מכן, כאשר התאים הם ב 70-80% שליטה, לשנות את המדיה לבידול מדיה (24 מ ל של DMEM, 24 מ ל של חזיר F12, 1.5 מ ל של סרום מופעל בחום, 0.5 מ ל של אינסולין-סלניום-העברה).</li>
	<li>שינוי בידול מדיה בכל יום אחר במהלך הבידול של מכשולים ראשוניים לתוך מיוכי. בידול הוא בדרך כלל להשלים לפי יום 4-5 ויסומן על ידי תאים מאורכים, התמזגו באופן ספונטני עווית. בצע ניסויים על מיולים מובחנות תוך 6 ימים. בדרך כלל תאים הם חמישה או שישה ימים לאחר התחלת בידול.</li>
</ol>5. מדידת שיעור צריכת החמצן במינורות או ביויומטרים ב 96-צלחות ועוד
<ol><li>מעיל 96-ובכן צלחות עם 25 μL של פתרון ציפוי לכל טוב. צנטריפוגה את לוחיות ב 58 x g עבור 1 דקות כדי להסיר בועות כלשהן.</li>
	<li>מודאת לוחיות הרישוי בפתרון ציפוי עבור 1-4 h ב -4 ° c. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי להסיר את הפתרון ציפוי ולשטוף שלוש פעמים ב 25 μL של הקרה PBS/gentamicin. צנטריפוגה לפחות אחד מאותם שוטף כדי להבטיח כי בועות לא לכודים.</li>
	<li>הוסף 40 μL של בידול מדיה לכל באר. צנטריפוגה את התקשורת על צלחת מצופה ללא תאים עבור 1 דקות ב 58 x g כדי למנוע בועות ולהסיר את המתח פני השטח כדי לקבל שכבה אחידה של מדיה.</li>
	<li>הוסף תאים שהושעו ב-40 μL נוסף של מדיה לכל באר. ספין שוב ב 58 x g. הערה: העקביות בציפוי חשוב עבור התוצאות הטובות ביותר ואת מספר התאים מצופה לכל טוב צריך להיות ממוטב עבור כל התקנה ניסיונית, וסביר להניח בטווח של ~ 10000-25000 myoblasts מצופה מדיה בידול לכל טוב של צלחת 96-באר.</li>
	<li>שנה בעדינות את המדיה היומית במהלך בידול. אין להוריד את המדיה אלא להסיר אותו בעזרת פיפטה, להשאיר את הנפח הקטן מאחור כדי להימנע מפירוק התאים או לחשוף אותם לאוויר. לדוגמה, החלף 50 μL בכל פעם עבור שלוש חזרות ולא את כל 80 μL בו.</li>
	<li>השתמש 8-15 בארות לכל תנאי. ייתכן שיהיה צורך להשמיט כמה בארות אם התאים אינם יוצרים שכבה אחידה של מיומים. הערה: השמט בארות על קצות הצלחת כי הם רגישים מאוד התאיידות. לשנות את כיוונון הצלחת לשכפל ניסיוני כדי למנוע שגיאות שיטתיות.</li>
	<li>לבצע את הצורך הרצוי על מיולים הבדיל בתוך 1-2 ימים של בידול מלא (יום 4-6 מתחילת בידול). מכשירים מומלצים וריאגנטים למדידת שיעורי צריכת החמצן מפורטים בטבלת החומרים.</li>
</ol>

<ol><li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li>
<li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li>
<li>Sjøberg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li>
<li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation%2C+differentiation%2C+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li>
<li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li>
<li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Musarò, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li>
<li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li>
<li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li>
<li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li>
<li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li>
<li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li>
<li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+%CE%B1-glucosidase+deficient+mice%3A+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li>
<li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917(2018).</li>
<li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li>
<li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis%2C+oxidative+capacity%2C+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li>
</ol>

שריר השלד חיוני להקמת ותחזוקה של הומאוסטזיס מטבולית11. המחקר של הפיזיולוגיה שרירים הוא מסובך על ידי השונות הבינאישית, כמו גם קושי להשיג דגימות, במיוחד במקרה של מחקרים אנושיים. מיולים הראשי מתורבת הוכחו לכידה של תכונות רבות של פיזיולוגיה שרירים, כולל סידן הומאוסטזיס12, התחדשות של רקמת שריר פגום5, שינויים מטבוליים בתגובה לתרגיל13, ו שינויים בחילוף החומרים כתוצאה ממחלות כגון סוכרת14. התרבות הראשית של myobl...

