רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

תיקון הוושט ההיקפי הוא מאתגר מבחינה טכנית במודל חולדה, המחייב פיתוח של ושט מהונדס רקמות המאפשר התחדשות של רירית הוושט ושרירים ללא דליפת anastomosis הוושט. יישמנו פיגום צינורי דו שכבתי כמודל פיילוט, המורכב ננופייבר פנימי גדיל חיצוני 3D הדפסה בשילוב עם anastomosis microvascular כדי למזער את דליפת הרוק לאחר ההשתלה. שחזור הוושט הסטנדרטי הקונבנציונלי קשור למגוון רחב של סיבוכים ותחלואה.

לכן, הנדסת רקמות הוושט עשויה להיות אסטרטגיות חלופיות מבטיחות לפיתוח מודלים מקוריים של הוושט החולה. השילוב של פיגומים היברידיים, גידול bioreactor, מערכת תזונה אוראלית ניתן ליישם על כל מערכת שיש לה סביבה מזוהמת דומה עם הלחץ המכאני המתמשך שלה. התחל על ידי עיקור פיגום הוושט בהדפסה תלת-ממד עם חשיפה של שעה לאור אולטרה סגול, טבילה של 10 דקות באתנול ושלוש שטיפות עם PBS.

לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הפיגום הצינורי הדו-שכבתי לתוך צלחת תרבות רקמה לא עקבית של 24 בארות, ומוסיפים בעדינות אך באופן אחיד פי 10 לששת תאי הגזע הקסנצ'ימליים האנושיים שמקורם בשומן למיליליטר מטריצת קרום מרתף בתוספת מדיום צמיחה לפני השטח הפנימיים של הפיגום. השתמש במערכת bioreactor זרימה pulsatile כדי לתקן היטב את הפיגום צינורי זרעי תא למחזיק אקרילי בתא התרבות של bioreactor, ולהוסיף 500 מיליליטר של מדיום צמיחה לתא. לאחר מכן, יש למרוח 1 dyne אחוז בריבוע של מתח גזיר הנגרמת על ידי זרימה תחת אטמוספירה לחה המכילה 5%פחמן דו חמצני.

לאחר חמישה ימים, השתמש בערכת בדיקה של יכולת הקיום LIVE/DEAD כדי לקבוע את תגובות התאים על פני השטח הפנימיים של הפיגום בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים, ודמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לפני תחילת ההליך הכירורגי, לאשר חוסר תגובה רפלקס הדוושה בחולדה הרדמה, ולמקם את החיה בתמונת supine על וילון סטרילי. השתמש קוצץ כדי להסיר את השיער מהאתר הכירורגי, ולחטא את העור החשוף עם BETADINE רציף ו 70% קרצוף אתנול.

עבור מיקום T-tube, לעשות חתך בעור קו האמצע ושרירים בבטן של החולדה, ולהשתמש בלהב אזמל כדי ליצור פתח שלושה מילימטר בקיר הקיבה הקדמי. הכנס את הקצה של צינור T סיליקון לתוך אתר הפגמים כדי לתקן את זה לקיר הבטן, בזהירות לתפור את הצינור לרקמת שריר הקיבה. תפר את דופן הבטן עם תפר VICRYL 4-0.

הכנס בזהירות את הקצה הדיסטלי של צינור T המושתל דרך המנהרה התת עורית לתוך החלק האחורי של הצוואר, ולהשתמש אנגיוקטטר כדי לחבר כובע הפרין לקצה T-tube כדי למנוע את תכולת הקיבה זורם לאחור. כאשר הכובע נמצא במקום, להשתמש 4-0 תפרים polyglactin לסגור את כל השכבות של עור הבטן, ולמקם את החולדה לתוך כלוב מטבולי עם ניטור עד רשלנות מלאה. שבוע לאחר מיקום צינור T, להכין את החולדה לניתוח כפי שהוכח.

מניחים את החולדה מתחת למיקרוסקופ, ולעשות חתך צוואר חציוני לפני העור החשוף. הפרד את שרירי הרצועה כדי לחשוף את מבנה קנה הנשימה. לבודד את הצד השמאלי של הוושט מקנה הנשימה.

בזהירות להפריד את החלק העליון של הוושט בלוטות התריס, ולהשתמש מספריים כירורגיים כדי ליצור פגם היקפי מלא באורך חמישה מילימטר המכיל את כל השכבות של הוושט. לאחר מכן, הכנס תפר 9-0 בין השוליים הנחותים הימניים של שאריות הוושט העליון והפיגום, והמשך לתפור מימין לשמאל בין שאריות הוושט העליון לבין הפיגום כדי ליצור מיקרואנסטומוזיס בקצה העליון של הפגם הוושט הדיסטלי. לאחר מכן, anastomose את הפיגום באותו אופן כמו השוליים העליונים של יתד הוושט התחתון.

כאשר anastomoses הושלמו, להניח את דש בלוטת התריס שמסביב מעל האתר המושתל כדי להבטיח אספקת כלי דם ותחזוקה יציבה של השתל. לאחר מכן, לתפור את השריר התת עורי ואת רקמת העור עם תפר VICRYL 4-0, ולמקום את החולדה לתוך כלוב מטבולי על מכשיר התחממות אינפרא אדום עם ניטור עד התחדשות מלאה. לאחר יישום אפילו לקיר הפנימי של הפיגום באמצעות הזרקה, מטריצת קרום המרתף האנושית משובצת תאי הגזע ממחישה את המורפולוגיה הצפויה של תאי גזע קסנצ'ימליים כפי שהוערכה על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

לאחר השתלת הוושט לחולדות עם מומים וושט היקפיים מלאים כפי שהוכח, השתל מכוסה בדש בלוטת התריס עבור קיבעון יציב ואספקת כלי דם לאתר המושתל. החולדות המושתלות בוושט נשארות על 340 גרם עד כתשעה ימים לאחר ההליך, ובנקודה זו בעלי החיים יורדים במהירות במשקלם בשל סיבות שונות, וכתוצאה מכך מוות ביום 15. למרות שרוב החולדות לפתח חסימה לא ושט הנגרמת על ידי כדורי שיער, בסך הכל אין ראיות ברוטו של ניקוב, דליפת anastomosis עם פיסטולה, הצטברות סרומה, היווצרות מורסה, או נמק רקמות רכות סביב כל חיה ניסיונית.

אפיתליזציה מחדש של אתר ההשתלה יכולה להיות מאושרת על ידי כתמי immunofluorescence עבור קרטין, ואת שכבת קולגן מחדש ואת סיבי אלסטין ניתן לראות בבירור על ידי כתמי trichrome של מאסון. התחדשות של שכבת שריר הוושט הוא גם עדות על ידי neovascularization בשפע כפי שהוערך על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי desmin. ההצלחה של הליך זה מסתמכת על תחזוקה יציבה של T-tube באמצעות קיבעון מאחורי הצוואר כדי לספק תזונה במהלך שחזור הוושט.

כדי להתגבר על התמותה המוקדמת האופיינית להליך זה, ניתן ליישם את טכנולוגיית האורגנואיד או כלי הדם המוקדמים בעקבות השתלת הוושט כדי לסייע בשחזור הוושט התפקודי.