Name: בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד שיטה לבידוד מיקרוגליה מאזורים שונים במוח העכבר לרצפי RNA של תא יחיד. הפרוטוקול כולל מיון FACS והכנת ספרייה אוטומטית לחקר הטרוגניות תפקודית של תאי מערכת החיסון במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למריקו ל. בנט, ליאנה ניקול בונאנו, ו Spyros דארמני על עזרתם במהלך פיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים גם למתקן ה-FACS המשותף של סטנפורד, במיוחד מרדית ווגלז וליסה ניקולס; ין טראן, מייקל Eckart מאוניברסיטת סטנפורד וחומצות גרעין מתקן (פאן) על התמיכה הגדולה שלהם לצילום. עבודה זו ממומנת על ידי קרן JPB ו וינסנט ג'יי קוטס.

כל ההליכים מעורבים מכרסמים להתאים הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, אשר עומדים בפני חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בעלי חיים אושרו על ידי פאנל מינהלי של אוניברסיטת סטנפורד על טיפול בעלי חיים מעבדה.
הערה: כל קומפוזיציות הפתרונות והמאגרים ניתנים ברשימת חומרים.
1. הכנה ביום הבידוד התאי
<ol><li>להכין את הריאגנטים הבאים ולצנן אותם על הקרח: בינוני A (50 mL), תא מגנטי המופעל מיון (MCS) מאגר (30 mL), מאגר FACS (25 מ"ל), פוספט באגירה מלוחים (PBS; 30 mL), DNase (320 μL), ו-RNase מעכב (30 הערה: אמצעי האחסון המסופקים כאן מספיקים כדי לבודד מיקרוגלייה מ 4 אזורי המוח (למשל, קליפת המוח הזעירה, ההיפוקמפוס והסטריאטום) של האונה האחת של המוח העכבר. הקנה מידה אם נעשה שימוש ברקמות נוספות.</li>
	<li>מקום ארבע נקי 2 מ"ל המגון הומוזים על הקרח ולהוסיף 2 מ ל של בינוני A עם 80 μL של DNase (12,500 יחידות/mL) ו-5 μL של מעכבי RNase לתוך כל הומוגניד1. לצנן את הפיסטונס ב 15 מ ל צינורות.</li>
	<li>תווית 4 6 ס מ מנות פטרי עם מחוזות המוח לאוסף רקמות ולהוסיף 200 μL של בינוני קר A לתוך כל מנה על הקרח. הוסיפו כ-5 מ ל בינוני בצלחת פטרי בגודל 6 ס מ לניתוח. הערה: לפני השימוש, לוודא שכל הריאגנטים הם סטרילי מתאים ליישומים RNA. כלי הספסל והחיתוך צריך להיות נקי ומרוסס עם פתרון טיהור RNase (טבלת חומרים).</li>
</ol>2. מחוז המוח חיתוך
הערה: שלב זה אמור להימשך ~ 30 דקות.
<ol><li>הכנס 400-כ 500 μL של קטמין/xylazine (24 מ"ג/מ"ל קטמין ו 2.4 mg/mL xylazine) לתוך צפק של קטין לעכבר בשלב מבוגר (> 1 חודש). הערה: עכבר גברי משמש כאן להמחשה, אבל או מגדר מתאים.</li>
	<li>לחכות 5 דקות וקמצוץ רגל האחוריות כדי להבטיח חוסר הנסיגה.</li>
	<li>באופן מיידי להשתמש 26 G x 3/8 מחט לבצע מיזוג באמצעות 20 ל 30 מ ל של הקרח קר PBS עד מאגר אוזל ללא דם גלוי.</li>
	<li>הוא ערוף את ראשו של העכבר. עם זוג מספריים כירורגיים להשתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת מתחת, ולאחר מכן לחתוך את התפר המשונן, תפר מ, ותפירה מקורלית. מלקחיים להשתמש כדי למשוך את שני הצדדים של עצם הקודקוד ועצם הקודקוד מבלי לפגוע ברקמה, ובזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי בינונית.</li>
	<li>השתמש להב מראש מקורר לחתוך את המוח דרך קו האמצע לשתי אונות. הערה: ארבעת האזורים המוח שתוארו כאן מתוך האונה אחד התשואה מספר מספיק של מיקרוגלייה עבור תא יחיד או בתפזורת RNA-seq יישומים. בחצי הכדור השני ניתן להשתמש עבור אימונוהיסטוכימיה או RNA באימות באתרו.</li>
	<li>הפרד את המוח החצי מהאונה הקורטיקלית ואת גזע המוח עם מלקחיים #55 ולהעביר את הרקמה לתוך אוסף צלחת פטרי.</li>
	<li>השתמש #55 מלקחיים כדי לנתח בזהירות את ההיפוקמפוס ואת הסטריאטום מקליפת המוח ולהעביר כל רקמה לתוך אוסף צלחת פטרי.</li>
</ol>3. רקמת דיסוציאציה מכנית
הערה: לשמור על תאים וריאגנטים מגניב כל הזמן, למעט במהלך מכתים שלבים. שלב זה אמור להימשך ~ 30 דקות.
