הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק
29 באוקטובר 2019
פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.
בגלל חיידקים הם כל כך קטנים, אנשים לעתים קרובות לשכוח שהם אובייקטים תלת מימדיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר שחזור מדויק של הצורות של תאים שטוחים ומעוקלים. פרוטוקול זה דורש רק שינויים קלים במיקרוסקופ סטנדרטי והם זמינים בקבצי Script של MATLAB.
לפני תחילת הניסוי למקם שתי ערימות של כל אחד משלושה 20 על ידי 20 מילימטר כיסוי מחליק על הקצוות הנגדיים של שקופית מיקרוסקופ זכוכית אחת. פיפטה 200 microliters של פתרון כרית agarose על השקופית מיד ובתקיפות למקם שקופית שנייה על ערימת מחליקי כיסוי כדי לשטח את agarose. לאחר שאיפשר את agarose להתגבש במשך כדקה בטמפרטורת החדר בזהירות להחליק את השקופית העליונה ולהשתמש בקצה גדול של קצה פיפטה 200 מיקרוליטר לחתוך רפידות בודדות בקוטר חמישה מילימטר מן הג'ל.
כאשר כל הרפידות הושגו פיפטה תרבות התא E.coli מספר פעמים כדי לשבש את כל גושי התא כדי להבטיח כי התאים מופצים הומוגנית לפני הוספת מיקרוליטר אחד של תת תרבות על כל כרית. לאחר מתן לדגימות אוויר יבש במשך חמש עד 10 דקות לאשר כי טיפות נספגו לחלוטין לתוך רפידות לפני הנחת להחליק כיסוי על הרפידות. לאחר מכן השתמשו במטלית כותנה כדי להבריש בעדינות איטום מתאים סביב קצה החלקת הכיסוי, תוך שמירה על איטום הרחק מהחלק העליון של החלק העליון של החלק העליון של המכסה.
מיד לאחר איטום החלקת המכסה מניחים את השקופית על שלב מיקרוסקופ ולאחר חמש דקות של שיווי משקל תרמי משתמשים בגלגלי המיקוד של המיקרוסקופ כדי להביא את אמצע התא לפוקוס. בתוכנת המיקרוסקופ המשויכת תחת רכישת ND, סמן את התיבה Z כדי להשיג מחסנית Z ולחץ על לחצן בית כדי להגדיר את מרכז התא כנקודת ההתחלה. הגדר את גודל השלב ל- 0.1 מיקרומטר ואת הטווח לארבעה מיקרומטרים וודא שהתקן Z מוגדר לשלב ה- Piezo.
זה קריטי כי יש טשטוש מספיק על החלק העליון והתחתון של התא, כך התא הוא כמעט בלתי ניתן להבחנה מן הרקע. הגדר את ערוצי הפלואורסצנט מתחת לחלון lambda להגדרות עבור מולקולות פלואורסצנטי להיות בתמונה ולאשר כי סדר הניסוי מוגדר lambda כך מחסנית Z מלאה תושג בכל ערוץ צבע לפני המעבר. לאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי להתחיל ברכישת התמונה.
כאשר כל התמונות נרכשו לפתוח את הקבצים בתוכנה המתאימה לניתוח תמונה. צייר תיבה מסביב לתא בודד ושכפל תא זה פעמיים, פעם אחת עבור כל ערוץ, ודא שהתיבה שכפל היפרסטאק מסומנת ושנה את הערוץ לתא אחד או שניים. לאחר ששתי הערימות זמינות, בחרו 'תמונות', 'ערימות', 'כלים' ו'שרשור' לשילוב התמונות.
עם ערוץ החלבון הראשון ואת ערוץ הצורה השני. לאחר שמירת התמונה החדשה כקובץ TIFF, הפוך תיקיה בתוך תיקיה בשולחן העבודה המכילה את התמונות שנחתכו ואת cell_shape_settings_tri. קובץ txt מ- shae-cellshape-exampleData_tri.
ערוך את cell_shape_settings_tri. קובץ txt כדי לקבל את ההגדרות הנכונות עבור הניסוי של עניין. והפעל את Cell_shape_detector3dConvTriFolder הפונקציה עם המחרוזת למיקום התיקיה ואחריה את מספר התא שבו יש להתחיל ואת מספר התאים שיש להפעיל.
