Name: זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למדו את שיטת הזיהום הפנאומטי בתאי אנדותל אנושיים ראשוניים בזרימה קבועה. טכניקה זו מאפשרת מעקב מיקרוסקופי של הידבקות חיידקים וניתוח תהליכי זיהום בזרימת דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מומן על ידי DFG (להיות 4570/4-1) כדי S.B.

<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הדמיה של אינטראקציה חיידקית עם חלבונים מארחים רגישים מכונאי כגון VWF דורש מערכת התרבות התא המכונה המאפשרת את הדור של זרימה מוגדרת, חד כיווני, רציפה של נוזלים, ובכך לייצר מאמץ הטיה אמין . כמה מערכות משאבות מיקרופלואידיסי כבר תוארו. סקירה מקיפה של ברגמן ואח ' מסכמת את ההיבטים המרכזיים של מודלים שונים של תרבות התא השני והתלת-ממדיים17.
הטכנולוגיה המיקרופלואידיסי היא טכניקה מאוד צעירה שהחלה בתחילת שנות ה-90 עם התפתחות של מיקרומטר בשליטה, הניתנת לשינוי ומיקרו-סביבות במיקרו-מי...

הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס9. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה10.
כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)13. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס"מ2 vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל10,12.
כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm2. לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל14 עם משוואה 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm2, η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm2, h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.
התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות15.
לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)16 נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש8.
בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.
כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>10303002</td><td>בנפח 1 מ"ל להזרקת ג'לטין באמצעות חיבור הלואר של המגלשות</td></tr><tr><td>2 מ"ל מזרק</td><td>Luer Sarstedt</td><td>9077136</td><td>להזרקה/הזרקת נוזלים לחיבורי הלואר של מגלשות תא התעלה</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience עכשיו תרמו פישר</td><td>00-4555-56</td><td>תערובת פרוטאז המשמשת לניתוק עדין של תאי אנדותל</td></tr><tr><td>AlexaFluor350-מצומד Phalloidin</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>אין ריכוז זמין מהיצרן, תמיסת המלאי מספיקה ל-300 ציצים, החברה ממליצה להשתמש ב-100 ומיקרו; L של דילול של 1:1,000, פלואורסצנציה כחולה (הגדרות מסנן DAPI)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488-מצומד נגד עכברים נגד עכברים</td><td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל לצביעה חיסונית של VWF אנושי בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע PFA, פלואורסצנטי ירוק</td></tr><tr><td>AlexaFluor568-מצומד נגד נוגדנים נגד ארנב שמקורו בעזים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל לצביעה חיסונית של פנאומוקוק בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע pFA, פלואורסצנטי אדום</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>מדיום תרבית חיידקים מורכב</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>מסיס, להכנת חיץ חוסם</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים עם פילטר</td><td>TPP</td><td>90026</td><td>תת-גידול של HUVEC בצלוחיות תרבית תאים לא מצופות של 25 ס"מ2 צנטריפוגה פני השטח</td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>392304</td><td>מסתובב כלפי מטה של חיידקים (נפחים של >2 מ"ל)</td></tr><tr><td>צנטריפוגה אלגרה X-30</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>B06314</td><td>מסתובב כלפי מטה של תאים אוקריוטיים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>מסתובב של חיידקים (נפחים של פחות מ-2 