<ol><li>קוצצים כל רקמת מוח עם להב תער לתוך < 1 מ"מ3 חתיכות קנס.</li>
	<li>השתמש בפיפטה 1 מ ל (עם טיפים לחתוך) כדי להעביר את חתיכות הרקמה לתוך מקורר לפני העור Dounce הומוזים, כל אחד המכיל 2 מ ל של בינונית A עם DNase ו-RNase מעכב.</li>
	<li>המגון לסדר את הרקמה על ידי הטיית באיטיות את הבוכנה פנימה והחוצה של מכשיר ההומוגניזה של הדיאונקיה עבור 6-10 משיכות מלאות, עד שלא קיימים גושים גלויים. הערה: Douncing הורג נוירונים ותאים גליה ביותר אחרים אבל לעזוב את התאים microglial ולא שלמים. שניהם לא מספיקים ו-over-douncing יכול לגרום לתשואה נמוכה של תאים.</li>
	<li>העברת רקמות שאינן מקבילות לתוך צינורות 50 mL דרך 70 יקרומטר בכיינים.</li>
	<li>לשטוף כל הומוגנידצר בוכנה עם סכום כולל של 6 מ ל של בינוני קר A ולסנן את פתרון השטיפה דרך מסננת אותו לתוך הצינור המקביל.</li>
	<li>להעביר את השעיות התא בודד (כ 8 mL כל) לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' עם בלם = 5.</li>
</ol>4. הסרת מיאלין
הערה: שלב זה צריך לקחת ~ 60 דקות.
<ol><li>הכן 1 עמודת דלדול (LD) גדולה (לקליפת קליפה) ו-3 עמודות מבחר גדולות (LS) (עבור 3 האזורים האחרים) במפריד מגנטי (טבלת חומרים). שטפו כל עמודה עם 3 מ ל של מאגר MCS.</li>
	<li>ברגע שצנטריפוגה מסתיים, הצינורות החוצה וזורקים את הסופרנטאנט בלי להפריע לגלולה. לגבי קליפת המוח ורקמות המוח, השהה מחדש תאים ב-850 μL של מאגר MCS עם 1.8 μL של מעכב RNase. עבור רקמות ההיפוקמפוס ו סטריאטום, השעיית התאים מחדש ב-400 μL של מאגר MCS עם 0.9 μL של מעכב RNase. הערה: העמודים (LD לעומת LS) ואמצעי האחסון המשמשים לההשעיה ממוטבים על בסיס כמות המיאלין הקיימת ברקמה. אם אזורים אחרים במוח מאחרים, ייתכן שיהיה צורך לכוונן תנאים אלה בהתאם לגודל הרקמה ולכמות המיאלין העשויה להתקיים. האפקטיביות של הסרת המיאלין יכול להיות מוערך בשלב 4.9.</li>
	<li>הוסף 100 μL של חרוזים הסרת המיאלין כל אחד לתוך תאים מקליפת המוח ולהוסיף 50 μL של חרוזים הסרת המיאלין כל אחד לתוך תאים מהיפוקמפוס וסטריאטום.</li>
	<li>בעדינות לערבב את התאים עם חרוזים ו-מודטה את הצינורות על הקרח 10 דקות.</li>
	<li>הביאו את עוצמת השפופרת עם תאים קורטיקליים ל -2 מ ל עם מאגר MCS, וכל האחרים ל-1 מ ל (כלומר, מוסיפים 1 מ ל לתאי קליפת המוח; 500 μL עבור תאים היפוקמאל וסטרילאטאל; אין צורך להוסיף מאגר לתאים מקרבלאר).</li>
	<li>לאחר שהעמודות ריקות ממאגר השטיפה, הניחו שפופרת של 15 מ ל מתחת לכל עמודה. טען תאים קורטיקלית (2 מ ל) לעמודת ה-LD, וכל האחרים (1 mL כל אחד) על העמודות LS. מיד להשתמש 1 mL של מאגר MCS כל אחד כדי לשטוף את הצינורות המקוריים ולטעון את הפתרון על העמודות המתאימות.</li>
	<li>שטוף את עמודת ה-LD פעם אחת עם 1 מ ל של מאגר MCS ושטוף כל עמודה LS פעמיים עם 1 מ ל של מאגר MCS כביסה. המשך לאסוף את פתרון הזרימה במהלך הכביסה.</li>
	<li>לסנן את התאים לתוך צינורות facs לתחתית עגול באמצעות כמוסות מסננת 35 יקרומטר. הערה: כל צינור צריך לאסוף כ 4 מ ל של השעיית תא יחיד מרוקן של מיאלין.</li>
	<li>באופן אופציונלי, לקחת 10 μL של ההשעיה התא ולערבב אותו עם 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר 10x כדי להעריך את התשואה, שיעור ההישרדות ואת רמת המיאלין שיורית. הערה: הכנה מוצלחת צריך ליצור מעל 90% תאים חיים (עגול בצורה ולא להוציא את הצבע הכחול) עם מעט ללא פסולת מיאלין.</li>
	<li>גלולה תאים בצינורות FACS ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, עם בלם = 5. שופכים לאט החוצה את הסופר ומזגו את קצה הצינור על נייר טישו. השהה תאים מחדש בכל צינור עם 300 μL של מאגר FACS. הערה: אם מיון mcs הוא המועדף, CD11b חרוזים ניתן להשתמש כדי לבחור מיקרוגלייה ותאים אחרים מיאלואידים בעקבות הסרת מיאלין. תאים אלה יכולים לשמש לאחר מכן עבור שאינם מבוססי לוח scRNA-seq כמו גם בצובר RNA-seq. האזהרה של גישה חלופית זו היא כי חרוזים CD11b לא להפריד מיקרוגלייה מתאים אחרים החיסונית הקשורים אשר גם חיובית עבור אנטיגן זה.</li>
</ol>5. צביעת עבור מיון התא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית
הערה: שלב זה צריך לקחת ~ 40 דקות.