בעוד מצוטט לעתים קרובות כאינדיקציה לבריאות מטבולית כוללת, מחקרים מרובים הראו כי מדד מסת הגוף (BMI) אצל מבוגרים לא קשורה בעקביות עם סיכון גבוה יותר של תמותה. עד כה, הגורם היחיד המוצג להיות עקבי עם תמותה מופחתת באוכלוסייה זו הוא מוגבר מסת השריר1. רקמת השריר מייצגת את אחד המקורות הגדולים ביותר של תאים רגישים לאינסולין בגוף, ולכן הוא קריטי בתחזוקת הומאוסטזיס הכולל מטבולית2. הפעלה של רקמת שריר השלד באמצעות פעילות גופנית קשורה מגדילה הן רגישות מקומית אינסולין הכולל בריאות מטבולית3. בעוד במודלים vivo חיוניים לחקר הפיזיולוגיה שרירים ההשפעה של תפקוד שרירים על חילוף החומרים משולב, התרבויות הראשיות של מיוכי מספקים מערכת צייתן המפחית את המורכבות של מחקרים בעלי חיים.
מוביאוטיבי נגזר השרירים שלאחר לידה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של הטיפול בתנאים רבים והצמיחה באופן מאוד מיוניתן. זה כבר מזמן הוכרה ומספר שיטות לבידוד myoblast חוז ותרבות תוארו4,5,6,7,8,9. חלק מהשיטות הללו משתמשות בשרירי הילדים ומפיקות מספר נמוך יחסית של myoblasts חזיק5,8, המחייב כמה בעלי חיים למחקרים בקנה מידה גדול יותר. כמו כן, השיטות הנפוצות ביותר לשימוש בשיטת "ציפוי מקדים" להעשרת עבור myoblasts אשר הם פחות חסיד מאשר סוגי תאים אחרים. מצאנו את שיטת ההעשרה החלופית המתוארת כאן כדי להיות הרבה יותר יעילה ומיושבה להעשרת אוכלוסיית מחוז מאוד מתרבים. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר את הבידוד של myoblasts צמיחה מאוד מתרבים מפני השרירים הצעירים explants בוגרים, באמצעות צמיחה לתוך מדיה התרבות. ניתן לקצור את המכשולים שוב ושוב, במשך מספר ימים, להרחיב במהירות, והמושרה כדי להבדיל לתוך שפופרות. פרוטוקול זה מייצר מספר רב של תאי מחוז מיאובלי בריאים אשר מבדילים באופן ספונטני מיופופרות. הוא איפשר לנו ללמוד חילוף החומרים ומקצבים מעגליות ב מיוכי הראשי של עכברים של מגוון של גנוסוגים. לבסוף, אנו כוללים שיטות להכנת מיוצינורות לחקר מטבוליזם חמצוני, באמצעות מדידות של שיעורי צריכת החמצן ב 96-לוחיות.

<table><tbody><tr><td><תמיסת ציפוי >חזקה: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>יש להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>1.7 מ"ל</td></tr><tr><td>מטריג'ל</td><td>פישר</td><td></td><td>CB40234A 1 מ"ל</td></tr><tr><td><חזק>חומרי ציפוי: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 12.5 מ"ל</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 12.5 מ"ל</td></tr><tr>FBS <td>Life Technologies</td><td>מומת בחום</td><td>16000044</td><td>20 מ"ל; ניתן לרכוש כ-FBS רגיל ומנוטרל בחום על ידי הכנסת 40 מעלות; אמבט מים C למשך 20 דקות</td></tr><tr><td>Amniomax</td><td>Life Technologies</td><td>12556023</td><td>5 מ"ל</td></tr> <tr><td><חזק>Myoblast מדיה:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>גיבקו</td><td>10569010</td><td>להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 17.5 מ"ל</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 17.5 מ"ל</td></tr><tr><td>חום FBS</td><td>Life Technologies</td> מושבת <td>16000044</td><td>10 מ"ל; ניתן לרכוש כ-FBS רגיל ומנוטרל בחום על ידי הצבה ב-40 מעלות; אמבט מים C למשך 20 דקות</td></tr><tr><td>Amniomax</td><td>Life Technologies</td><td>12556023</td><td>5 מ"ל</td></tr> <tr><td><חזק>מדיית בידול: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל</td></tr><tr><td>חום סרום סוס מושבת</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>אינסולין-סלניום-טרנספרין</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>0.5 מ</td></tr><tr><td><חזק>חומרים אחרים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td>הכן כ -10% DMSO במדיה Myoblast להקפאת תאים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר Whatman</td><td>VWR</td><td>21427-648</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>734-2318</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ</td><td>VWR</td><td>25382-428 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>T25 צלוחיות</td><td>ThermoFisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T75 צינורות</td><td></td> צנטריפוגה <td>ThermoFisher</td> 156499 <td></td></tr><tr><td>(15 מ"ל)</td><td>BioPioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שיעורי צריכת חמצן: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XFe96 מנתח</td><td>Agilent</td><td>Seahorse XFe96 מנתח</td><td>מכשיר המשמש למדידת שיעורי צריכת החמצן שנקרא על ידי החמצה של המדיה החוץ-תאית</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>צלחות 96 בארות לשימוש ב-XFe96 Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>רכיבים ניתן לרכוש מספקים אחרים לאחר קביעת הבדיקה; חלק מההמלצות מפורטות להלן</td></tr><tr><td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO</td> ניתן לרכוש רכיבי <td>Agilent</td><td>102720-100</td><td>מספקים אחרים לאחר קביעת הבדיקה; כמה המלצות מפורטות להלן</td></tr><tr><td>חומצה פלמיטית</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>למדידת חמצון חומצות שומן</td></tr><tr><td>Carnitine</td><td>Sigma</td><td>C0283-5G</td><td>למדידת חמצון חומצות שומן</td></tr><tr><td>Etomoxir</td><td>Sigma</td><td>E1905</td><td>למדידת חמצון חומצות שומן</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td>משמש כבקרה או בצמידות עם חומצה פלמיטית לשימוש במדידת חמצון חומצות שומן</td></tr></tbody></table>