מ"ל)</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה</td><td>3886.2</td><td>משמש בריכוז של 0.2 מ"ג/מ"ל לגידול פנאומוקוק שעבר טרנספורמציה עם מבנה גנטי הנושא חלבון פלואורסצנטי אדום וקלטת עמידות לכלורמפניקול</td></tr><tr><td>מהדק לצינורות זלוף</td><td>ibidi</td><td>10821</td><td>להחזקת הנוזל בצינור המחבר את המגלשה למערכת המשאבה</td></tr><tr><td>חממת CO2-Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>MIDI 40</td><td>גודל החממה מותאם באופן מושלם לגודל היחידה הנוזלית עם מגלשת תעלה מחוברת ושימש לגידול זרימה ב-37 מעלות; C ו-5% CO2</td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td><td>לדגירה של חיידקים ותאים באטמוספירה מוגדרת ב-5% CO2 ו-37 &deg; C</td></tr><tr><td>קולומביה דם אגר צלחות</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>מדיום תרבית מורכב מבוסס אגר עבור S. pneumoniae בתוספת 7% דם כבשים</td></tr><tr><td>מחשב</td><td>Dell</td><td>Latitude 3440</td><td>Comuter עם תוכנת משאבת לחץ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>מיקרוסקופ הפוך עם במה המכוסה בתא מחומם ועם יחידת פלואורסצנטיות המצוידת במסנן פלואורסצנטי, מקור אור קסנון (SP8, DMi8) ו-DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 מגה-פיקסל)</td></tr><tr><td>Di אשלגן מימן פוספט (KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה</td><td>3904.1</td><td>משמש למאגר PBS</td></tr><tr><td>חומר ייבוש</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>חרוזי סיליקה כתומים לייבוש המשמשים בבקבוק זכוכית עם מתאם צינור</td></tr><tr><td>תוסף ECGM תערובת</td> תוספי <td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>ל-ECGM -בינוני, נדרש לגידול מוקדם של תאי אנדותל: 0.02 מ"ל/מ"ל סרום עגל עוברי, 0.004 מ"ל/מ"ל תוסף צמיחת תאי אנדותל, 0.1 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי, 1 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי, 90 ומיקרו; גרם/מ"ל הפרין, 1 ומיקרו; גרם/מ"ל הידרוקורטיזון</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>ECGM בתוספת 5% [w/w] FCS ו-1 מ"מ MgSO4 להגברת הידבקות התאים</td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי אנדותל (ECGM, מוכן לשימוש)</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>מדיום תרבית של HUVECs, שכבר הוסף עם כל מרכיבי תערובת התוספים</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>ביוכרום כעת Merck</td><td>S 0415</td><td>תוסף לתרבית תאים, המשמש לניתוחי זיהומים</td></tr><tr><td>נוגדן VWF אנטי אנושי מצומד FITC</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>ריכוז מלאי: 10 מ"ג/מ"ל, לזיהוי חיסוני של VWF כדורי ומולטימרי בזרימה</td></tr><tr><td>יחידה נוזלית</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td>יחידה נוזלית לגידול זרימה</td></tr><tr><td>ג'לטין (חזיר)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>לציפוי מקדים של משטח תעלת מיקרו-סלייד</td></tr><tr><td>היסטמין דיהידרוכלוריד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-7250-10MG</td><td>לאינדוקציה של הפרשת VWF מגופי Weibel Palade אנדותליים</td></tr><tr><td>תא אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC)</td> <td>Promocell</td><td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td><td>תאי אנדותל ראשוניים מתורם מאוגד, מאוחסנים בקריפקושמור בחנקן</td></tr><tr><td>נוזלי נוגדן ספציפי ל-VWF אנושי שמקורו בעכבר (חד שבטי)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc73268</td><td>ריכוז המלאי: 200 ומיקרו; g/mL לצביעה חיסונית של VWF בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע PFA</td></tr><tr><td>יציאת הזרקה</td><td>ibidi</td><td>10820</td><td>להזרקת היסטמין או חיידקים לתוך צינורות המאגר במהלך זרימת הזרימה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>מיקרוסקופ אור הפוך לשליטה בניתוק תאים אוקריוטיים וספירת תאים באמצעות יעד מים פי 40 המאפשר הגדלה</td></tr> <tr><td>של פי 400Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>שקופיות מותאמות פיזית לגידול פלודי (&mu; &ndash; שקופית I0.4Luer עם גובה תעלה של 0.4 מ"מ, נפח ערוץ של 100 &mu; L, שטח גידול של 2.5 ס"מ ושטח ציפוי של 25.4 ס"מ2) מתאים לכל מיני בדיקות זרימה, הטיפול הפיזי מייצר משטח הידרופילי ודביק.