Name: הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: למד כיצד לקבוע את מבנה התחום המחייב של IKK ב-NEMO בצורתו החופשית באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. פרוטוקול זה מציג שיטות ייצור וגבישות לפיתוח תרופות נגד מחלות דלקתיות ואוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופסור ד. מדן, עבור דיונים רבים ומועילים במהלך פרויקט זה. אנו מודים לפרופסור ד. בולסון על מתנת הפלסמיד המכילה את הסליל הGCN4 ממוטב. אנו מודים לד ר ב. גואו. אנו מודים לכריסטינה ר. ארנולדי, תמר בסילישווילי ואיימי א. קנדי על הפגנת הנוהל. אנו מודים למכון הליבה של קריסטלוגרפיה באמצעות ביורט ולמחלקות הכימיה ולביוכימיה & ביולוגיה של התא בדרמות לשימוש בציוד הקריסטלוגרפיה ובצוות הביו-ביוטיים לתמיכתם. מחקר זה בשימוש AMX beamline של הלאומי סינכרוטרון Light מקור השני, ארה ב. משרד האנרגיה (DOE) משרד המדע המשתמש מתקן מופעל עבור המשרד DOE של המדע על ידי המעבדה הלאומית ברוקהייבן תחת חוזה לא. דה-SC0012704. אנו מודים לצוות במלון NSLS II על תמיכתם. עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ו P20GM113132, ורומן מוניק-פפרקורן ומענק אינטראקטיבי.

<ol><li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+NF-kappaB%3A+players%2C+pathways%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li>
<li>Bassères, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li>
<li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+and+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li>
<li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway%3A+implications+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK%2FNF-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).</li>
<li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+Years+of+NF-%CE%BAB%3A+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li>
<li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li>
<li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+NEMO%2FIKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li>
<li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO%3A+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK%CE%B2+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li>
<li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li>
<li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).</li>
<li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fv-clasp%3A+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility%2C+stability%2C+and+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li>
<li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coils%3A+The+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tagged-TEV+protease%3A+construction%2C+optimisation+of+production%2C+purification+and+test+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li>
<li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals%3A+Data+Collection+at+the+New+High-Flux%2C+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phenix.mr_rosetta%3A+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li>
<li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTickle%2C+IJ+%22STARANISO%22">STARANISO</a>. , (2018).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+treatment+of+negative+intensity+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A%3A+Crystal+Physics%2C+Diffraction%2C+Theoretical+and+General+Crystallography%22%5BJournal%5D)">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li>
<li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+rational+protein+crystallization%3A+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I%CE%BAB+kinase+binding+domain+of+NF-%CE%BAB+essential+modulator+%28NEMO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li>
<li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+F%2C+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

נסיונות התגבשות של נמו בצורה לא מאוגדת לא הצליחו, כולל ניסיונות שימוש בחלבון באורך מלא וכמה בונים חיתוך המקיף את התחום כריכת IKK. האפיון הביופיזיקלי שלנו של התחום המחייב את האיגוד של נמו (שאריות 44-111) קיווטות מעגלית, ספקטרוסקופיית nmr ואנאיזוטרופיה מצביעים על כך שבניית המבנה, אם כי מסוגל לאגד IKKβ, היתה קיימת במצב של החלפת החליפין, לא מתאים התגבשות9,10. הגישה שלנו מעורבת הנדסה בניית התחום של האיגוד IKK של נמו כי אימצה יציבה יותר, מקופלת ומקורי היווצרות, מבטלת א...