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר explants

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Myoblasts נמשך ראשוני הם מובחן מתרבים מקדם של שריר השלד. הם יכולים להיות מתורבתים ולמדו כלפי מקדם שרירים או המושרה להבדיל בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח שרירים. הפרוטוקול המסופק כאן מתאר שיטה איתנה עבור הבידוד והתרבות של אוכלוסיה מתרבים מאוד של תאים myoblast חוז מפני השלד הצעיר למבוגרים שרירים בשרירים. תאים אלה שימושיים למחקר של מאפייני חילוף החומרים של שריר השלד של דגמי עכבר שונים, כמו גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון העברה עם DNA אקסוגני או התמרה עם וקטורים ביטוי ויראלי. רמת הבידול ופרופיל חילוף החומרים של תאים אלה תלויה באורך החשיפה, והרכב של המדיה המשמש כדי לגרום בידול myאובאלי. שיטות אלה לספק מערכת חזקה לחקר של תא שרירי העכבר מטבוליזם לשעבר vivo. חשוב לציין, בניגוד לדגמים vivo, השיטות המתוארות כאן מספקות אוכלוסיית תאים שניתן להרחיב וללמוד ברמות גבוהות של האפשרות הניתנת למחקר.

לאחר סעיף 1 של הפרוטוקול המסופק יש להניב תאים ראשוניים המתעוררים מתוך explants שיהיו גלויים תחת מיקרוסקופ אור רגיל (איור 2). אוכלוסיית תאים הטרוגנית יראו גדלה ומקיפה כל רקמת שריר לחקור. מיאובלי יופיע כספירות קטנות, עגולות ובהירות. לאחר סעיף 2 של הפרוטוקול תניב יבול מוקדם של myoblasts מתוך הרחבות רקמות, אשר יכיל תאים מעטים יהיה הטרוגנית (איור 3). סעיף 3 של הפרוטוקול מתאר מעבר יבול מוקדם עם ה-PBS (ולא טריפסין), אשר יספק אוכלוסייה ט...

