זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

השימוש במערכת תרבות תאים אנדותל זה מאפשר הטמעה של המצב בזרימת הדם. ועם מצב זה, אנו יכולים לנתח תהליכי זיהום חיידקיים כולל גם זיהוי של וקטורים חיידקיים וגם של וקטורים התא המעורבים בתהליך זה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקור את ההשפעה של זיהומים חיידקיים על שלמות כלי הדם, כולל גם את ההשפעה על מנגנוני מורפוגנזה, על תגובות דלקת ורגולציה חיסונית.

טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתאי ה אנדותל ולכן תיאור חזותי עדיף מאשר רק הסבר מילולי. שיטה זו מספקת תובנות על מספר תחומי מחקר אחרים המתואמים עם מערכות כלי דם מחושלות כגון דיפרנציאלי של תאי אנדותל, ריפוי פצעים, בראשית הגידול ואנגיוגנזה. אחד השלבים העיקריים הוא טיפוח תאים מתוקקנים, כמו גם טיפול מדויק בתאי אנדותל ראשוניים.

טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתרבות התאים אשר לא יכול להיות ברור רק על ידי הסבר מילולי. כדי להתחיל, לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. השתמש בפיגט כדי להזריק 100 מיקרוליטרים של פתרון PBS ג'לטין חזירי מסונן 2%2%למאגר יחיד של שקופית ערוץ עם שיווי משקל טמפרטורה.

מניחים את השקופית ערוץ מצופה ג'לטין על צלחת פוליסטירן דק או קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית עם מזרק לור מיליליטר אחד להוסיף 100 microliters של ארבע פעמים 10 כדי החמישי לכל מיליליטר HUVEC השעיה לתוך השקופית כדי לזרוע ולטפח את HUVEC. הדגירה את השקופית ערוץ עם HUVEC במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, מלאו כל מאגר בינוני בשני קצות שקופית הערוץ ב-60 מיקרוליטרים של מדיום ECGMS.

דגירה עוד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כדי להתאים את המשאבה microfluidic, תחילה לחבר את ערכת חליטה שיווי משקל ליחידת המשאבה, למלא עם 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS ולהתחיל את תוכנת בקרת המשאבה. בתפריט של הגדרת היחידה הנוזלית, בחר את ערכת הזלבולות ההולמת ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות החלונות המגוללים למטה.

בחר 0.007 dyne השני לסנטימטר מרובע בתוכנה עבור צמיגות בינונית. מחוץ לאנקובטור, חברו בקבוק זכוכית מלא גם צנרת לחץ אוויר. בחר פרמטרי זרימה בתפריט התוכנה, הגדר את הלחץ ל-40 מיליבאר ושטף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על-ידי הפעלת הזרימה הבינונית הרציפה.

אנו מבטיחים חיבור הדוק לתא באמצעות HUVECs הגדלים בתת-מודע ומתמקדים בנוסף בהצאת בועות אוויר מהמערכת, כמו גם שימוש באספקת חשמל עצמאית עבור מערכת המשאבה. הקש על חיבורי הצינורות כדי להסיר בועות אוויר ולוודא כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה. לחיבור שקופית הערוץ, עצרו את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה והחזיקו את הזרימה הבינונית ואת צינורות הזיעת על ידי הידוק הצינורות ליד חיבור לור.

חבר את שקופית הערוץ ובכך הימנעות בועות אוויר. בכרטיסייה המתקדמת של תוכנת בקרת המשאבה, השתמש ביוצר מחזור כלי התוכנה כדי לתכנת את מחזורי הלחץ הרצויים להגזמה לטיפוח זרימה. לתכנת את רמות הלחץ הגזירה למחזור הזרימה ולהתחיל תפוצה לטווח ארוך.

התחל עם חמישה dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה של 5.44 מיליליטר לדקה במשך 30 דקות ואחריו זרימה רציפה בלחץ הגזרה של 10 dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה 10.85 מיליליטר לדקה. בקרת שאיבת מאגר מאוזנת. מניחים את היחידה הנוזלית עם החלקת התעלה המחוברת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.