<ol><li>הוסף 5 μL של העכבר קולטנים לחסום מגיב (לוח חומרים) לתוך כל צינורית. מודקון למשך 5 דקות על הקרח.</li>
	<li>הוסף 1 μL של CD45-PE-Cy7 ו-1 μL של CD11b-BV421 לתוך כל צינורית. הערה: נוגדנים עם fluorophores אחרים עשוי לשמש. נוגדנים נגד TMEM119, סמן ספציפי עבור הומאוטיות מיקרוגלייה9, ניתן גם לכלול, אבל זה מומלץ לשמש יחד עם CD45 ו CD11b, כי מספר אוכלוסיות מיקרוגלייה מסוימות עלול לאבד TMEM119 הביטוי פני השטח.</li>
	<li>מודטה את הצינורות על שייקר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הוסף 2 מ ל של מאגר FACS כדי לשטוף.</li>
	<li>כדוריות התאים ב 4 ° צ', 400 x g עבור 5 דקות לאט לשפוך supernatant ולטפוח על הקצה של הצינור על נייר טישו. השעיה מחדש של תאים בכל צינור באמצעות 400 μL של מאגר FACS עם 1 μL של מעכב RNase ו 0.5 μL של propidium יודיד (PI, 1:1000 דילול).</li>
</ol>6. מיון FACS באינדקס
הערה: . השלב הזה אמור לקחת ~ 1 h
<ol><li>בעקבות נוהל FACS סטנדרטי, לצייר שערים המבוססות על פיזור (לא כולל פסולת), תאים בודדים, תאים חיים (PI שלילי), מיקרוגליה תאים מיאלואידים (CD45+, CD11b+). הערה: תאים microglial אופייני express CD45 ברמות נמוכות יותר לעומת מקרופאגים אחרים הקשורים בגבול, כגון perivascular ו-מקרופאגים של מנצ, ולכן על CD45 low CD11b+ צריך להיות מספיק אם המוקד של המחקר הוא ביטוי גנים פרופילים אלה מיקרוגלייה קלאסי1,2. עם זאת, מערכות משנה מסוימות של מיקרוגלייה יכול להיות גבוה יותר ביטוי CD45 וזה נכון במיוחד במהלך הפיתוח או בתנאי מחלה. כדי להבטיח ניתוח לא משוחדת של ביטוי הגנים microglial, CD45 גבוהה CD45 החיסונית נמוכה ניתן להקליט באמצעות הגדרת מיון המדד ושתי האוכלוסיות שנאספו לניתוח רצף במורד הזרם. בנוסף, TMEM119 ביטוי פני השטח עשוי לשמש כדי למקד את אוכלוסיית microglial הומאטית (ראה שלב 5.2) ונותחו יחד עם רמות CD45 ואת התוצאות הרצף.</li>
	<li>מיון מיקרוגלייה יחיד (עם זרבובית 100 יקרומטר) לתוך 96-ובכן פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צלחות, המכיל 4 μl של מאגר הליזה כל טוב (עיין בפרוטוקול שפורסם14 לפרטים). הערה: הקונסורציום החיצוני בקרת RNA (ERCC) RNA ספייק-in mix (טבלה של חומרים) ניתן להוסיף ב 1:2.4 x 107 במאגר הליזה למטרות בקרת איכות ונורמליזציה2.</li>
	<li>מערבולת בקצרה את הצלחות. ומסתובבת באמצעות צנטריפוגה מלמעלה</li>
	<li>הקפא מיד את הדגימות על הקרח היבש. אחסן את הצלחות ב-80 ° צ' עד להכנה לספרייה. הערה: לחילופין, תאים נוספים ניתן לאסוף לתוך 1.5 mL צינורות עם מאגר החילוץ RNA עבור רנ א-seq בצובר. על פי הניסיון של המחברים, 3,000 תאים מספיקים כדי ליצור ספריות באיכות טובה לאחר הפרוטוקול שפורסם2,14.</li>
</ol>7. הכנה לספריית RNA ברצף של תא יחיד
הערה: כאן, הפרוטוקול שפורסם14 מלווה בהפקת ספריות scRNA-seq בעזרת רובוטיקה לטיפול נוזלי וכמה שינויים. במאמר זה, ההליך מתואר רק בקצרה, וההבדלים מודגשים. עיבוד 4 צלחות בו לוקח בערך 2.5 ימים.