מסלול NF-κB מופעל בתגובה מגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מוצרים מיקרוביאלית ומתח, כדי לווסת את הביטוי של גנים היעד האחראי תגובה דלקתית וחיסונית, מוות תאים או הישרדות והתפשטות1. פתווגיות כולל מחלות דלקתיות ואוטואימוניות סרטן2,3,4,5 היו מתואמים היפרהפעלה של השביל, אשר עשה אפנון של הפעילות NF-κB היעד העיקרי לפיתוח טיפולים חדשים6,7.
הנתיב הקנוני-κB בפרט הוא נבדל מהשביל הלא קאנוני, האחראי על הפעלת lymphorganogenesis ו-cell, על ידי התלות של לשעבר על הפיגומים החלבון נמו (NF-κB essential מודולים8) עבור ההרכבה של הקומפלקס ikk עם IKKα ו IKKβ. מתחם ikk אחראי על זרחון של IκBα (מעכב של κB) כי מטרות זה עבור השפלה, שחרור NF-κB דימרים כדי לאתר את הגרעין עבור שעתוק גנים1 ולכן הוא יעד אטרקטיבי לפיתוח מעכבי לווסת את NF-κB פעילות.
המחקר שלנו מתמקד באפיון של האינטראקציה חלבון-חלבון בין נמו ו IKKβ, מיקוד נמו לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות של היווצרות מורכבות IKK. תחום מחייב מינימלי של נמו, נדרש לאגד IKKβ, כולל שאריות 44-111, והמבנה שלו נקבע מורכב עם פפטיד המתאים IKKβ רצף 701-7459. נמו ו IKKβ ליצור צרור ארבעה סליל שבו נמו דיימר להכיל שני הליקס של IKKβ (701-745) בחריץ פתוח מוארך עם ממשק אינטראקציה מורחבת. IKKβ (734-742), הידוע גם בשם התחום המחייב את נמו (NBD), מגדיר את המקום החם החשוב ביותר עבור הכריכה, שם שני טריפטוהנס החיוניים (739,741) לקבור עמוק בתוך הכיס נמו. הפרטים של המבנה המורכב יכול לסייע בעיצוב מבוסס מבנה ואופטימיזציה של מעכבי מולקולות קטנות מיקוד נמו. במקביל, קשה כי הקשירה של מולקולה קטנה או פפטיד יהיה ליצור מחדש ב-נמו השינוי המלא של הקונפורמציה (כלומר, פתיחה נרחבת של נמו מתפתל-סליל dimer) נגרמת על ידי איגוד של IKKβ ארוך (701-745), כפי שנצפה בגביש, ואת המבנה של נמו לא מאוגד או נמו מאוגד מולקולה קטנה מדכא עשוי לייצג יעד טוב יותר עבור מבנה מבוסס עיצוב הסמים ואופטימיזציה מעכב.
אורך מלא נמו ומבנים לחיתוך קטן המקיף את התחום כריכת IKK הוכיחו את הנחישות לקביעת מבנה בצורה לא מאוגד באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן ו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) שיטות10, אשר מתבקש לנו לעצב גרסה משופרת של התחום המחייב IKK של נמו. אכן, נימו (44-111) בטופס הלא מאוגד הוא רק חלקית מקופל ועובר החליפין באופן חלקי, ולכן אנו מוגדר לייצב את המבנה הdimeric שלה, מתפתל סליל קיפול ויציבות, תוך שמירה על זיקה מחייבת IKKβ. על-ידי הוספת שלושה הפטנים של אידיאלי dimeric מתפתל-סליל רצפים11 ב N-ו-C-termini של החלבון, וסדרה של ארבעה מוטציות הנקודה, יצרנו את נמו-EEAA, בונה באופן מלא dimeric מקופל בסליל מפותל, אשר הצילה את הזיקה ikk-bindingלטווח nanomolar כפי שנצפתה כיתרון נוסף, קיווינו מתאמים מפותל סליל (מבוסס על רצף GCN4) יהיה להקל על התגבשות ובסופו של דבר לסייע בקביעת רנטגן מבנה באמצעות החלפת מולקולרית. מתאמים המתפתל-סליל מנוצל באופן דומה הן להגביר את היציבות, לשפר את התנהגות הפתרון ולהקל על התגבשות trimeric סלילי ושברי נוגדנים13,14. נמו-EEAA מתבטאת בקלות ומטוהרים מ es, האבנצ'ה. התאים הcoli עם תגית Histidine ביקדין, הוא מסיסים, מקופל בסליל יציבה dimeric מתפתל והוא מגובש בקלות, עם עקיפה כדי 1.9 Å. הנוכחות של אזורים מתפתל מפותל סליל של GCN4 יכול בנוסף לסייע דיממו את הנתונים מקריסטלים של נמו-eeaa על ידי החלפת מולקולרית באמצעות המבנה הידוע של GCN415.
בהינתן התוצאות שהתקבלו עם apo-נמו-EEAA, אנו מאמינים את הפרוטוקולים המתוארים כאן יכול גם להיות מיושם על התגבשות של נמו-EEAA בנוכחות של פפטידים קטנים (כמו פפטיד d המולקולה) או מעכבי מולקולה קטנה, עם המטרה של הבנת הדרישות של נמו עיכוב מבנה מבוסס אופטימיזציה של מעכבי עופרת הראשונית בהינתן הפלסטיות והאופי הדינמי של מספר רבשל מבני מתחםהסליל המתפתל, השימוש במתאמים המתפתל מתפתל יכול למצוא ישימות כללית יותר בסיוע להגדרה מבנית.

