Name: הערמונית תרבויות אורגאיד כמו כלים לתרגם גנוטיפים ופרופילים מוטים לתגובות תרופתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: למדו שיטות סטנדרטיות להערכת תגובות תרופתיות בתרביות אורגאנואידים של הערמונית. הפרוטוקול מאפשר לחקור כיצד הגנוטיפ קובע תגובה תרופתית ולמדל עמידות לתרופות בסרטן הערמונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.P. נתמך על ידי NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. נתמך על ידי HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; וכוכב סרטן קונסורציום. W.R.K. נתמך על ידי הקרן לסרטן הולנדית/KWF Buit 2015-7545 ו סרטן הערמונית הקרן PCF 17YOUN10.

כל העבודה המתוארת בפרוטוקול זה בוצעה עם אורגמונואידים שהוקמו בעבר ומטופלים שמקורם בחולה. כל עבודת בעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות המרכז למשאבי מחקר בעלי חיים של האנדרטה סלואן הטרינג מרכז הסרטן (IACUC: 06-07-012). כל רקמות המטופלים הנגזרות נאספו בהתאם לכללים והתקנות של הזיכרון סלואן הטרינג מרכז הסרטן (IRB: 12001).
1. הכנה בינונית ומאגר
<ol><li>הפשרת מטריצת קרום המרתף (למשל מטריוג'ל) ב -4 ° c לפני תחילת הניסוי. . שמור על הקרח בזמן השימוש</li>
	<li>מניחים לוחות התרבות ב 37 ° c עבור 24 שעות לפני ניסויים. זה יעזור המרתף קרום הממברנה כיפת (להלן המכונה כיפת מטריצה) כדי פולימל. מארגני הציפוי מתוארים בשלב 2.1.2.</li>
	<li>הכינו את המדיום האורגאיד לפי הפרוטוקול הוקם5.</li>
	<li>הכן את המדיום האורגאיד ללא תוספת של גורם גידול באפידרמיס (EGF; ראה טבלת חומרים לרכיבים). EGF מדכאת את התפוקה AR ההמרה ואת הקשר נגד אנדרוגן עמידות5.</li>
	<li>הכנת מדיום הנשר השונה של דולבקה עם 10% סרום של שור עוברי (FBS). הערה: מדיה זו משמשת כדי לעכב את העיכול האנזימטיות באמצעות החלפת טריפסין בסעיפים 2-4.</li>
	<li>הכינו פתרונות סמים בהתאם לפרוטוקול היצרן. עבור enzalutamide/mdv3100 (להלן המכונה הדור השני אנטי אנדרוגן), להכין פתרון מניות של 100 μM ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). ניתן לאחסן את המניה ב-20 ° צ' עד 6 חודשים ואינו צריך להיות טרי.</li>
</ol>2. בידוד, עיכול אנזימטי והקמת אורגנואידים
<ol><li>בידוד אורגנואידים הערמונית מן העכבר או רקמת האדם על פי הפרוטוקולים שנקבעו בעבר5,7. תיאור קצר מסופק להלן.<ol>
<li>האוהב ומעכל את רקמת הערמונית כדי לייצר השעיה תא יחיד. בניסוי זה, 1 מ ל של 5 מ"ג/mL קולגן סוג II ב ADמאמ/F12 שימש לעיכול של 50 מ"ג של רקמת הערמונית.</li>
		<li>לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות, לספור את התאים, להשעות אותם בתוך מטריצת קרום המרתף, ואת הצלחת בצפיפות המתאימה5,7 ב מטריקס כיפות לוחות התרבות טרום החמם (ציפוי שיטה מוצגת באיור 1א).</li>
		<li>הניחו לכיפות לגבש ולהוסיף מדיה לחלק העליון של הכיפות, כך שיהיו מכוסים לחלוטין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לגדל אורגנואידים לכמות הרצויה עבור יישומים במורד הזרם. ניתן לקבוע מספר תא לפי שיטות ספירה סטנדרטיות. עיין בסעיף הספציפי ליישום של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים על דחיסות.</li>
	<li>באמצעות P1000, למשוך את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש. כאשר מטריצת קרום המרתף מופרת לחלוטין, להעביר את ההשעיה ל 15 מ"ל צינור חרוט. אין למקם יותר מ-10 כיפות לשנייה אחת 15 mL בצינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>ותשטוף את הגלולה הסלולרית. עם 5 מ ל של PBS צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. לעכל עבור 5-10 דקות עם טלטול ב 37 ° c. הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>שלוף את הסופר והשהה מחדש. ב-100 מ ג של PBS</li>
	<li>סנן את ההשעיה עם פילטר מ40 יקרומטר כדי להבטיח השעיית תא בודד. לכמת את מספר התא באמצעות התקן הומוציטוטומטר או ספירה שוות ערך. הערה: אם השגת תאים בודדים בעלי הקיימא קשה, השתמש במיון זרימה כדי להשיג פתרון תא בודד.</li>
</ol>3. הערכת קיבולת היווצרות אורגנואיד
הערה: כדי לקבוע את אחוז התאים שיכולים ליצור אורגנואיד, ניתן לבצע שיטת זריעה כפרוקסי לפוטנציאל הגזע/מחולל קדמון. קיבולת היווצרות האורגאיד חשובה גם להגדרת מספר זריעת תאים עבור הכדאיות שאומרת.
<ol><li>לדלל את ההשעיה התא שהושג בשלב 2.7 כדי 100 תאים לכל 10 μL של ההשעיה באמצעות מדיום אורגאיד המכיל 10 μM Rho מעכב את Y-27632.</li>
	<li>העבר 1,100 תאים (110 μL של השעיה) לצינור חרוט חדש.</li>
	<li>הוסף 285 μL של מטריצת קרום המרתף והשהה מחדש את התאים. פעולה זו תגרום לריכוז מטריצות ~ 70%. הערה: דילול מטריצת קרום המרתף במהלך זריעת מפחיתה במידה ניכרת את הווריאציה בגודל הכיפה, הנגרמת על ידי צמיגות של מטריצת החלבון.</li>