<ol><li>הפשרת צלחות על קרח ולבצע תמלול הפוכה עם Oligo-dT30VN פריימר (במאגר הליזה) כדי ליצור cDNA עם ציקלנים תרמית (שולחן 1): 42 ° c 90 דקות; 70 ° c, 5 דקות; 4 ° c להחזיק. לאחר מכן להגביר את cDNA עם העיכול תוספת בדקה בתחילת (שולחן 2) באמצעות התמהיל הראשי pcr ו-pcr באתרו (ispcr) התחל (טבלת חומרים) ואת המצב הבאים Pcr: 37 ° צ' 30 דקות; 95 ° c 3 דקות; 23 מחזורים של 98 ° c, 67 ° c, 72 ° צ' 4 דקות; 72 ° c, 5 דקות</li>
	<li>טיהור cDNA באמצעות 18 μL של חרוזים מגנטיים לכל טוב (0.7:1 יחס). מודקת את הצלחת על דוכן מגנטי עבור 5 דקות ולשטוף דגימות פעמיים עם טרי שנעשו 80% אתנול, 80 μL לכל טוב בכל פעם. לאחר ייבוש את הצלחת עבור 15-20 דקות, elute cDNA לאחר מכן עם 20 μL של מאגר הימנעות לכל טוב. הערה: עבור בקרת איכות, השתמש מנתח קטע (רגישות גבוהה ברצף הדור הבא [NGS] ניתוח קטע, 1-6000 bp) כדי לבדוק גודל הפצות וריכוזים של cDNA, רק עוד דגימות התהליך עם הכתם בין 500-5000 bp, ויותר מ 0.05 ng/μL.</li>
	<li>כדי ליצור ספריות, לערבב 0.4 μL של כל דגם cDNA עם 1.2 μL של Tn5 tagmentation מערכת הכנת הספרייה (טבלת חומרים) בצלחת 384-באר עם הסיוע של מכונת ההכנה של nanoliter, ב 55 ° c 10 דקות. הערה: כאן, 1/12.5 של נפח התגובה המוצע (5 μL לדוגמה ו-15 μL של החומרים האחרים) מתווסף כדי להפחית את העלות ובינתיים להגדיל את התפוקה. מכונת פיאוליטר ליטוף (טבלת חומרים) משמשת להעברת ריאגנטים (זה והצעדים הבאים) מ ועד 384-צלחות.</li>
	<li>הוסף 0.4 μL של נטרול מאגר כדי להפסיק את תגובת הטמנטציה ב-RT עבור 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 384 אינדקסים (טבלת חומרים, 0.4 μl קדימה ו 0.4 μl הפוך), 1.2 μl של שילוב PCR לדגימות (2 μl כל אחד), ולהגביר את הספריות באמצעות התנאי הבא: 72 ° צ' 3 דקות; 95 ° c; 10 מחזורים של 95 ° c, 55 ° צלזיוס 30, 72 ° צ' 1 דקות; 72 ° c, 5 דקות</li>
	<li>בריכת כל הספריות הבודדות (לקחת 1 μL כל אחד) מאותה צלחת 384-ובכן יחד, ולהשתמש חרוזים מגנטיים (טבלת חומרים, 0.7:1 יחס) כדי לטהר את הספריות האחרונות במאגר.</li>
	<li>השתמש בפלואורומטר (טבלת חומרים) כדי למדוד את הריכוזים ואת bioanalyzer (טבלת חומרים) כדי לבחון את הפצות הגודל של ספריות במאגר לפני הרצף. מקד את עומק רצף ב 1,000,000 raw קריאות לכל תא.</li>
	<li>בצע את ההליכים הביומטיים הסטנדרטיים כדי לסנן ולקצץ ברצף קריאות ולבצע יישור2. השתמש בטבלת הספירה ובמטא-נתונים כקלט לביצוע ניתוח באשכולות עם חבילת Seurat15.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+variants+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li>
<li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li>
<li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).</li>
<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
<li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).</li>
<li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

Microglia אינטראקציה פעילה עם סוגי תאים אחרים ב-CN, והם רגישים מאוד גירויים סביבתיים. על מנת למזער תגובות דלקתיות שינויים ביטוי הגנים שלהם במהלך תהליך הבידוד, פרוטוקול זה היה יעיל מתוך שיטה שפורסמה בעבר9, והוא מתאים כעת לבודד מיקרוגלייה מאזורים מרובים של המוח בודד בצורת העכבר במקביל. הרקמות והריאגנטים נשמרים בטמפרטורה קר וניסויים מבוצעים בזמן (כ 3.5 h מניתוח למיון) עם פחות שוטף ומלא ריאגנטים פחות מבוסס על גדלים רקמות מוגבלות. אנחנו בוחרים douncing על שיטות אחרות הומוקות, כגון העיכול אנזימטי, כי די...