<table><tbody><tr><td>20% w/v &gamma;-PGA (צורת Na+, LM)</td> <td>מידות מולקולריות</td><td>MD2-100-150</td><td>להתגבשות מסך עדין של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>3.5 kDa MWCO ממברנת דיאליזה</td><td>ספקטרום/פור</td><td>132724</td><td>להסרת דיאליזה של אימידזול</td></tr><tr><td>אמיקון תא מעורבב</td><td>Millipose Sigma</td><td>UFSC 05001</td><td>לריכוז חלבון</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>לתיוג מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Millipore Sigma</td><td>9025-65-4</td><td>לעיכול של חומצת גרעין</td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL תאים מוכשרים</td><td>טכנולוגיות זריזות</td><td>דגם: ביטוי 230245</td><td></td></tr><tr><td>TEV CryoPro</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-073</td><td>ערכת מגנים קריו</td></tr><tr><td>D-גלוקוז (דקסטרוז)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>A9434</td><td>עבור תיוג מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>ThermoFisher</td><td>DF043817</td><td>לגידול תרבית</td></tr><tr><td>Dithiothreitol > 99%</td> <td>Goldbio</td><td>DTT25</td><td>להפחתת דיסולפידים</td></tr><tr><td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td><td>Novagen</td><td>71400-3</td> ביטוי של פורמולטור <td>NEMO-EEAA ללא תווית</td></tr><tr><td></td><td>Formulatrix</td><td></td><td>מטפל בנוזלים / בונה מסך</td></tr><tr><td>HCl & ndash; פתרון 1.0 M</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-581</td><td>להתגבשות מסך עדין של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>לטיהור אי הכללת גודל</td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 מ"ל עמודה</td><td>GE Healthcare</td><td>17524802</td> לטיהור מידות מולקולריות <td>של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HT 96 MIDAS</td><td></td> מתויג <td>MD1-59</td><td>להקרנת מטריצה דלילה של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HT 96</td><td>מידות מולקולריות</td> מורפיות <td>MD1-46</td><td>להקרנת מטריצה דלילה של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>ThermoFisher</td><td>288-32-4</td><td>לפליטה מעמוד המלכודת שלו</td></tr><tr><td>איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטוסיד</td><td>Goldbio</td><td>I2481C5</td><td>לאינדוקציה של תרביות</td></tr><tr><td>צלחת התגבשות MRC2</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-083</td><td>צלחת התגבשות</td></tr><tr><td>NT8 - Drop Setter</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Crystallization</td></tr><tr><td>pET-16b</td><td>Millipore Sigma</td><td>69662</td><td>לשיבוט של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>pET-45b</td><td>Millipore Sigma</td><td>71327</td><td>לשיבוט של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>ThermoFisher</td><td>36978</td><td>לעיכוב פרוטאזות</td></tr><tr><td>בקבוק פוליקרבונט לשימוש ברוטור אולטרה-צנטריפוגה מסוג 45 Ti</td><td>Beckmann Coulter</td><td>339160</td><td>בקבוק אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 20,000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-609</td><td>להתגבשות מסך עדין של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>pRK793 (TEV)</td><td></td> <td>Addgene Plasmid 8827</td><td>לייצור TEV</td></tr><tr><td>QuikChange XL II</td><td>Agilent Technologies</td><td>200522</td><td>מוטגנזה מכוונת אתר נדרש מכלול</td></tr><tr><td>כובע:</td><td>Beckmann Coulter</td><td>355623</td><td>פקק בקבוק Ultracenttrifuge</td></tr><tr><td>ROCK IMAGER</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Crystallization Imager</td></tr><tr><td>ערכת חרוזי זרעים</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td>ייצור זרעים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי &ge; 99%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>לחציצה של תמיסות טיהור</td></tr><tr><td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד)</td> <td>Goldbio</td><td>חומר הפחתת</td> <td>TCEP1</td></tr><tr><td>מסך ברקלי</td><td>Rigaku</td><td>MD15-Berekely</td><td>להקרנת מטריצה דלילה של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>מסך ה-PGA</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD1-50</td><td>להתגבשות מסך עדין של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Tris &ndash; פתרון 1.0 M</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-589</td><td>להתגבשות מסך עדין של NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Ultrapure Tris Buffer (אבקה פורמט)</td> <td>Thermofisher</td><td>15504020</td><td>לחציצה של תמיסות טיהור</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td>לדנטורציה של NEMO-EEAA</td></tr></tbody></table>