	<li>תאים הזרע ב 35 μL של כיפות מטריקס בצלחת טרום מחומם 24 היטב, וכתוצאה מכך 200 תאים/טוב. לוח 3-5משכפל לכל מדגם (ראה גם שיטת הציפוי באיור 1A ו-step 2.1.2).</li>
	<li>כדי להבטיח כי התאים יישארו בתוך כיפת המטריצה, להעיף את הצלחת ולמקם אותו בחממה תא לגבש את מטריצת קרום המרתף.</li>
	<li>לאחר 10 דקות, להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף בינוני המכיל את מעכבי Rho קינאז.</li>
	<li>. תרענן את המדיום כל יומיים , לאחר 7 ימים. מכמת את מספר האורגנואידים שמרו על מעכבי הRho קינאז בתקשורת לאורך הניסוי.</li>
	<li>לספור את מספר אורגנואידים הוקמה לכל כיפה ולחשב את אחוז האורגנואידים נוצר מתוך המספר הכולל של תאים מצופה (200 תאים). הערה: יחסי מוסד אורגנואיד משתנים מ-3%-60% בהתאם לסוג התא ולסוג הגנוטיפ.</li>
</ol>4. קביעת התגובות תרופתי של אורגנואידים
<ol><li>המשך משלב 2.7, זרע 1000-10000 תאים בכיפה של מטריצה. השתמש ביעילות היווצרות ארגונית ובמהירות הגדילה כפרוקסי לקביעת מספר התא הסופי. הערה: מספרי התאים המומלצים מסופקים בטבלה 1. השתמש בשלוש עד חמש שכפול לכל תנאי לכל ניתוח. השתמש בריכוז הסופי של 70% מטריצות קרום המרתף כדי להפחית את שגיאות ליטוף הנגרמת על ידי צמיגות.</li>
	<li>זרעי 35 μL של כיפות מטריקס בצלחת 24 ומאפשרים לכיפות להיות בסעיף 3 (ראה גם שיטת הציפוי באיור 1a ו-step 2.1.2). הוסף מדיום המכיל את מעכבי Rho קינאז ואת סם הבחירה. שיטה זו ניתן להחיל על כל התרופות, אבל בפרוטוקול זה, דור שני אנטי אנדרוגן משמש 10 μM לדוגמה. כדי לקבוע חצי ריכוז העכבות המקסימלי (IC50), בצע log10 מצטבר וכפקד, השתמש ברכב שבו התרופה התפרקה.</li>
	<li>לרענן את המדיום כל שניים או שלושה ימים ולנתח את האורגנואידים ביום 7 כדי לקבוע את התגובה הפרמקולוגית של הסם. נקודות הזמן עשויות להשתנות בין בחירת הניסוי והתרופה. הערה: אורגנואידים אינם חייבים להיות טריסינטזציה לביצוע הפעולות הללו.</li>
	<li>כדי לשמור על אורגנואידים שלמים, באמצעות P1000, למשוך את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף.</li>
	<li>כאשר מטריצת קרום המרתף מופרת לחלוטין, להעביר את ההשעיה ל 15 מ"ל צינור חרוט. אין להעביר יותר מ-10 כיפות מטריצה לכל 15 מ"ל בשפופרת חרוט.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. לצייר את הסופרנטאנט ולשטוף עם 5 מ ל של PBS.</li>
	<li>השהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ ל של PBS ושבש את האורגנואידים באמצעות הטריטורציה ומסכת פסטר מזכוכית.</li>
	<li>מכמת את מספר הקטעים האורגאידים. Seed 5 משכפל המכיל 100 מקטעים אורגנואיד כמתואר בשלב 2.1.2.</li>
	<li>בצע את שיטת הכדאיות הסלולרית כמתואר להלן בסעיף 7.</li>
</ol>5. בידוד רנ א מאורגנואידים
הערה: שיטות מסחריות המבוססות על עמודות מפיקות כמות טובה ואיכות של RNA. כדי להבטיח כמות טובה של RNA, השתמש במינימום של כיפה אחת לכל מדגם; עם זאת, שימוש בשלוש כיפות מומלץ, אשר ניתן לזריעה בבאר אחת של 12 היטב צלחת.
<ol><li>הוסף את זה-mercaptoethanol (1%) למאגר לפירוק גלוטתיון בערכת הבידוד של ה-RNA.</li>
	<li>לצייר את המדיום מתוך כיפות קרום המרתף המכילים אורגנואידים ולהוסיף 750 μL של מאגר זה. הפיפטה עולה ויורדת. בעזרת פיפטה P1000 בדוק כי כל מטריצת קרום המרתף התפרקה.</li>
	<li>הוסף 750 μL של 70% אתנול ולערבב על ידי ליטוף. לאחר מכן העברת 700 μL של התערובת לעמודה, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות, ולחזור עם שאר הליפוסט.</li>
	<li>ביצוע שוטף הטיפול DNase בעמודה על פי הוראות היצרן. אליוט RNA ב 30-50 μL של מים בחינם.</li>
	<li>מדוד את הריכוזים באמצעות פלואורומטר ב-OD = 260 nm ו 280 ננומטר ומאחסנים ב-80 ° צ' או להמשיך עם יישומים במורד הזרם.</li>
</ol>6. בידוד חלבונים מאורגנואידים
הערה: עבור בידוד חלבונים, הכן מאגר ריפה סטנדרטי המכיל פוספספטאז ומעכבי פרוטאז (שולחן חומרים). מומלץ להשתמש לפחות בשלוש כיפות, שניתן לזריעה באחת עשרה היטב.
<ol><li>באמצעות P1000, לצייר את המדיום מתא עם כיפות קרום המרתף המכיל אורגנואידים ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף.</li>
	<li>כאשר שיבשו לחלוטין, להעביר את ההשעיה של 15 מ"ל צינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>משוך את הסופר ולשטוף עם 5 מ ל של הקרח קר PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. עכל עבור 5-10 דקות תוך כדי טלטול ב 37 ° c.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FCS כדי לעכב את החלפת הטריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. הערה: לאחר צנטריפוגה, אין מטריצה קרום המרתף צריך להיות גלוי הגלולה.</li>
	<li>משוך את הסופר ולשטוף עם 5 מ ל של הקרח קר PBS. לצייר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 300 μL של מאגר הליזה באמצעות P1000 pipet, ולאחר מכן להעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>דגירה על קרח 10 דקות ולאחר מכן sonicate 2x עבור 30 כל אחד במים מקורר עם טמפרטורה של 4 ° c. מניחים את הצינור בחזרה על הקרח ומבצעים כימות חלבונים בשיטות סטנדרטיות.</li>