Microglia, המייצג 5% על 10% של כל התאים העצביים, הם מקרופאגים המתמחים מפוזרים ברחבי מערכת העצבים המרכזית (CN)1. מוגן מאחורי מחסום דם-מוח, מיקרוגלייה אופייני במוח מבוגר בריא להכיל תהליכים עדינים רבים במהירות להאריך ולסגת כדי אינטראקציה עם נוירונים ותאי גליה אחרים בתוך הכימומה. Microglia יכול גם לאמץ את מורפולוגיה אמבות הקשורים בפונקציה phagocytic מוגברת במהלך שלבים התפתחותיים ספציפיים או על האתגרים החיסונית פציעה ומחלה1,2,3,4. תגליות מרגש לאחרונה הפגינו בבירור כי מיקרוגלייה הם בשום מקרה פסיבי עוברי אורח פסיבית המוח או אותות פתולוגיים, אבל לשחק תפקידים מרכזי בשליטה המוח התפתחות הומאוסטזיס, למשל, על ידי תמיכה הישרדות עצבי, גיזום הסינפסות בלתי האוליגודנדרוציטים, קידום תאים השושלת היוחסין בידול, כמו גם אנגיוגנזה1. ככל פונקציות יותר של מיקרוגלייה מובהר, ההתרגשות היא נוספת מונעת על ידי מחקרים גנטיקה של האדם, אשר הראו כי הרבה מחלות נוירוניווניות הסיכון גנים, כגון TREM2, הם בעיקר או בלעדית מבוטא על ידי מיקרוגלייה5,6,7. בהתחשב במשמעות שלהם בפיתוח וסביר מחלות נהיגה תפקידים, מאמץ עצום לאחרונה הושם לקראת ההבנה שלנו של רגולציה גנטית microglial ותפקוד בתקווה למצוא מטרות טיפוליות חדשות עבור מחלות ניווניות1,8.
רצפי RNA (RNA-seq) מאפשר אפיון לא משוחד של הביטוי הגן הספציפי לסוג תא, אשר בתורו המדריכים מדענים לחקור פונקציות גן ברשתות הסלולר צפוף7. RNA-seq נעשה בעיקר על דגימות בצובר, המוביל לגילוי של חתימת גנים microglial הומאטית המבדיל אותם מתאים עצביים אחרים החיסונית9. עם זאת, גישה כזו יכולה להתעלם הבדלים מולקולריים ופונקציונליים בקרב microglia, במיוחד אלה הנוכחים בפיתוח, או הקשורים הזדקנות ומחלות. אכן, תא בודד RNA-seq (scRNA-seq) מציע את הרגישות ואת הרזולוציה כי יש מהפכה בשדה על ידי חשיפת בעבר העריכה הטרוגניות של מיקרוגלייה במגוון של ההקשרים2,3,10. בנוסף, בשל נוכחותם של תאים אחרים החיסונית דומים בממשק מחזור המערכת, scRNA-seq מספק מידע לסייע לעיצוב של כלים חדשים כדי להפריד ולנתח פונקציונלית אלה תאים הקשורים עם מעט לפני ידע2,11.
מערך מגוון של פלטפורמות scRNA-seq הומצאו, כל אחד מתאים יישומים מסוימים12. באופן כללי, שיטות המבוססות על droplet, כגון: x גנומיקה, גבוהות יותר בתפוקה עם (עשרות) אלפי תאים ברצף בכל הפעלה, והם פחות סלקטיבית עבור הקלט שעשוי להכיל אוכלוסיות תאים מעורבות הדורשות סיווג נרחב. שיטות מבוססות לוח לספק רגישות גבוהה יותר לקרוא עומק13,14, בדרך כלל מיקוד אוכלוסיות ספציפיות ממיון התא כדי לחשוף הבדלים עדינים או תעתיקים נדירים. בהינתן אחוז קטן של תאים microglial, במיוחד אלה התפתחות-או מחלות הקשורות אוכלוסיות, בין כל סוגי התאים של ה-cn, זה לעתים קרובות רצוי לבודד מיקרוגלייה מאזור מסוים של עניין ולקבל מידע עמוק ובאורך מלא ההמרה על מנת להבין את טרוגניות.