</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4, לא מיובש)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M7506-500G</td><td>להכנת א.ק.ג. בינוני</td></tr><tr><td>משאבה מיקרופלואידית</td><td>ibidi</td><td>10905</td><td>משאבת לחץ אוויר</td></tr><tr><td>Neubauer תא ספירת תאים</td><td>Karl Hecht GmbH& Co KG</td><td>40442002</td><td>תא ספירה מיקרוסקופי עבור HUVECs</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td>לקישור צולב של דגימות</td></tr><tr><td>סט זלוף</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>סט זלוף צהוב/ירוק בעל קוטר צינור של 1.6 מ"מ, אורך צינור של 50 ס"מ, נפח עבודה כולל של 13.6 מ"ל, נפח צינור מת של 2.8 מ"ל וגודל מאגר של 10 מ"ל. בשילוב עם &micro;-slide L0.4Luer, ב-37 מעלות; C וצמיגות של 0.0072 dyn x s/cm2 ניתן להגיע לטווח קצב זרימה של 3.8 מ"ל/דקה עד 33.9 מ"ל/דקה ומתח גזירה בין 3.5 dyn/cm2 ו-31.2 dyn/cm2. באורך של 50 ס"מ עבור</td></tr> תמיסת מלח מיקרופלואידית <tr><td>פוספט (PBS)</td><td></td><td></td> <td>התמיסה הוכנה באמצעות הכימיקלים הבאים: 0.2 גרם/ליטר KCl, 1.44 גרם/ליטר Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td></tr><tr><td>קובטות פלסטיק</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td> <td>(2 x אופטי) למדידת OD ב-600 ננומטר</td></tr><tr><td>אנטי-סרום ספציפי לפנאומוקוק</td><td>Pineda</td><td></td><td>שגדל בארנב באמצעות Streptococcus pneumoniae NCTC10319 ו-D39, מטוהר IgG באמצעות עמודת חלבון A-sepharose.</td></tr><tr><td>צלחת פוליסטירן או קלקר</td><td></td><td></td><td>זהו צעד זהירות כדי למנוע לחץ קר על התאים שנזרעו במגלשות התעלה. ניתן להשתמש בכל סוג של קלקר כגון חומר קופסת אריזה. עובי הצלחת עשוי להיות 0.5 ס"מ וצריך להיות בגודל 20 ס"מ2.</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td> משמש לתוכנת בקרת משאבת <td>חיץ PBS</td></tr><tr><td>(PumpControl v1.5.4)</td> <td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>תוכנת מחשב לשליטה במשאבת הלחץ, קביעת תנאי הזרימה והתחלה/סיום הזרימה</td></tr><tr><td>צינורות תגובה 1.5/2.0 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td><td>נדרש לדילול נוגדנים</td></tr><tr><td>צינורות תגובה עם 50 מ"ל כרך</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>פנאומוקוק המבטא RFP</td><td>אוסף לאומי של תרבויות סוג, בריאות הציבור אנגליה</td><td>10,319</td><td>סטרפטוקוקוס פנאומוניה סרוטיפ 47 מבטא RFP התמזג לחלבון דמוי אהיסטון המשולב בגנום</td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית 5, 10 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>לצנרת נפחים</td></tr> <tr><td>גדולים יותרנתרן פחמתי (Na2COsub3, ללא מים)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>להכנת מאגר נתרן פחמתי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td><td>משמש למאגר PBS</td></tr><tr><td>פוטומטר ספקטרלי Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>מדידת צפיפות אופטית (OD) של תרחיף חיידקים ב-600 ננומטר</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389-500G</td><td>להכנת מאגר חוסם</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>משמש בריכוז קצה של 0.1% מדולל ב-dH20 לחדירות תאים אוקריוטיים לאחר קיבוע PFA</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0021</td><td>חיידקים מעובדים בתוסף THB עם 1% [w/w] תמצית שמרים = גידול חיידקים מלא בינוני THY</td></tr></tbody></table>