	<li>הספרות חלבון על ידי הוספת נתרן dodecyl סולפט (SDS) המכיל לטעון צבע ומרתיחים עבור 5 דקות ב 95 ° c. אחסן ליטים ב-80 ° צ' או להמשיך עם יישומים במורד הזרם.</li>
</ol>7. שיטת הכדאיות התאית עם אורגנואידים
הערה: ניתן להעריך את הכדאיות של התא באמצעות ערכת שיטת הכדאיות הניידת הזמינה באופן מסחרי ומדידת מהירות. הכן מאגרים לפי הוראות היצרן. מומלץ חמש משכפל לכל תנאי: אחד לשכפל המורכב של 1 35 μL מרתף קרום כיפת מטריקס בבאר אחת של 24 צלחת הבאר.
<ol><li>למשוך את המדיום של התרבות אורגאידית, להיות זהיר להשאיר את הכיפות מטריצה ללא פגע.</li>
	<li>הוסף 65 μL של PBS ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את כיפת המטריצה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מאגר ערכת שיטת הכדאיות של התא והשהה מחדש באמצעות ליטוף.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות עם טלטול.</li>
	<li>העבר 100 μL של התערובת לצלחת שאינה שקופה המתאימה ללומטר ולבצע קריאה בהתאם להוראות היצרן של ערכת הכדאיות של התא.</li>
</ol>8. הכנת אורגנואידים להשתלת השתלה
הערה: הארגון מאפשר גם להשתלת תת עורית בבעלי חיים פרוצים, כמו גם עכברים איזוגניים. כדי להבטיח אורגנואידים מוזרק הם להבדיל בvivo, התווית אורגנואידים עם ביטוי מבחינה מצטברת fluorophore5. מומלץ לבצע ניסוי פיילוט להשתלת השתלה באמצעות 5 x 105 תאים ל-2 x 106 תאים לכל הזרקה, עם דרגות של 5 x 106 תאים, כמו השתלת יעילות משתנה בין קווים אורגנואיד.
<ol><li>באמצעות P1000 הצינורות, לצייר את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. כאשר שיבשו לחלוטין, להעביר את ההשעיה של 15 מ"ל צינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. הערה: אין להעביר יותר מ-10 כיפות מטריצה לכל 15 מ"ל בשפופרת חרוט.</li>
	<li>שלוף את הסופרנטאנט ותשטוף. עם 5 מ ל של PBS צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. עכל עבור 5-10 דקות תוך כדי טלטול ב 37 ° c.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>שלוף את הסופר והשהה מחדש. ב-100 מ ג של PBS סנן את ההשעיה עם פילטר מ40 יקרומטר כדי להבטיח השעיית תא בודד. מכמת תאים באמצעות שיטות סטנדרטיות.</li>
	<li>ספין למטה ולהשעות מחדש את התאים ב-PBS + Rho מעכב לריכוז של 2 x 106 תאים לכל 100 μl (ראה טבלה 2 עבור ריכוזי תאים ומספר תא מוחלט הדרושים ריכוזים שונים). השתמש בנפח שווה של מטריצת קרום המרתף כדי ליצור השעיה 1:1. . שים את ההשעיה על הקרח</li>
	<li>הכנס את התאים בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים של הגידול באמצעותהשיטותהסטנדרטיות של המסך.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162 (2), 454(2015).</li>
<li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+Receptor+Confers+Resistance+to+Antiandrogens+by+Bypassing+Androgen+Receptor+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Mu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+promotes+lineage+plasticity+and+antiandrogen+resistance+in+TP53-+and+RB1-deficient+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer.</a> Science. 355 (6320), 84-88 (2017).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Multipotent+Luminal+Progenitor+Cells+in+Human+Prostate+Organoid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Cultures+Derived+from+Patients+with+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Bose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERF+mutations+reveal+a+balance+of+ETS+factors+controlling+prostate+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis.</a> Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Knockin+Mice+for+Genome+Editing+and+Cancer+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Carver, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+feedback+regulation+of+PI3K+and+androgen+receptor+signaling+in+PTEN-deficient+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer.</a> Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Cultures+Derived+from+Patients+with+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+protein+3+expression+and+therapeutic+targeting+in+neuroendocrine+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Schutgens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubuloids+derived+from+human+adult+kidney+and+urine+for+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. , 1-25 (2017).</li>
</ol>