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

זהו פרוטוקול לבידוד של תאי גזע שריר העכבר הראשי לחקר חילוף החומרים ex vivo. פרוטוקול זה מספק אוכלוסייה הרבה יותר גדולה של תאי גזע בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שניסינו בעבר. וחשוב מכך, ברגע שאנחנו מבדילים את תאי הגזע האלה לתוך מיוטובים, הם מפגינים פיזיולוגיה נורמלית, כך שדברים כמו מקצבים ביולוגיים.כאשר מנסים הליך זה בפעם הראשונה, לרשום הערות מפורטות ולשמור כמה תמונות כי כל רקמה explant נראה שונה ויהיה וריאציה בהיכל של myoblasts. ללא הדגמה חזותית, קשה לדעת אם אתה מבודד את התאים הנכונים. נהנינו מהעזרה הנדיבה של אחרים שהראו לנו שיטה זו כאשר הקמנו אותה במעבדה שלנו.לאחר הכנת המנה לניתוח על פי כתב היד, הכינו תא לח על ידי הנחת שניים עד שלושה גיליונות נייר סופג עבה לתוך שקית ניילון ולהשתמש פיפטה להרטיב את פני השטח של הנייר עם מים סטריליים. מניחים את התא תחת אור UV במשך חמש דקות כדי לעקר. לנתח את השריר הרצוי מעכבר בן ארבעה עד שמונה שבועות ולשטוף בעדינות PBS המכיל 40 מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין כדי לעקר.השתמש ממטרים סטריליים כדי להעביר את השריר לצלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ לא מצופה. מוסיפים 0.5 למיליליטר של ציפוי התקשורת על השריר כך הרקמה לחה אך לא צפה. השתמש אזמל סטרילי או סכין גילוח כדי לחתוך בעדינות את השריר לרסיסים קטנים.השתמש ממטרים או פיפטה כדי להעביר את שברי השריר על פני השטח של צלחת מצופה מראש שישה סנטימטרים. בעדינות רבה כיסוי נוסף 0.8 מיליליטר של ציפוי התקשורת על הרקמה. מניחים את צלחת ששת הסנטימטר המכילה את שברי השריר בתוך התא לח ולהחזיר אותו אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.הכינו וקדם מיובלסט מדיה, טריפסין ו PBS-gentamycin באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לצפות בקבוק T25 עבור כל קבוצת שרירים, להוסיף שני מיליליטר של פתרון ציפוי על פני השטח של הבקבוק, לנער בעדינות כדי ליצור מעיל אחיד על פני השטח, ו דגירה הבקבוק בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עכשיו עם פיפטה, להסיר את התקשורת ציפוי מן השריר explants בעדינות לשטוף את השריר explants עם שני מיליליטר של PBS-gentamycin.הסר במהירות את PBS ואל תיתן לצלחת לשבת ב- PBS. לאחר מכן מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד של PBS-gentamycin ומ מניחים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. השתמש P1000 פיפטה כדי לאסוף את PBS עם תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת ומחזירים אותו לאנקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. הקישו בעדינות על הצלחות כדי לנתק את המילובסטים. לאסוף את טריפסין עם תאים ולשלב עם אוסף PBS.הוסף שמונה מיליליטר של מדיה myoblast לצינור צנטריפוגה בעדינות להפוך לערבב. בעדינות כיסוי שני מיליליטר של פתרון ציפוי על צלחות השריר ולהחזיר את הצלחות אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. סובב את צינורות הצנטריפוגה המכילים תאים בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g.שאף את העל-טבעי ושמור כמיליליטר בצינור. מוסיפים בעדינות את המדיה myoblast, מעבירים את התאים לבקבוק מצופה מראש ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. שאפו את התקשורת מבקבוקי T25 מיובלסט P0.לשטוף את התאים לזמן קצר עם שני מיליליטר של PBS חם-gentamycin ואז לספירה PBS מן הבקבוק. פיפטה שני מיליליטר של PBS חם לתוך כל בקבוק המכיל מיובלאסטים. מניחים את הבקבוקים עם PBS לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן הקישו בחוזקה על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ אור עבור myoblasts צף בחופשיות. מניחים את flasks זקוף מכסה המנוע של תרבות הרקמה ולשטוף את החלק התחתון של flasks עם 10 מיליליטר של מדיה myoblast פעמיים עד שלוש פעמים כדי להבטיח את כל התאים הם נקע.לאסוף את תערובת מדיה התא בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g. שאף את התקשורת להשאיר סביב מיליליטר אחד בצינור נזהר כדי למנוע את גלולת התא.הוסיפו בעדינות נפח מתאים של מדיה myoblast לצינור הצנטריפוגה ומערבבים בעדינות. מפיצים את תערובת התאים לבקבוקי T75 חדשים שישה מיליליטר כל אחד. הוסף 10 מיליליטר של מדיה myoblast לכל בקבוק T75 חדש.בעדינות לנער את flasks אופקית כדי להפיץ את התאים למקם אותם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בפרוטוקול זה, תאים ראשוניים הגיחו מן המתפוצצים נצפו תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. יבולים מוקדמים של מיובלאס הופיעו כעולמות עגולים ובהירים קטנים.ההידול של myoblasts לקח ארבעה עד שישה ימים שבמהלכם המורפולוגיה של התאים השתנה מעולמות עגולים בודדים סיבים מוארכים התמזגו ארוך רב גרעינים. מיוטובים מובחנים לחלוטין הניבו שהיו מוכנים למדידת שיעורי צריכת החמצן. תאים אלה יכולים לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם.לדוגמה, לעתים קרובות אנו משתמשים בהם כדי ללמוד שטף מצעים במכשירי סוסון ים.

isolation-differentiation-primary-myoblasts-from-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, לשחזור ופשוטה של ​​בידוד והתרבות של ובתאים myoblast מן שרירי השלד של מבוגרים וישישים. השרירים המשמשים כאן כוללים שרירי כף הרגל והרגל. גישה זו מאפשרת הבידוד של אוכלוסייה מועשרת של myoblasts העיקרי ללימודים תפקודיים.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למד בידוד מיובלסטים ראשוניים משריר שלד עכבר לחקר מטבוליזם תאי שריר אקס ויוו. הפרוטוקול מספק אוכלוסיית תאי גזע גדולה יותר ומאפשר מחקר פיזיולוגי מפורט.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

גלה סרטונים נוספים