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

אינטראקציה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם פני השטח של תאים אנדותל מתווך בזרימת הדם באמצעות חלבונים מכניביים מרכיב כגון מקדם וויללמותג פון (vwf). גליקופרוטאין זה משנה את המבנה המולקולרי שלה בתגובה למתח ההטיה, ובכך חושף אתרי כריכה לקשת רחבה של מארחים ואינטראקציות. באופן כללי, הקפדה על תאי האנדותל הראשוניים תחת זרימת הטיה מוגדרת לקדם את הבידול התאי המסוים ואת היווצרות של שכבת אנדותל יציבה ומקושרת היטב הדומה לפיזיולוגיה של הציפוי הפנימי של כלי הדם . לפיכך, ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לבין הפונדקאי המארח מעורבים חלבונים מכנימים רגישים דורש הקמת מערכות משאבה שיכולות לדמות את כוחות הזרימה הפיסיולוגיים הידועים להשפיע על פני השטח של תאי כלי הדם.
המכשיר המיקרו-פלואידיג המשמש במחקר זה מאפשר הפעלה מתמשכת ורציפה של נוזלים עם קצב זרימה מוגדר. מערכת משאבת לחץ האוויר מבוקרת המחשב מחיל לחץ הטיה מוגדר על משטחי תא אנדותל על ידי יצירת זרימה רציפה, חד כיווני, בינונית ומבוקרת. שינויים מורפולוגיים של התאים והקבצים המצורפים החיידקיים יכולים להיות מנוטרים באופן מיקרוסקופי ולכמת בזרימה באמצעות שקופיות ערוץ מיוחדות המיועדות להדמיה מיקרוסקופית. בניגוד לזיהום התרבות התא סטטי, אשר באופן כללי דורש קיבעון לדוגמה לפני תיוג החיסונית ניתוחים מיקרוסקופיים, שקופיות microflu, מאפשר הן איתור מבוססי-פלואורסצנטית של חלבונים, חיידקים, ורכיבים סלולריים לאחר קיבעון דגימה; כתמים מוחיסורתיים; וגילוי מבוסס-פלואורסצנטית ישיר בזמן אמת. בשילוב עם חיידקים פלורסנט ונוגדנים ספציפיים המסומנים בקרינה פלואורסצנטית, זה הליך זיהום מספק מערכת יעילה מרובת רכיבים מרובים עבור ספקטרום עצום של יישומים מדעיים הקשורים תהליכים כלי דם.

Culturing הראשי huvec בזרימה חד כיווני מתמדת היווצרות שכבת התאים הקשורים וגדוש בחוזקה המקדם את הדור של wpbs הסלולר ממולא vwf המכונה הרגיש13,14. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת המבוססת על לחץ אוויר מבוסס על משאבה, לניתוח זיהום המחייב לחקות את המצב לחץ ההטיה בזרימת הדם האנושית.
מערכת זו מאפשרת הגדרה מוגדרת ומבוקרת תוכנה של תנאי זרימה. ערכת הזרימה באיור 1 ממחישה את זרימת העבודה העיקרית, החל בטיפוח-תרגול של ...