ג. ל. ס משרתת את מועצת המנהלים של נובארטיס; הוא מהמייסדים של תרופות וממציא של enzalutamide ו apalutamide; הוא יועץ מדעי של אגיוס, בייגן, תוכנית, טור קבוצה, פוגהורן, הודיני פרמה, Nextech, KSQ, פטרה, ו PMV; והוא המייסדים של סרגון, שנרכש על ידי גנאנטק/רוש ב2014. W.R.K. הוא ממציא ומחזיק פטנטים של טכנולוגיית אורגאיד.

הבנת מנגנונים מולקולריים בבסיס אנטי אנדרוגן התנגדות וגילוי פגיעויות טיפוליות פוטנציאליות דורש בדיקה של תגובות תרופתי במערכות מודל מחקה סרטן הערמונית. המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ניתוח אמין של תגובות תרופתי בחולה נגזר ומהונדסים גנטית אורגנואידים הערמונית והכנת דגימות אלה אורגנואיד עבור יישומים במורד הזרם.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא קביעת יעילות הזריעה וקצב הגדילה של האורגנואידים. מהירות הגדילה של אורגנואיד משתנה מאוד. הדבר תלוי במינים, כאשר האורגנואידים הנגזרים מור...

התנגדות לסמים היא אחת הבעיות הקליניות הגדולות בטיפול בסרטן. סרטן הערמונית גרורתי (PCa) הטיפול מופנה בעיקר על ציר האנדרוגן-איתות. הדור הבא נגד אנדרוגן טיפולים (למשל, enzalutamide ו abiraterone) הראו הצלחה קלינית גדולה, אבל כמעט כל PCa בסופו של דבר מתקדם לקראת המדינה אנדרוגן עצמאי, או סרטן הערמונית עמידים בפני סירוס (CRPC).
לאחרונה גנומית ופרופיל transcript של CRPC חשף יש שלושה מנגנונים כלליים של התנגדות בסרטן הערמונית: 1) הפעלת מוטציות וכתוצאה מכך שחזור של קולטן האנדרוגן (AR) איתות1; 2) הפעלה של מעקף איתות, כפי שניתן לדוגמה במודל טרום קליני עבור הדור הבא אנטי אנדרוגן התנגדות טיפול שבו הפעלה של קולטן glucocorticoid (GR) יכול לפצות על אובדן AR איתות2; ו 3) את התהליך שזוהה לאחרונה של הפלסטיות היוחסין, שבו תאי הגידול לרכוש התנגדות על ידי מיתוג שלינים מסוג תא תלוי ביעד התרופה לסוג תא אחר שאינו תלוי בפעולה זו (אשר, ב-PCa, מיוצגת כ-AR-שלילי ו/או מחלה נוירואנדוקריניים [nepc])3,4. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הגורמים להתנגדות לסמים אינם מובנים. יתרה מזאת, ההתנגדות הנרכש נגד אנדרוגן עלולה להוביל לפגיעויות טיפוליות שניתן לנצל. לכן, זה חיוני כדי להעריך את התגובות הסמים במערכות מודל לחקות פנוטיפים המטופל, גנוטיפים.
אורגנואידים של הערמונית הם תרבויות אורגאוטימית שגדלו במטריצת חלבון תלת ממדית עם מדיום מוגדר. חשוב מכך, אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מרקמת שפירים סרטניים של מוריין או מוצא אנושי, והם שומרים על תכונות פנוטימית ו-גמישות פנוטיפית נמצאו ב vivo5,6. חשוב מכך, הן אנטי אנדרוגן רגיש PCa ו-CRPC תאים מיוצגים באוסף הנוכחי של אורגנואידים. יתר על כן, אורגנואידים הערמונית הם בקלות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין5. לפיכך, אורגנואידים של הערמונית הם מערכת המודל המתאים לבדיקת היענויות לסמים ולהבהיר מנגנוני התנגדות. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבצע בדיקות סמים ולנתח תגובות תרופתי באמצעות אורגנואידים הערמונית.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד: ריכוז סופי 200 ננומטר</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>טכנולוגיות Gibco/Life 12634028</td><td></td><td>רכיב בינוני אורגנואיד</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life טכנולוגיות</td><td>17504-044</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד</td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים</td><td>פישר</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>טיטר תאים גלו</td><td>פרומגה</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>רכיב בינוני אורגנואידי: ריכוז סופי 1 ננומטר</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>פישר</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>רכיב בינוני אורגנואידי: ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל לעכבר, 5 ננוגרם/ננול לאדם</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד ספציפי לאדם: ריכוז סופי 10 ננוגרם/ מ"ל</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד ספציפי לאדם: ריכוז סופי 5 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>טכנולוגיות Glutamax</td><td>Gibco/Life 35050079</td><td></td><td>רכיב בינוני אורגנואיד</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>תוצרת בית</td><td>N/A</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד: ריכוז סופי 10 מ"מ</td></tr><tr><td>מטריג'ל (גורם גדילה מופחת & פנול אדום חופשי)</td><td>קורנינג</td><td>CB-40230C</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד</td></tr><tr><td>N-אצטיל-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td>רכיב בינוני אורגנואידי: ריכוז סופי 1.25 מ"מ</td></tr><tr><td>ניקוטינמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636</td><td>רכיב בינוני אורגנואיד ספציפי לאדם: ריכוז סופי 10 מ"מ</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech או תאי 293t יציבים עם מבנה נוגין (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>אורגנואיד רכיב בינוני: ריכוז סופי 10% מדיום מותנה או 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטווידין</td><td>ג'מיני ביו-מוצרים</td><td>400-109</td> מעכבי פוספטאז <td>אורגנואידים בינוניים</td></tr><tr><td>Merck</td><td>Millipore</td><td>524629</td><td></td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין E2</td><td>Tocris</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Merck Millipore</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Peprotech או תאי 293t שעברו טרנספטציה יציבה עם מבנה R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>רכיב בינוני אורגנואידי: ריכוז סופי 10% מדיום מותנה או 500 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר RIPA</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>מיניקיט קל RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp; ממשק=CAS%20No.& lang=en& region=US& focus=product">152121-30-7</a></td><td>רכיב בינוני אורגנואיד ספציפי לאדם: ריכוז סופי 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>רכיב בינוני אורגנואידי: ריכוז סופי 10 &mu; מ</td></tr></tbody></table>