כדי לאשר שהתאים שוחזרו כראוי, הפעל את ScreenFits. כאשר ממשק המשתמש הגרפי נפתח, לחץ על לחצן בחר תיקיה ובחר את התיקיה עם קבצי נתוני השחזור כדי לסנן באופן חזותי את שחזורי התאים הבודדים. עבור כל תא שנראה מעוות או חסר כיסוי מלא, בחר את התיבה לצד השחזור כדי לצרף את FLAG לשם כך שניתן יהיה לא לכלול אותו בכל ניתוח במורד הזרם.
הפעל העשרהSmothingSpline כדי ליצור פרופיל העשרה של הריכוז היחסי של חלבון העניין כפונקציה של העקמומיות הגאוסית על פני השטח. לאחר מכן בחר כל תיקיה עם TRI שנוצר זה עתה. בחרו בקובץ מחצלת העקומה החדש שנוצר.
שיטה זו שימושית במיוחד כאשר עוסקים בתאים מעוקלים או בצורה חריגה כייצוג דו-מימדי אינם יכולים לשקף את העקמומיות של התאים במדויק. בניסוי זה נוצר חלבון היתוך פלואורסצנטי ירוק לחלבון אקטין חיידקי MreB כדי לחקור את לוקליזציה מדויקת של חלבון actin הן בסוג הבר והן בתאי E.coli מוטציה. על ידי ביצוע מדידות אלה בתמונות שנתפסו 3D הצורות של סוג הבר ותאי מוטנט rodZ הצליחו להיות משוחזרים.
לוקליזציה של MreB נקבע אז להיות מועשר עקמומיות גאוסית קטנה, תכונה גיאומטרית שניתן למדוד רק 3D באופן תלוי rodZ. זכור לוודא מחסנית Z הוא גדול מספיק כי התאים מטושטשים בחלק העליון והתחתון, כי התאים הם במים היטב אחד מהשני. אנו מראים כיצד למדוד את לוקליזציה גיאומטרית של חלבונים ב 3D אבל מידע אחר ניתן לחשב מנתונים אלה כגון גודל של מכלי חלבון תג.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולהרכיב דגימות חיידקים לצורך הדמיה תלת-ממדית חיה, וכיצד לשחזר את הצורה התלת-ממדית של E. coli מתוך תמונות אלו. השיטה מאפשרת ויזואליזציה מדויקת של תאי חיידקים שטוחים ומעוקלים כאחד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- חיידקים הם עצמים תלת-ממדיים, אך לעיתים קרובות נחקרים בשני ממדים.
- שחזור מדויק של הצורה חיוני להבנת המורפולוגיה של החיידקים.
- פרוטוקול זה עושה שימוש בציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי עם התאמות.
- ניתן להשתמש בחלבונים פלואורסצנטיים כדי להדמיאן רכיבים תאיים ספציפיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לשחזור תלת-ממדי של צורות *E. coli*.
- חקר הלוקליזציה של חלבונים בתוך תאי חיידקים.
- שיפור ההבנה של מורפולוגיית תאי חיידקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת רפידות אגרוז עבור קיבוע דגימות חיידקים.
- שימוש במיקרוסקופ לרכישת סדרות תמונות (Z stacks).
- ניתוח תמונות לשחזור צורות תאים מהתמונות שנרכשו.
- יישום סקריפטים של MATLAB לעיבוד וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- שחזור מוצלח של הצורות התלת-ממדיות של תאי E. coli מסוג בר ומוטנטיים.
- נמצא כי לוקליזציית חלבון MreB מועשרת באזורים בעלי עקמומיות גאוסיאנית נמוכה.
- השיטה לוכדת ביעילות את המורכבות של צורות חיידקים מעוקלות.
- הוכח כי לדימות תלת-ממדי חשיבות רבה בחקר מורפולוגיה של חיידקים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לדימות תלת-ממדי של חיידקים.