כאן, אנו מספקים פרטים על איך לבודד מיקרוגלייה מאזורים שונים במוח העכבר גזור מאונה אחת, אשר משמשים עבור תא בודד (או בצובר) RNA-seq בעקבות הליך הכנה חצי אוטומטי המבוסס על לוח הספריה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחצי הכדור השני לאימות היסטולוגית. באופן יעיל משיטה שפורסמה בעבר9, פרוטוקול בידוד זה שואפת למקסם את התשואה מכמות קטנה של חומרי ההתחלה, ובינתיים לשמור על פרופילי מיקרוגליאל גנטי ביטויים. אנו משתמשים מיון תא מופעל-פלואורסצנטית (facs) כדי להעשיר מיקרוגלייה (או תאים אחרים הקשורים החיסונית של עניין) לתוך 96-ובכן צלחות ממזער את הכרכים של ריאגנטים להכנת הספריה כדי להגדיל את התפוקה. אנו מדגישים את פלטפורמת scRNA-seq הרגישה הזאת, למרות שניתן ליישם אסטרטגיות אחרות המבוססות על צלחת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לבידוד מיקרוגלייה מרקמות אחרות, כגון פציעה או מחלה, וגיל העכבר יכול להשתנות כמעט בכל שלבי הלידה. בידוד יעיל של מיקרוגלייה אזוריים למחקרים בעלי תא יחיד הטרנססקריפט יסייע להבנה טובה יותר של התפקודים שלהם בריאות ומחלות.

<table><tbody><tr><td>5 מ בטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>חתול # B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ dNTP תערובת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול # R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ EDTA, pH 8.0</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול # 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X הנקס' תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול, עם מכסה מסננת תאים</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, ערכת ניתוח שברי NGS ברגישות גבוהה (1 bp &ndash; 6,000 bp)</td> Advanced <td>Analytical</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>וורת'ינגטון</td><td>Cat# LS002007</td><td>פתרון עבודה: 12500 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>DTT, דרגה מולקולרית</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>חתול# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט A (96 אינדקסים)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט B (96 אינדקסים)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט C (96 אינדקסים)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Illumina XT v2 Set D (96 אינדקסים)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease (5 U/&mu; l)</td> <td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Fc בלוק</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים להסרת מיאלין</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנת דגימת DNA</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 ערכת תפוקה גבוהה v2.5 (150 מחזורים)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי PCRClean DX</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>מכתים: 1:1000</td></tr><tr><td>קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמי Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>חולדה חד שבטית נגד עכבר/אנושי CD11b, סגול מבריק 421 (שיבוט M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>מכתים: 1:300</td></tr><tr><td>חולדה חד שבטית נגד עכבר CD45, PE/Cy7 (שיבוט 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>צביעה: 1:300</td></tr><tr><td>מעכב RNase רקומביננטי</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&mu; l)</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>מכיל 5x מאגר גדיל ראשון</td></tr> <tr><td><חזק>אוליגונוקלאוטידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu; M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" הוא forribobases ו-"+" הוא בסיס LNA)</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td><פתרונות>חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS מתכון</td><td></td><td></td><td>: 1% FBS מסונן סטרילי, 2 מ"מ EDTA, 25 מ"מ HEPES ב-1X PBS</td></tr><tr><td>MCS מאגר</td><td></td><td></td><td>מתכון: מסנן סטרילי 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ב-1X PBS</td></tr><tr><td>בינוני</td><td></td><td></td><td>מתכון: 15 מ"מ HEPES, 0.5% גלוקוז ב-1X HBSS ללא פנול אדום</td></tr><tr><td><חזק>צלחות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>צלחות PCR קשות 96 בארות</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td><חזקות>אחרות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר, 2 מ"ל</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>357422 עמודת דלדול גדולה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>עמודת בחירה גדולה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>מסננת (70 &mu; m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>מנתח שברים</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>יתושים HTS רובוט פיפטינג ננוליטר</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי rna של תא יחיד בודד

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

כמו מקרופאגים תושב במערכת העצבים המרכזית, מיקרוגלייה פעיל שליטה בפיתוח המוח הומאוסטזיס, ואת התפקוד שלהם יכול לנהוג במחלות אנושיות. מקדמות רבות נעשו כדי לחשוף את החתימות המולקולריות של מיקרוגלייה הומטיק, כמו גם שינויים של הביטוי הגנטי שלהם בתגובה לגירויים סביבתיים. עם הופעתו והתבגרות של תא בודד מתודולוגיות גנומית, הוא מוכר יותר ויותר כי מיקרוגלייה הטרוגניים עשוי להיות מתחת לתפקידים מגוונים הם משחקים בתנאים התפתחותיים ופתולוגיים שונים. ניתוח נוסף של טרוגניות כזה יכול להיות מושגת באמצעות בידוד יעיל של מיקרוגלייה מתוך אזור נתון של עניין, ואחריו פרופיל רגיש של תאים בודדים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד מהיר של מיקרוגלייה מאזורי מוח שונים בחצי הכדור המוח העכבר המבוגר. אנו גם להדגים כיצד להשתמש מיקרוגלייה אלה מיון עבור מבוסס צלחת תא יחיד ברצף RNA רצפי. אנו דנים על הסתגלות של שיטה זו לתרחישים אחרים ולספק הנחיות לשיפור המערכת כדי להתאים למחקרים בקנה מידה גדול.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ומיון מיקרוגלייה מאזורי מוח שונים בחצי הכדור המוח האדם המבוגר, ואחריו scRNA-seq. אנו משתמשים douncing כדי ליצור תא השעיה בודד גם כצעד הראשון להעשיר microglia. לא מספיק או over-douncing מפחית את התשואה. בנוסף, מוחות עכבר למבוגרים מכילים רמות גבוהות של מיאלין, אשר יכול גם להפחית את יעילות מיון ותשואה אם לא הוסרו כראוי. לכן, אנו בודקים את ההשעיה התא תחת מיקרוסקופ באמצעות טריקון כחול ו היציטוטומטר כדי להעריך את התשואה, הכדאיות התא יעילות של הסרת המיאלין (שלב 4.9) לפני ביצוע כתמים נוגדן (<strong c...