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

השימוש במערכת תרבות תאים אנדותל זה מאפשר הטמעה של המצב בזרימת הדם. ועם מצב זה, אנו יכולים לנתח תהליכי זיהום חיידקיים כולל גם זיהוי של וקטורים חיידקיים וגם של וקטורים התא המעורבים בתהליך זה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקור את ההשפעה של זיהומים חיידקיים על שלמות כלי הדם, כולל גם את ההשפעה על מנגנוני מורפוגנזה, על תגובות דלקת ורגולציה חיסונית.טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתאי ה אנדותל ולכן תיאור חזותי עדיף מאשר רק הסבר מילולי. שיטה זו מספקת תובנות על מספר תחומי מחקר אחרים המתואמים עם מערכות כלי דם מחושלות כגון דיפרנציאלי של תאי אנדותל, ריפוי פצעים, בראשית הגידול ואנגיוגנזה. אחד השלבים העיקריים הוא טיפוח תאים מתוקקנים, כמו גם טיפול מדויק בתאי אנדותל ראשוניים.טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתרבות התאים אשר לא יכול להיות ברור רק על ידי הסבר מילולי. כדי להתחיל, לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. השתמש בפיגט כדי להזריק 100 מיקרוליטרים של פתרון PBS ג'לטין חזירי מסונן 2%2%למאגר יחיד של שקופית ערוץ עם שיווי משקל טמפרטורה.מניחים את השקופית ערוץ מצופה ג'לטין על צלחת פוליסטירן דק או קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית עם מזרק לור מיליליטר אחד להוסיף 100 microliters של ארבע פעמים 10 כדי החמישי לכל מיליליטר HUVEC השעיה לתוך השקופית כדי לזרוע ולטפח את HUVEC. הדגירה את השקופית ערוץ עם HUVEC במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, מלאו כל מאגר בינוני בשני קצות שקופית הערוץ ב-60 מיקרוליטרים של מדיום ECGMS.דגירה עוד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כדי להתאים את המשאבה microfluidic, תחילה לחבר את ערכת חליטה שיווי משקל ליחידת המשאבה, למלא עם 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS ולהתחיל את תוכנת בקרת המשאבה. בתפריט של הגדרת היחידה הנוזלית, בחר את ערכת הזלבולות ההולמת ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות החלונות המגוללים למטה.בחר 0.007 dyne השני לסנטימטר מרובע בתוכנה עבור צמיגות בינונית. מחוץ לאנקובטור, חברו בקבוק זכוכית מלא גם צנרת לחץ אוויר. בחר פרמטרי זרימה בתפריט התוכנה, הגדר את הלחץ ל-40 מיליבאר ושטף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על-ידי הפעלת הזרימה הבינונית הרציפה.אנו מבטיחים חיבור הדוק לתא באמצעות HUVECs הגדלים בתת-מודע ומתמקדים בנוסף בהצאת בועות אוויר מהמערכת, כמו גם שימוש באספקת חשמל עצמאית עבור מערכת המשאבה. הקש על חיבורי הצינורות כדי להסיר בועות אוויר ולוודא כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה. לחיבור שקופית הערוץ, עצרו את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה והחזיקו את הזרימה הבינונית ואת צינורות הזיעת על ידי הידוק הצינורות ליד חיבור לור.חבר את שקופית הערוץ ובכך הימנעות בועות אוויר. בכרטיסייה המתקדמת של תוכנת בקרת המשאבה, השתמש ביוצר מחזור כלי התוכנה כדי לתכנת את מחזורי הלחץ הרצויים להגזמה לטיפוח זרימה. לתכנת את רמות הלחץ הגזירה למחזור הזרימה ולהתחיל תפוצה לטווח ארוך.התחל עם חמישה dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה של 5.44 מיליליטר לדקה במשך 30 דקות ואחריו זרימה רציפה בלחץ הגזרה של 10 dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה 10.85 מיליליטר לדקה. בקרת שאיבת מאגר מאוזנת. מניחים את היחידה הנוזלית עם החלקת התעלה המחוברת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.הפעל את בקרת תוכנת המיקרוסקופ והתאם את הגדרות העיקרון עבור הניטור המיקרוסקופי הפלואורסצנטי על-ידי בחירת הגדרות המסנן המתאימות. להדמיה מיקרוסקופית, מניחים את היחידה הנוזלית בתא החימום של 37 מעלות צלזיוס. מקם את שקופית הערוץ על הבמה של מיקרוסקופ טרום המלחמה.