הערמונית תרבויות אורגאיד כמו כלים לתרגם גנוטיפים ופרופילים מוטים לתגובות תרופתי

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור פרמקודינמיקה, תא גזע פוטנציאל, סרטן בידול הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים הערמונית הם אנדרוגן תגובה, תלת מימדי (3D) תרבויות גדל במדיום מוגדר הדומה אפיתל הערמונית. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מסוג פראי ומהונדסים גנטית מודלים העכבר, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם. חשוב מכך, המטופל נגזר אורגנואידים הדומה לגידולים בגנטיקה ובביולוגיה גידול vivo. יתר על כן, אורגנואידים יכול להיות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין מערכות. אלה גנטיקה מבוקרת להפוך את התרבות אורגאיד אטרקטיבי כפלטפורמה בדיקות במהירות את ההשפעות של גנוטיפים ופרופילי מוסיקה על תגובות תרופתי. עם זאת, פרוטוקולים ניסיוניים חייב להיות מותאם במיוחד לטבע תלת-ממדי של תרבויות אורגנואיד כדי להשיג תוצאות הניתנות לאחזור. המתואר כאן הם פרוטוקולים מפורטים לביצוע זריעת שאומר לקבוע קיבולת היווצרות אורגאיד. לאחר מכן, דו ח זה מראה כיצד לבצע טיפולי סמים ולנתח את התגובה הפרמקולוגית באמצעות מדידות כדאיות, בידוד חלבונים ובידוד RNA. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד להכין אורגנואידים עבור השתלה של שתלה לאחר מכן בעקבות צמיחה vivo באמצעות השתלה תת עורית. פרוטוקולים אלה מניבים נתונים מאוד מתוכחלים ומתאימים באופן נרחב למערכות התרבות התלת-ממדית.

זריעת יעילות קיבולת היווצרות אורגאיד נקבעת על-ידי פנוטיפ וגנוטיפ. מסוג פראי (WT) הערמונית תאים בסיס הראה קיבולת היווצרות ארגונית מעולה (30%-40%) לעומת תאי לומיאל (3%) (איור 1א). , לאחר הקמתה של הארגון. קיבולת המבנה הוגדלה באופן דרסטי בדרך כלל, 25%-30% מהתאים הנגזרים מאורגנואיד של WT יכולים ליצור אורגאיד חדש (איור 1B). CRISPR/Cas9-בתיווך אובדן Pten (PtenΔ/Δ) או p53 (...

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד תגובות תרופתי ב אפיתל הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים דומה מאוד בביולוגיה vivo וגנטיקה של החולה המטופל, מה שהופך אותם מערכות מודל אטרקטיבי. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מתוך prostates מודלים העכבר מהונדסים גנטית, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם.