- הוא מאפשר ניתוח מפורט של לוקליזציית חלבונים ביחס לצורת התא.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים העוסקים במורפולוגיה של חיידקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שחזור תלת-ממדי מדויק של צורת התא הבקטריאלי ומיקום חלבונים נותן מענה לפער קריטי במחקר המיקרוביולוגי, שבו הדמיה דו-ממדית מסתירה קשרים מורפולוגיים ופונקציונליים מרחביים. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתיקוף מטרות (target validation) על ידי קישור התנהגות חלבונים למאפיינים גיאומטריים של התא, כגון עקמומיות גאוסיאנית (Gaussian curvature), אשר לא ניתן להבחין בה בדו-ממד. השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת נתונים כמותיים עם רזולוציה מרחבית על התפלגות חלבונים בהקשרים תאיים דמויי-טבעיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מתאם בין לוקליזציה של חלבונים לפרמטרים של צורת תא בתלת-ממד, כגון עקמומיות גאוסיאנית (Gaussian curvature).
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של חלבוני מטרה במורפולוגיות תאיות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.
- ערך ניבוי: משפר את רמת הביטחון במטרה על ידי חשיפת רגולציה מרחבית של חלבונים בסביבות תאיות תלת-ממדיות טבעיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פרופילים כמותיים וסטנדרטיים של צורה תלת-ממדית והעשרה של חלבונים, המתאימים ליישומי סריקה בעתקת תוכן גבוהה (high-content screening).
- שחזוריות: משתמש ברכישת Z-stack סטנדרטית ובעיבוד מבוסס MATLAB כדי להבטיח שחזור צורה עקבי בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה: תואם למיקרוסקופים פלואורסצנטיים נפוצים וניתן להתאמה למספר מיני חיידקים ומוטנטים, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין השלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית על ידי אספקת נתוני לוקליזציה של חלבונים ברזולוציה מרחבית, המנחים מחקרים פונקציונליים במודלים רלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר האם פנוטיפים חלבוניים שנצפו תלויים במבנה, ובכך מפחית את כמות התוצאות החיוביות השגויות בתיקוף המטרה.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מאפשר זיהוי של דפוסי חלבונים הקשורים לעקמומיות, שעשויים לשמש כסממנים ביולוגיים תרגומיים במצבים בקטריאליים נבדלים מבחינה מורפולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תומכת בבדיקת השערות בתיקוף מטרות ומאפשרת התקדמות מבוססת נתונים לזיהוי מובילים ולהערכה פרה-קלינית באמצעות מיקום חלבונים המבוסס על מידע מכניסטי.
- ביולוגיה של תגליות: מקל על בדיקת השערות על ידי קישור לוקליזציה של חלבונים למאפיינים מורפולוגיים תלת-ממדיים, ובכך מבהיר קשרים פונקציונליים במסלולים תאיים.
- סריקה: מייצר פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה, כולל מפות עקמומיות גאוסיאנית ופרופילים של העשרת חלבונים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- אנליטיקה: מספק עקומות העשרת חלבונים מבוססות צורה המאפשרות לצומי מחקר לכמת תלויות מרחביות ולהשוות בין תנאי טיפול או תנאים גנטיים.
- מחקר טרנסלציונלי: תומך ברציפות פרה-קלינית על ידי אספקת נתונים ברזולוציה מרחבית שיכולים לתקף מעורבות של מטרה (target engagement) במודלים בקטריאליים רלוונטיים מבחינה מורפולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימוי וניתוח ניתנת לשימוש חוזר, הישmime ל 적용 על פני מספר פרויקטים החוקרים מורפולוגיה בקטריאלית ותפקוד חלבונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתן אפשרות לאיתור מדויק של חלבונים בתלת-ממד, ובכך משפר את דיוק התיקוף של המטרה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הכנת דגימות סטנדרטית, רכישת Z-stack ושחזור אוטומטי מבוסס MATLAB.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי חשיפת השאלה האם מיקום החלבון תלוי בצורה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על נתונים פונקציונליים המתוקפים מרחבית בהקשרים תאיים טבעיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה, ניתוח תמונות ועיבוד חישובי מבוסס MATLAB.
- נדרשת גישה למיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יכולת במה פיאזו (piezo stage) ומשאבים חישוביים מספיקים לשחזור תלת-ממדי.
- דורש סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות, פרמטרי Z-stack ותהליכי עבודה של עיבוד תמונות בין הצוותים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מיני חיידקים, צורות או תוויות פלואורסצנטיות שונות.
- מוגבל בשל העומס החישובי של השחזור התלת-ממדי, אם כי מומלץ להשתמש במשאבים בעלי תפוקה גבוהה (high-throughput), אך אין זה תנאי הכרחי.