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-ikk של נמו

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

נמו היא חלבון פיגומים אשר ממלא תפקיד חיוני במסלול NF-κB על ידי הרכבת IKK-מתחם עם IKKα ו IKKβ. עם ההפעלה, מתחם IKK זרחתים מולקולות IκB המובילות הטרנסלוקציה הגרעינית NF-κB והפעלה של גנים היעד. עיכוב של האינטראקציה של נמו/IKK היא פרדיגמה טיפולית אטרקטיבי עבור אפנון של פעילות מסלול NF-κB, מה שהופך את נמו יעד מעכבי עיצוב וגילוי. כדי להקל על תהליך של גילוי ואופטימיזציה של מעכבי נמו, אנו מהונדסים בניין משופר של התחום איגוד IKK של נמו אשר יאפשר קביעת מבנה של החלבון בצורה של apo ובעוד כרוך מעכבי מולקולרית משקל קטן. כאן, אנו מציגים את האסטרטגיה המשמשת לעיצוב, ביטוי ואפיון מבניים של התחום המחייב של ה-IKK של נמו. החלבון מתבטא ב -E. coli תאים, מסיסות תחת תנאים denaturing רפתקאות ומטוהרים דרך שלושה שלבים כרומטוגרפי. אנו דנים בפרוטוקולים להשגת קריסטלים לקביעת מבנה ולתיאור אסטרטגיות לרכישת נתונים וניתוח. הפרוטוקולים ימצאו ישימות רחבה לקביעת מבנה של מתחמי מעכבי של נמו ומולקולה קטנה.

שיבוט, ביטוי וטיהור של התחום המחייב של ה-IKK של נמו. הפרוטוקול שלאחר מחקר זה כדי להשיג את הרצף הסופי של נמו-EEAA (איור 1א), אשר הפיק גבישים באיכות עקיפה, היה מעורב בביטוי ואפיון של כל המבנים ביניים, כולל תוספת של מתאמי סליל מפותל ב N-ו-C-טרמינוס, המוטציות C76A, C95S ואת המוטציות E56A, E57A. איור 1ב מציג את ה-sds-דף ג'ל של דגימות שנאספו במהלך תהליך הטיהור כפי שמתואר בערכה באיור 1<...