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

פרוטוקול זה מספק שיטות סטנדרטיות לשחזור להערכת תגובות פרמקולוגיות בתרבויות אורגנואיד הערמונית. תרבויות אורגנואיד הערמונית לספק מערכת במבחנה המשמר היבטים רבים של ביולוגיה in vivo ותגובה פרמקולוגית על ידי מתן תאים לאמץ מבנה תלת מימדי מטריצת קרום במרתף. אנו נרגשים במיוחד להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך כיצד גנוטיפ מכתיב תגובה תרופתית בערמונית ולדגמן עמידות לתרופות.ניתן ליישם שיטות אלה על מערכות תרבות אורגנואידיות שמשתמשות בשיטת ציפוי הכיפה. עם זאת, הרכיבים במדיה כגון גורמי גדילה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הרקמה. הדגמה חזותית תאפשר דיון ספציפי ומפורט יותר של שלבי הפרוטוקול וכיצד הם שונים מהמערכות הרבות האחרות לתרבות האורגנואידים שפורסמו העומדות לרשות החוקרים.תרבות אורגנואידית היא בדרך כלל יותר זמן רב מאשר תרבות תאים דו מימדית. הקפד להקצות זמן נוסף עבור שיטות אלה. התחל על ידי בידוד אורגנואידים הערמונית מעכבר או רקמה אנושית.טחון אנזימטי לעכל את הרקמה כדי לייצר השעיה תא יחיד, ולאחר מכן לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. לספור את התאים ולתלות אותם מחדש במטריצת קרום המרתף. ואז צלחת אותם בצפיפות המתאימה כיפות מטריקס על צלחות תרבות אורגנואידים מחומם מראש.כיפות צריכות להיות שני מילימטרים זה מזה ומהסיד של הגם. לאחר ההתגבשות, הוסיפו בעדינות מדיה מהצד של באר כדי למנוע שיבוש של המטריצה. לאחר כיפות התגבשו, להוסיף מדיה על גבי הכיפה, כך שהם מכוסים לחלוטין.הגדל אורגנואידים לכמות הרצויה עבור יישומים במורד הזרם הקובעים את מספר התא בשיטות ספירה סטנדרטיות. כאשר האורגנואידים מוכנים לשימוש, צייר את המדיום עם פיפטה Pten00 ו pipette אותו למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. מעבירים את ההשעיה לצינור חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.שאפו את העל-טבעי ושטפו את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של PBS. חזור על הצנטריפוגה, ולאחר מכן resuspend את גלולה בארבעה מיליליטר של החלפת טריפסין ולאפשר לו לעכל במשך חמש עד 10 דקות תוך רועד ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד עם 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן מסננים את התאים עם מסנן 40 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה של תא יחיד ולספירתם באמצעות המוציטמטר. לדלל את ההשעיה התא ל 100 תאים לכל 10 microliters באמצעות מדיום אורגנואיד עם 10 מעכבי micromolar rho kinase Y27632.העבר 1, 100 תאים לצינור חרוט חדש ולהוסיף 285 microliters של מטריצת קרום מרתף אשר יגרום ריכוז מטריצה 70%. לאחר מכן, זרע את התאים ב 35 microliters של כיפות מטריצה בצלחת 24 באר מחומם מראש הקפדה צלחת שלושה עד חמישה שכפולים לכל מדגם. הפוך את הצלחת והצב אותה באינקובטור תאים כדי לחזק את מטריצת המרתף.לאחר 10 דקות, להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף בינוני המכיל את מעכבי rho kinase. רענן את המדיום כל יומיים ולאחר שבעה ימים, לספור את מספר האורגנואידים הוקמה לכל כיפה ולחשב את אחוז האורגנואידים שנוצרו מתוך המספר הכולל של תאים. לאחר בידוד האורגנואידים כפי שתואר קודם לכן, זרע 1, 000 עד 10, 000 תאים בכיפת המטריצה באמצעות יעילות היווצרות אורגנואידים ומהירות צמיחה כנציג לקביעת מספר התא הסופי.