לשלוט על מורפולוגיה התא ואת השלמות של שכבת HUVEC לפני הזרקת היסטמין וחיידקים למחזור הזרימה. שמור על הגדרת הזרימה. לגרום לשחרורו של VWF מגופי Palade קיימא אנדותל על ידי הזרקת 136 microliters של פתרון מלאי היסטמין 100 מילימולר באמצעות יציאת הזרקה לתוך המדיום ECGMS במחזור צינורות זלוף.לגילוי immunofluorescence של מחרוזות VWF רב-תכליתיות, להזריק 20 מיקרוגרם של נוגדן FITC ספציפי FITC נדיד בנפח של 200 microliters של PBS לתוך במחזור 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS. כדי לכמת קובץ מצורף Pneumococcal מחרוזות VWF שנוצר על משטחי תא HUVEC, להזריק 1.35 פעמים 10 ל CFU השמיני לכל RFP מיליליטר מבטא Pneumococci בנפח מרבי של מיליליטר אחד לתוך המדיום ECGMS באמצעות יציאת ההזרקה. בחר יעד טבילת שמן 63X להגדלת מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הפלואורסצנטיות בתוכנת המיקרוסקופ לערוץ RFP עם מסנן זיהוי ננומטר 540 לזיהוי RFP המבטא Pneumococci.לכימות של קובץ מצורף חיידקי מחרוזות VWF, צור תמונות של ערימות Z של לפחות 30 תצוגות שדה מייצגות שכל אחת מהן מכילה כ- 10 HUVEC שלמים מורפולוגית וספירת כמות ה- Pneumococci. כדי להעריך את ההחזקה החיידקית לאחר הקיבעון לפני כתמי immunofluorescent, לעצור את הזרימה, להסיר 10 מיליליטר של מדיום ECGMS ממאגרים המשאבה, ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS בתוספת 5% paraformaldehyde ולהמשיך על פי כתב היד. בפרוטוקול זה, הצעדים הניסיוניים העיקריים מתחילים בטיפוח מראש של תאי אנדותל ראשוניים לתת-תצורה בבקבוקי תרבות התאים.לאחר מכן נזרעים תאים לשקופית ערוץ מצופה ג'לטין. חיידקים גדלים על צלחות אגר ואחריו טיפוח בשלב בינוני עד בינוני נוזלי מורכב. עבור תרבות תאים microfluidic, שקופית ערוץ עם תאים אנדותל מחובר צינורות זלוב של יחידה נוזלית של מערכת המשאבה נתון זרימה מתמדת עבור התמדות התא.הדור של מחרוזות VWF היה המושרה על ידי הזרקת היסטמין בלחץ גזיר של 10 dyne השני לסנטימטר מרובע ומנוטר מיקרוסקופית על ידי זיהוי immunofluorescence באמצעות נוגדנים ספציפיים VWF שכותרתו FITC. לאחר הזרקה של חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא חיידקים למדיום במחזור, Pneumococcus מצורף מחרוזות VWF היה חזותי מיקרוסקופי בזמן אמת על ידי פליטת פלואורסצנטיות ב 450 ננומטר. לאחר קיבעון של התאים באמצעות PFA, כתמי immunofluorescence דיפרנציאלי מספק הדמיה של התקשרות חיידקית בנקודות זמן זיהום ספציפיות.השלב החשוב ביותר בהליך זה הוא להבטיח חיבור תא הדוק על משטח השקופית על ידי התאמת רמות הלחץ הפיזיולוגיות של ההמהר והימנעות מתנודות קיצוניות בלחץ המשאבה. בנוסף להדמיה המיקרוסקופית, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד השפעות פרמקולוגיות של אנטי זיהומיות חדשות וגם לנתח את ההשלכות ארוכות הטווח של תהליכי זיהום כלי הדם. מערכת משאבה זו מזיפה פתוגנים חיידקיים על ידי לחץ אוויר כדי למנוע כל שידור באמצעות אירוסולים.מומלץ לעקוב אחר אמצעי הזהירות הביו-בטיחותיים.

pneumococcus-infection-primary-human-endothelial-cells-constant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטות שונות של...

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

מקור: Jagau, H. et al. זיהום פנאומוקוק של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים בזרימה מתמדת. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של התקשרות פנאומוקוקית למיתרי Von Willebrand Factor (VWF) על תאי אנדותל בתנאי זרימת מדיה קבועים. הוא מתאר את השלבים לגירוי שחרור VWF, תיוג המיתרים וכימות קשירת חיידקים.

הערכת התקשרות פנאומוקוקית לתאי אנדותל אנושיים ראשוניים תחת זרימת מדיה קבועה

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.

מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם

למדו את שיטת הזיהום הפנאומטי בתאי אנדותל אנושיים ראשוניים בזרימה קבועה. טכניקה זו מאפשרת מעקב מיקרוסקופי של הידבקות חיידקים וניתוח תהליכי זיהום בזרימת דם.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

גלה סרטונים נוספים