הפעל את בקרת תוכנת המיקרוסקופ והתאם את הגדרות העיקרון עבור הניטור המיקרוסקופי הפלואורסצנטי על-ידי בחירת הגדרות המסנן המתאימות. להדמיה מיקרוסקופית, מניחים את היחידה הנוזלית בתא החימום של 37 מעלות צלזיוס. מקם את שקופית הערוץ על הבמה של מיקרוסקופ טרום המלחמה.

לשלוט על מורפולוגיה התא ואת השלמות של שכבת HUVEC לפני הזרקת היסטמין וחיידקים למחזור הזרימה. שמור על הגדרת הזרימה. לגרום לשחרורו של VWF מגופי Palade קיימא אנדותל על ידי הזרקת 136 microliters של פתרון מלאי היסטמין 100 מילימולר באמצעות יציאת הזרקה לתוך המדיום ECGMS במחזור צינורות זלוף.

לגילוי immunofluorescence של מחרוזות VWF רב-תכליתיות, להזריק 20 מיקרוגרם של נוגדן FITC ספציפי FITC נדיד בנפח של 200 microliters של PBS לתוך במחזור 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS. כדי לכמת קובץ מצורף Pneumococcal מחרוזות VWF שנוצר על משטחי תא HUVEC, להזריק 1.35 פעמים 10 ל CFU השמיני לכל RFP מיליליטר מבטא Pneumococci בנפח מרבי של מיליליטר אחד לתוך המדיום ECGMS באמצעות יציאת ההזרקה. בחר יעד טבילת שמן 63X להגדלת מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הפלואורסצנטיות בתוכנת המיקרוסקופ לערוץ RFP עם מסנן זיהוי ננומטר 540 לזיהוי RFP המבטא Pneumococci.

לכימות של קובץ מצורף חיידקי מחרוזות VWF, צור תמונות של ערימות Z של לפחות 30 תצוגות שדה מייצגות שכל אחת מהן מכילה כ- 10 HUVEC שלמים מורפולוגית וספירת כמות ה- Pneumococci. כדי להעריך את ההחזקה החיידקית לאחר הקיבעון לפני כתמי immunofluorescent, לעצור את הזרימה, להסיר 10 מיליליטר של מדיום ECGMS ממאגרים המשאבה, ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS בתוספת 5% paraformaldehyde ולהמשיך על פי כתב היד. בפרוטוקול זה, הצעדים הניסיוניים העיקריים מתחילים בטיפוח מראש של תאי אנדותל ראשוניים לתת-תצורה בבקבוקי תרבות התאים.

לאחר מכן נזרעים תאים לשקופית ערוץ מצופה ג'לטין. חיידקים גדלים על צלחות אגר ואחריו טיפוח בשלב בינוני עד בינוני נוזלי מורכב. עבור תרבות תאים microfluidic, שקופית ערוץ עם תאים אנדותל מחובר צינורות זלוב של יחידה נוזלית של מערכת המשאבה נתון זרימה מתמדת עבור התמדות התא.

הדור של מחרוזות VWF היה המושרה על ידי הזרקת היסטמין בלחץ גזיר של 10 dyne השני לסנטימטר מרובע ומנוטר מיקרוסקופית על ידי זיהוי immunofluorescence באמצעות נוגדנים ספציפיים VWF שכותרתו FITC. לאחר הזרקה של חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא חיידקים למדיום במחזור, Pneumococcus מצורף מחרוזות VWF היה חזותי מיקרוסקופי בזמן אמת על ידי פליטת פלואורסצנטיות ב 450 ננומטר. לאחר קיבעון של התאים באמצעות PFA, כתמי immunofluorescence דיפרנציאלי מספק הדמיה של התקשרות חיידקית בנקודות זמן זיהום ספציפיות.

השלב החשוב ביותר בהליך זה הוא להבטיח חיבור תא הדוק על משטח השקופית על ידי התאמת רמות הלחץ הפיזיולוגיות של ההמהר והימנעות מתנודות קיצוניות בלחץ המשאבה. בנוסף להדמיה המיקרוסקופית, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד השפעות פרמקולוגיות של אנטי זיהומיות חדשות וגם לנתח את ההשלכות ארוכות הטווח של תהליכי זיהום כלי הדם. מערכת משאבה זו מזיפה פתוגנים חיידקיים על ידי לחץ אוויר כדי למנוע כל שידור באמצעות אירוסולים.

מומלץ לעקוב אחר אמצעי הזהירות הביו-בטיחותיים.