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

פרוטוקול זה מאפשר קביעת מבנה מוצלחת של תחום איגוד IKK של NEMO, בצורתו הלא מאוגדת. ופרטים על הייצור וההתגבשות שלה. הפרוטוקול, מנצל את הייצוב הזה של האישור המקורי של קטע התחום מחייב IKK של NEMO, באמצעות מתאמי סליל סלילים, המאפשרים התגבשות וקביעת מבנה.הביולוגיה המבנית של NEMO, כיעד, מספקת יתרון חשוב בהתפתחות מעכבי NEMO לטיפול במחלות דלקתיות ואוטואימוניות וסרטן. פרוטוקול זה עשוי להיות מורחב לקביעת המבנה של קומפלקסים NEMO, עם פפטיד או מעכבי מולקולה קטנה לגילוי תרופות או אופטימיזציה. החלבון refolding וריכוז, במהלך שלב ייצור החלבון, הם היסוד להשגת עמום NEMO טהור.הגבלת צבירה והבטחת מיסות בתנאי התגבשות. להדגים את הנהלים יהיו תמר ואיימי, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלנו. התחל על ידי הוספת 20 מיליליטר של פתרון מרק נהדר.ו-20 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין. לבקבוק ארלנפייר 125 מיליליטר. ואחריו כמה microliters של מלאי גליצרול התא, מ 80 מעלות צלזיוס אחסון, של תאים מוסמכים BL21DE3.השתנה עם וקטור. לאחר טלטול תרבות המתנע בן לילה, ב 37 מעלות צלזיוס ו 220 סיבובים לדקה, לדלל את התאים כדי OD600 של 0.1 ו 250 מיליליטר של מרק נהדר. ומוסיפים אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר.כאשר OD600 של התרבות מגיע 0.8 כדי 1, להוסיף IPTG לתרבות, לריכוז 500 micromolar. ולגדל את התאים במשך ארבע שעות, ב 37 מעלות צלזיוס, עד OD600 מגיע שש עד 10. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה.ולהשעות מחדש את גלולה ב40 מיליליטר של חיץ תזה. פצל את התאים המושעים מחדש לשני אליקוטים של 20 עד 25 מיליליטר. ולהשתמש בעיתונות צרפתית כדי להחיל כ 25, 000 ק"ג לאינץ 'מרובע של לחץ על התאים, פעמיים עד שלוש פעמים לכל aliquot, בחדר קר.לאחר מכן, מוסיפים אוריאה לתא lysates, לריכוז סופי של שמונה טוחנות. ולהדרור את פתרון התא על פלטפורמת נדנדה במשך שעתיים עד 16 שעות, בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להעביר את lysates לצינורות אולטרה צנטריפוגה, לפחות שלושה רבעים מלאים, לכל צינור.ואולרטה צנטריפוגה lysates, במשך 45 דקות. תדקיר את העל-טבעיים לצינור חרוט של 50 מיליליטר. ותטען את האוריאה דגירה על טור IMAC, בשלושה מיליליטר לדקה.כאשר כל העל-טבעי רץ בעמודה, שטף את העמודה עבור 10 כרכים של עמודות, עם מאגר איגוד, בשלושה מיליליטר לדקה. ולבצע אלוט הדרגתי של חלבון NEMO-EEAA מ 10 עד 500 imidazole מילימול, מעל 12 עמודים נפח הדרגתי. איסוף אליקוטים מיליליטר אחד של eluate, לתוך צלחת איסוף שבר.לאחר ניתוח דף SDS, למשוך את השברים המכילים את חלבון היעד הטהור ולמדוד את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay, על פי פרוטוקול סטנדרטי. בחר את השברים חמק, המכיל חלבון. כדי לחשוף את תג HIS6 ולהסיר imidazole עודף מהדגימה, להוסיף פרוטאז TEV, ביחס משקל של 1 עד 10, של חלבון מחשוף TEV, לדגימה חלבון היעד.ולהאריך את הדגימה בן לילה בארבעה ליטרים של טריס 20 מילימולאר. 150 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים פתרון DTT. למחרת בבוקר, לטעון את מדגם NEMO-EEAA מחשוף TEV, על עמוד IMAC השני, במיליליטר אחד לדקה.איסוף הזרימה דרך שברים מיליליטר אחד, בצלחת אוסף שבר קערה 96. לשטוף את הטור עם חמישה כרכים של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי ו 10 מילימולר imidazole פתרון, במיליליטר אחד לדקה. לאחר הכביסה האחרונה, לרחף את TEV ו uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, עם שלושה כרכים טור של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי, 500 מילימולרים imidazole ושני פתרון DTT מילימולרי, לתוך בקבוק 50 מיליליטר.משוך את הזרימה דרך שברים, המכיל מבנה NEMO-EEAA מחשוף ולרכז את המדגם עם רכז תאים עורר, לחמישה מיליליטר. לאחר דיאליזה לילה כפי שהודגם, לטעון חמישה מיליליטר של המדגם על 16 מילימטר על ידי 60 ס"מ גודל הדרה עמודות כרומטוגרפיה. חוזר לפי הצורך, בהתאם לאמצעי האחסון לדוגמה.