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

שיטה זו מאפשרת לכידת מיקרוגליה בלתי משוחדת ברמת תא יחיד, אשר יכולה לעזור להבהיר את ההטרוגניות המולקולרית של microglia במוח בריא וחולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הליך מפורט לבידוד מהיר של microglia מאזורי מוח שונים ומראה כיצד ליצור ביעילות בסיס לשחק את ספריות RA6 תא יחיד עבור רצף עמוק. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את כל המאגרים והפתרונות הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט וצננים אותם על הקרח.לאחר המתת דם ועירת ראשו של העכבר, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור על הראש כדי לחשוף את הגולגולת שמתחת. לאחר מכן, חותכים דרך התפר sagittal, תפר lambdoidal, ותפר קורונאלי. השתמש מטליות כדי למשוך את שני הצדדים של עצםקודית ועצם interparietal מבלי לפגוע ברקמה בזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי ניתוח המכיל בינוני A.באמצעות להב מקורר מראש, לחתוך את המוח דרך קו האמצע לשתי ההמיספרות.השתמש במלקחיים מספר 55 כדי להפריד את המוח הקטן מהאונה הקורטית וגזע המוח. לאחר מכן, השתמש במספר 55 מדפים כדי לנתח בזהירות את ההיפוקמפוס ואת הסטריאטום מקליפת המוח ולהעביר כל רקמה לתוך אוסף נפרד צלחת פטרי. ראשית, השתמש בסכין גילוח כדי לקצוץ כל אזור במוח לחתיכות עדין שהם פחות ממילימטר מעוקב אחד.באמצעות פיפיטר אחד מיליליטר עם קצה מנותק, להעביר את חתיכות הרקמה לתוך homogenizers Dounce מקורר מראש. הומוגניזציה של הרקמה על ידי פיתול איטי של הבוכנה פנימה ומבחוץ של homogenizer Dounce במשך שש עד 10 משיכות מלאות עד שלא קיימים גושים גלויים. לאחר מכן, להעביר את הרקמות ניתוב לתוך צינורות 50 מיליליטר דרך מסנני מיקרומטר 70.לשטוף כל homogenizer Dounce ובוכנה עם סך של שישה מיליליטר של מדיום קר A ואז להעביר את שטיפה לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. השעיה חד-תאית צנטריפוגית ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם הפסקה בחמש. שטפו עמודת דלדול אחת גדולה ושלוש עמודות בחירה גדולות במפריד מגנטי עם שלושה מיליליטר של MCS.כאשר הצנטריפוגה עבור דגימות הרקמה הושלמה, פיפטה החוצה להשליך על טבעי מבלי להפריע גלולה. תן שימוש חוזר בתאים במאגר MCS המכיל מעכבי RNase. הוסף 100 microliters של בחנורי הסרת המילין לכל צינור המכיל תאים מושעים מחדש מן קליפת המוח והקטנה ולהוסיף 50 microliters של בחנורי הסרת המילין לכל אחד הצינורות המכילים תאים מושעים מחדש מן ההיפוקמפוס וסטריאטום.דגירה הצינורות על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף MCS לצינור המכיל תאים קליפת המוח כדי להביא את עוצמת הקול שלה עד שני מיליליטר ואת הצינורות הנותרים להביא כל אחד הכרכים שלהם עד מיליליטר אחד. לאחר שהעמודות ריקות ממאגר שטיפה, טען שני מיליליטר של תאי קליפת המוח אל עמודת הדלדול הגדולה ומיליליטר אחד של מתלה התא השני על עמודות בחירה גדולות נפרדות.לאחר מכן, לשטוף את עמודי דלדול גדול אלה עם מיליליטר אחד של מאגר MCS ולשטוף כל עמודת בחירה גדולה פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של מאגר MCS עבור כל לשטוף. סנן את התאים דרך 35 כובעי מסנני מיקרוליטר לצינורות FACS עגולים. צנטריפוגה צינורות אלה ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים.לאחר מכן, לשפוך לאט את העל טבעי לטבול את קצה הצינור על נייר טישו. תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם 300 מיקרוליטרים של מאגר FACS. ראשית, להוסיף חמישה microliters של קולטני FC העכבר לחסום reagent לכל צינור.דגירה על קרח במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של CD45 PE בגודל שבע ומיקרוליטר אחד של CD11B BV421 לכל צינור. דגירה הצינורות על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מאגר FACS לשטוף. צנטריפוגה ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים. תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם 400 מיקרוליטרים של מאגר FACS המכיל מיקרוליטר אחד של מעכבי RNase ו-0.5 מיקרוליטרים של פרופידיום יודיד.