ואז זרעים 35 microliters של כיפות מטריקס בצלחת 24 היטב ולתת את הכיפה להתגבש. הוסף בינוני המכיל את מעכבי rho kinase ואת התרופה של בחירה. בצע יומן 10 מצטבר כדי לקבוע ריכוז מעכבות חצי מקסימלי באמצעות הרכב שבו התרופה הומסה כפקד.רענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים ונתח את האורגנואידים ביום השביעי כדי לקבוע את התגובה הפרמקולוגית לתרופה על ידי ביצוע בדיקת כדאיות התא כמתואר בכתב היד. כדי צלחת שברי אורגנואיד ללא טריפסיניזציה, להשתמש Pten00 פיפטה כדי לשאוף את המדיום ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. כאשר המטריצה משובשת לחלוטין, להעביר את ההשעיה לצינור חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.שאפו את העל-טבעי והוסיפו חמישה מיליליטר של PBS. לאחר הכביסה, תן שימוש חוזר באורגנואידים במיליליטר אחד של PBS ושבש את האורגנואידים על ידי טריטורציה עם פיפטה פסטר זכוכית. לכמת את מספר שברי אורגנואידים וזרע חמישה שכפולים עם 100 שברים כפי שתואר קודם לכן.שבעה ימים לאחר מכן, בצע בדיקה של כדאיות התא בהתאם לכיווני כתב היד. תאים בזליים של הערמונית מסוג פראי הפגינו היווצרות אורגנואידית מעולה בהשוואה לתאי זוהר. עלייה קלה היווצרות אורגנואיד הושגה עם אובדן CRISPR-Cas9 מתווך של Pten או P53 ואובדן של שניהם גדל עוד יותר יכולת היווצרות.ההשפעות של מולקולות אנטי אנדרוגנית על הצמיחה נבדקו אורגנואידים מורין עם גנוטיפים שונים. אובדן P53 לא גרם להתנגדות למולקולות האנטי אנדרוגניות, אך אובדן פנטן הגביר את ההתנגדות. אובדן כפול של P53 ו Pten, לעומת זאת, הביא להתנגדות מוחלטת.עיכוב קולטן אנדרוגן גם שינה פנוטיפים. פרא סוג Pten נמחק P53 אורגנואידים שנמחקו הדגימו את הירידה בגודל לומן אורגנואיד בעוד אורגנואידים עם אובדן של Pten ו P53 לא הושפעו פנוטיפית. כצפוי, כאשר תאים אלה היו מושתלים תת עורית באגף, רק האורגנואידים Pten ו- P53 שנמחקו כפול גדלו.שני אורגנואידים שונים של סרטן הערמונית האנושי MSKPCA2 ו MSKPCA3 נבדקו לתגובתם למולקולות אנטי אנדרוגניות. התפשטות האורגנואידים MSKPCA2 היה מעוכב מאוד ואילו אורגנואידים MSKPCA3 נשארו מושפעים. MSKPCA2 הביע רמות גבוהות של קולטני אנדרוגן ו FKBP5, כמו גם חלבונים זוהרים סימן ההיכר.MSKPCA3 גם ביטא סמנים בסיסיים ומזנצ'ימליים ולא הראה שום ביטוי של FKBP5 המצביע על כך שאיברואידים אלה מודל פנוטיפ שאינו זוהר אנדרוגן עצמאי. אורגנואידים צריך להיות משובש מעת לעת או על ידי טריפסיניזציה או טריטורציה עם פיפטה זכוכית על מנת להישאר קיימא. התדירות תלויה במקור המינים ובגנוטיפ.כל סוג של רצף הדור הבא או ניסוי פרוטומי ניתן לבצע בעקבות ההליכים המתוארים. ניסויים אלה יחקרו את הבסיס המולקולרי של הפנוטיפים והתגובות הפרמקולוגיות. טכניקת תרבות אורגנואידית תלת מימדית זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובות תרופתיות בהקשר גנטי מבוקר מאוד במבחנה.זו יכולה להיות חלופה אמינה ללימודי vivo ארוכים.