במיליליטר אחד לדקה, וב-2 מילימולרים טריס, 100 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים תווי DDT. לאחר משיכת השברים, המתאימים NEMO-EEAA dimeric, לרכז את המדגם במרכז התא עורר, עם משקל מולקולרי לחתוך קרום של שלושה קילודלטון, לריכוז סופי של 113 micromolar. לאחר מכן, aliquot החלבון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס, עד חודש.להקרנת מטריצה דלילה, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של פתרון מטריצה דליל לכל אחת מ-96 בארות של צלחת התגבשות תא שתי טיפות. לשבת ולשחרר דיפוזיה אדים. ומוסיפים את תוסף החלבון למתקן טיפות רובוטי.לאחר מכן, השתמשו במגדיר טיפה רובוטי, כדי לוותר על 100 ננוליטר של תות תותר חלבון ב 1.65 מיליגרם למיליליטר, ביחס של אחד לאחד עם פתרון המאגר בירידה אחת, לנפח סופי של 200 ננוליטר. ולהוסיף 66 nanoliters של פתרון חלבון עם 134 nanoliters של פתרון המאגר, לנפח הסופי של 200 nanoliters בירידה 2. לאחר מכן, לאטום מיד את הצלחת עם סרט איטום ברוחב 3 אינץ'.לאחר מכן, לאחסן את המגשים באחסון תמונה התגבשות, ב 20 מעלות צלזיוס. בדיקת התמונות שנאספו באופן אוטומטי, לנוכחות גבישים, החל יומיים לאחר אחסון הצלחות. עבור ייצור מלאי זרעים, להעביר את הירידה כולה המכילה את הגביש של עניין, לתוך 50 microliters של פתרון מצב התגבשות, בבקבוקון שסופק, מערכת דור הזרעים.ומערבולת מלאי הזרעים, עם 20 שניות של פעימות ו -10 שניות של מנוחה, במשך שלוש דקות. לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את מלאי הזרעים, במרווח אחד עד 10, עד אחד עד 10, 000. ולאחסן את הדילולים בארבע מעלות צלזיוס, עד לשימוש נוסף.יום עד יומיים לפני המשלוח לסנכרון, חותכים את הקלטת מהחלק העליון של הבאר, עם גביש העניין. ולהוסיף 0.5 microliters של פתרון התגבשות המכיל 12%1, שני פרופאן DiO cryoprotectant, ישירות לבא. לנתק בעדינות את הקריסטל עם לולאת קריו.לולאה הגביש מן הבאר, ולאחסן את הגביש המכיל לולאת קריו דיסקוס שקוע חנקן נוזלי, עד משלוח עבור דיפוזיה רנטגן. לאחר קבלת נתוני ההתרחבות של קרני הרנטגן, עבד את התעצמויות קנה המידה בשרת STAR ו- ISO. באמצעות אינדקס קריסטלוגרפיה רנטגן לחתוך ממוצע, של 1.2 עבור משטח מגבלת דיפרציה עבור הנתונים.ולהעמיס על פיניקס. כדי לקבוע את המבנה, השתמש במבנה קרני הרנטגן של GCN4 כמודל חיפוש להחלפה מולקולרית, באמצעות MRage בפיניקס. מבנה 4DMD, יוגדר כאנסמבל.ופתרון MRage ייבנה בהצלחה לחלק המבנה, המתאים למתאם סליל סליל מסוף הקצה של NEMO-EEAA. למודל החיפוש, עבור שתי השרשראות במעומעם. החלבון המובע יתר על המידה מופיע בלהקה, בערך 14 קילודלטון סמן משקל מולקולרי, לפני טיהור עמוד IMAC הראשון.ומציג להקת מונומר ולהקה עמומה יותר, ב 14 ו 28 קילודלטון, בהתאמה, לאחר האלוטיון הראשון. מחשוף TEV הושלם כמעט, בעקבות האלוטיון, דרך עמודת IMAC השנייה. כמעט כולו כמו עמום, במשקל המולקולרי הצפוי.כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, מציגה שיא אחד, המתחמק בין 60 ל-65 מיליליטר, המגיבים לעמעום. הקרנה עדינה מייצרת גבישים שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מלאי זרעים לייצור גבישי NEMO-EEAA, לאיסוף נתונים. כאן מוצגים פרופילי דיפוזיה של גבישי NEMO-EEAA.ניתוח מבני של חלבון NEMO-EEAA, מגלה סליל סליל מקביל הומודימרי לא סדיר, כ 175 אנגסטרום אורך. אזור סליל סליל רגיל, מקיף את רצף מתאם סליל סליל אידיאלי, בסוף הסיום. ושני ההפטאדים הראשונים של הרצף הנכון של NEMO.סליל סליל רגיל, קיים גם בתחנת C. החל משאריות NEMO 97 ומקיף את מתאם סליל סליל אידיאלי מסוף C. המבנה מאוגד בטא IKK, מציג אישור סליל סליל פתוח יותר, כדי להתאים את ligand.עם מרווח בין-דהלי גדול יותר ב-1 עד 2.2 אנגסטרום באזור זה. המבנה של ליגנד ב NEMO, מציע יעד חדש עבור העיצוב של מעכבים באמצעות שיטות חישוביות. ולהקרנה החזותית של כיסים מחייבים עם ספריות מולקולות קטנות.עכשיו יש לנו נתיב להתגבשות של מבנה NEMO מהונדס מורכב עם ליגנדים מולקולה קטנה. כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של סוג חדש של מעכבים.