בהתאם להליך FACS הסטנדרטי, מיין microglia חי יחיד עם חריר 100 מיקרומטר לתוך לוחות PCR 96 היטב המכילים ארבעה microliters של מאגר תיזה בכל באר. בקצרה מערבולת הצלחות ולסובב אותם למטה באמצעות צנטריפוגה העליון ספסל. לאחסן את הצלחות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הכנת הספרייה.כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את הצלחת על קרח. השתמש במחזור תרמי כדי לבצע שעתוק ראשון כדי ליצור cDNA ולהעצים את cDNA עם שלב עיכול exonuclease נוסף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לטהר את cDNA על ידי הוספת 18 microliters של חרוזים מגנטיים לכל באר.דגירה הצלחת על מעמד מגנטי במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את supernatant ולשטוף את הדגימות פעמיים עם טרי עשה 80%אתנול באמצעות 80 microliters של אתנול לגם עבור כל לשטוף. כדי לבצע תג, השתמש במכונת צינור ננוליטר כדי לערבב 0.4 microliters של כל מדגם cDNA עם 1.2 microliters של Tn5 reagents תג מערכת ההכנה הספרייה בצלחת 384 גם ב 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.כדי לעצור את תגובת התגיות, הוסיפו 0.4 מיקרוליטרים של חיץ נטרול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, ב 384 אינדקסים ו 1.2 microliters של PCR מעורבב לדגימות להגביר את הספריות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בריכת כל הספריות בודדות מאותו לוח 384 באר יחד ולהשתמש חרוזים מגנטיים כדי לטהר את הספריות מאגר הסופי.במחקר זה, microglia מבודדים קליפת המוח, המוח הקטן, ההיפוקמפוס, וסטריאטום של חצי הכדור המוח של עכבר בוגר. ההשעיה התא מוכן נבדק תחת מיקרוסקופ באמצעות כחול trypan ו hemocytometer כדי להעריך את התשואה, הכדאיות התא, ואת היעילות של הסרת המילין לפני ביצוע כתמי נוגדנים. סה"כ ספירת תאים בשלב זה צריכה להיות מעל 30, 000 עבור קליפת המוח ו מעל 5, 000 עבור הרקמות האחרות.מעל 90% מהתאים צריכים להיות בני קיימא עם פסולת מילין קטנה. מחשב FACS משמש למיון המיקרוגליה, שהם בדרך כלל CD45 נמוך ו- CD11B חיובי. בידוד מוצלח אמור לייצר מעל 80%microglia מתוך כל תאים בודדים חיים, לפחות עבור רקמת קליפת המוח.לאחר microglia בודדים נלכדים לתוך מאגר תיזה, RNA הוא שוחרר ולאחר מכן הפוך מתמלל cDNA, אשר לאחר מכן מוגברת במשך 23 מחזורים. כפלטפורמת אלקטרופורזה נימית, מנתח השברים וערכות שברי NGS רגישות במיוחד מספקים מידע מהיר ומדויק על התפלגות הגודל, כמו גם כמות מולקולות cDNA הקיימות בכל באר של צלחת 96 באר. ניתן להשתמש בדגימות המציגות מריחה בין 500 ל- 5,000 זוגות בסיסים והן נמצאות מעל סף ריכוז מסוים כדי ליצור ספריות.הדגימות רצפים לעומק של יותר ממיליון קריאות גולמיות לכל תא, אשר מרווה את כוח הזיהוי של מתודולוגיית ריצוף RNA של תא יחיד. עם קצב מיפוי של כ 60% מעל 2, 000 גנים ניתן לזהות לכל תא microglial. נתונים שפורסמו בעבר שנוצרו משיטת בידוד זו משוחזרים מניסויים עצמאיים, המדגימים את הרגישות לגילוי גנים ספציפיים למיקרוגליה על פני האוכלוסייה הרציפה.עם המידע של תמלול microglia יחיד, החוקרים יכולים לגלות את אוכלוסיות התאים הייחודיות בהקשר של העניין שלהם, וללמוד עוד יותר את הרלוונטיות התפקודית של אוכלוסיות אלה שזוהו לאחרונה.

isolation-region-specific-microglia-from-one-adult-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.

בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבודד ולטהר מיקרוגליה ראשונית בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים, ואחריו הוראות לביצוע הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים על תאים מבודדים אלה באופן חריף.

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

למד שיטה לבידוד מיקרוגליה מאזורים שונים במוח העכבר לרצפי RNA של תא יחיד. הפרוטוקול כולל מיון FACS והכנת ספרייה אוטומטית לחקר הטרוגניות תפקודית של תאי מערכת החיסון במוח.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

גלה סרטונים נוספים