prostate-organoid-cultures-as-tools-to-translate-genotypes-mutational

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדריך טיפול אנושי תא צורב הערמונית הראשי ולאחר מכן מציע נקודות קצה כדי להעריך פנוטיפ. זריעה, תרבות תחזוקה, התאוששות מטריקס ג'ל, כימות מורפולוגיות, הטבעה, חלוקתה, חלוקתה FFPE, כולה-הר מכתים, ויישום של מבחני מסחרי מתוארים.

הטיפול והערכה של התרבות האנושית תא צורב הערמונית ראשי

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

הערמונית העכבר אורגנואידים לייצג הקשר מבטיח להעריך מנגנונים המסדירים בידול. המאמר מתאר גישה משופרת להקמת אורגנואידים הערמונית, ומציג שיטות (1) לאסוף חלבון ליפוסט מאורגנואידים, ו (2) לתקן וכתמי מיקרונואידים עבור מיקרוסקופ ההרכבה המלא.

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

תרבויות תלת ממדיות של החולה BMPC דגימות ו xenografts של סרטן הערמונית גרורתי העצם לשמור על טרוגניות תפקודית של גידולים המקורי שלהם וכתוצאה מכך ציסטות, spheroids ו מורכבים, גידול כמו אורגנואידים. כתב יד זה מספק אסטרטגיה מיטוב ופרוטוקול לתרבות תלת-ממדית של מטופלים הטרוגנית דגימות נגזרות והניתוח שלהם באמצעות IFC.

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

פרוטוקול זה מתאר הערכה מתוקננת של רגישויות לתרופות למעכבי איתות ממוקדים במודלים אורגנויד שמקורם בחולה NSCLC.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

הטרוגניות של סרטן הערמונית ועמידות לטיפול נותרו אתגרים. אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) המשמרים את מאפייני הגידול ההורי המרכזיים. מודל סטנדרטי זה תומך בבדיקת תרופות ובהתקדמות ברפואה מדויקת.

הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה: פרוטוקול ניסיוני מפורט

פרוטוקול זה מתאר את יצירת מודל אורגני מבוסס ערמונית בעכברים שגדל בדו-ממד. הוא כולל דיסוציאציה אורגנואידית, זריעת תאים, התמיינות, הערכת שלמות אפיתל וזיהום חוץ-גופי עם אשריכיה קולי אורופתוגנית. המודל מספק נגישות אפיקלית ומתאים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך התגברות על מגבלות של מערכות אורגניות תלת-ממדיות מסורתיות.

יצירת מודל מבוסס אורגנואידים בערמונית בעכבר לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

למדו שיטות סטנדרטיות להערכת תגובות תרופתיות בתרביות אורגאנואידים של הערמונית. הפרוטוקול מאפשר לחקור כיצד הגנוטיפ קובע תגובה תרופתית ולמדל עמידות לתרופות בסרטן הערמונית.

הערמונית תרבויות אורגאיד כמו כלים לתרגם גנוטיפים ופרופילים מוטים לתגובות תרופתי

גלה סרטונים נוספים