production-crystallization-structure-determination-ikk-binding-domain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים יישום של אסטרטגיית REPLACE למיקוד אינטראקציות חלבון-חלבון. REPLACE היא אסטרטגיה איטרטיבית הכוללת גישות סינתטיות וחישוביות להמרה של מעכבים פפטידיים אופטימליים למולקולות דמויות תרופות.

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

אנו מתארים מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי פשוט כדי להנחות את האפיון וההתגבשות של תחומי סליל מפותלים גדולים. ניתן להתאים מסגרת זו לחלבונים כדוריים או להרחיב אותה כדי לשלב מגוון טכניקות בעלות תפוקה גבוהה.

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

פרוטוקול לחקירה המקוונת של מבנה רצף החלב-מבנה דינמי באמצעות Bio3D- האינטרנט מוצג.

חקירת חלבון רצף-מבנה-דינמיקה יחסים עם Bio3D-web

קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

חלבונים הקשורים מבחינה מבנית להפעיל לעתים קרובות תפקודים ביולוגיים ברורים. ההחלפה של אזורים המקבילה של חלבונים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric מהווה גישה חדשנית כדי לזהות אזורים קריטיים חלבון אשר אחראים על הבדלי הפונקציונלית שלהם.

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים באמצעות שתי שיטות להכנת דגימה להקפאת רשתות TEM.

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

למד כיצד לקבוע את מבנה התחום המחייב של IKK ב-NEMO בצורתו החופשית באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. פרוטוקול זה מציג שיטות ייצור וגבישות לפיתוח תרופות נגד מחלות דלקתיות ואוטואימוניות.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

גלה סרטונים נוספים