Name: הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: למדו ליצור תרביות פרוסה אורגנוטיפיות של מוח עכברים לחקר מוות תאי Purkinje בזמן התפתחות עצבית. השיטה מאפשרת בדיקת תרופות נוירופרוטקטיביות ושימור ארכיטקטורת הרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודת הדמיה בוצעה במרכז אוניברסיטת נורת'ווסטרן עבור מיקרוסקופ מתקדם נתמך על ידי NCI CCSG P30 CA060553 הוענק למרכז רוברט ה לוריא מקיף סרטן. אנו מודים לשון מקדרמוט על הסיוע והתמיכה הטכניים שלו, ומאיה אפשטיין לאיורים המוצגים ביד המוצגת באיור 1.

כל הניסויים הכרוכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן.
1. הכנה לפני תרבויות הפרוסה האורגליתית
<ol><li>ב תרבות תא כיסוי מרוסס עם 70% אתנול מראש, להכין 200 mL של מדיום התרבות ב 250 mL בקבוק ואקום העליון מחובר מקלט בקבוק סטרילי. הוסף 100 mL של בסיס בינונית נשר (BME), 50 mL של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), 50 mL של סרום הסוס חום המופעל, 1 מ ל של 200 mM L-גלוטמין (ריכוז סופי 1 מ"מ), ו-5 מ ל של 200 g/L גלוקוז (הריכוז הסופי 5 מ"ג/mL). ואקום-לסנן את מדיום התרבות ולשמור אותו ב-+ 4 ° צ' עבור עד חודש.</li>
	<li>בארון הביובטיחות מעוקר, להוציא צלחת התרבות 6-היטב מהחבילה שלה. מלא כל טוב עם 1 מ ל של התרבות הבינונית. אם הטיפול נבדק, להוסיף את הסוכן התרופתי לבאר מטופלים, ואת אותו נפח של פתרון הרכב עבור השליטה היטב. במחקר הנוכחי, הוספנו 1 μL של סטרילית 3 M KCl פתרון היטב שטופלו (30 מ"מ סופי) ו 1 μL של מים סטרילי לבארות בקרת.</li>
	<li>להביא בתוך התרבות תאים מכסה את המספר הדרוש של התרבות העטופה בנפרד הגוף מוסיף הידרופיפילית polyטטרפלואורואתילן (מצופה) קרום (גודל נקבובית = 0.4 μm). בזהירות לפתוח אותם להוציא את התרבות התא מוסיף עם מלקחיים סטרילי. הפל אותם אחד אחד בבאר של 6-היטב צלחת, הימנעות בועות בממשק בין קרום להכניס את המדיום תרבות התא. תן את התוספות להדיה במדיום 37 ° c, 5% CO2 חממה לפחות 2 h לפני התרבות. הערה: קוצץ הרקמות שוכן לצמיתות במכסה התרבותי של התאים.</li>
	<li>להכין 2 200 mL כוסות, אחד מלא 150 mL מים סטרילי, והשני מלא 150 mL 70% אתנול. טובלים את כלי הניתוח באמבטיית אתנול 70% ולאחר מכן במים לפני השימוש בהם. הערה: אין להשתמש בכלים כירורגיים מיד לאחר המגע עם אתנול.</li>
	<li>חטא את הלהב הכפול בגביע. האתנול של 70% מניחים אותו על מחזיק הלהב באמצעות מלקחיים סטרילי ולהחזיק אותו למקום באמצעות מפתח הברגים התפס. . תנו לו להתייבש עד השימוש</li>
	<li>לחטא את הדיסק פלסטיק שסופקו עם מסוק הרקמה בגביע האתנול 70%. רסס את שולחן החיתוך עם 70% אתנול לפני הצבת הדיסק על זה. . תנו להתייבש עד שתשתמשו</li>
</ol>2. לחיתוך וללבלר מתרבויות הפרוסה
<ol><li>הביאו את גור העכבר בתוך המכסה של תרבות התא כדי לבצע את הקרע.</li>
	<li>לערוף את ראשו של הגור במהירות באמצעות מספרייםהפעלהישר (איור 1א).</li>
	<li>בעוד מחזיק את ראשו של הכלבלב על ידי האף עם מלקחיים ההלבשה ישר, לחתוך לפתוח את הקרקפת באמצעות מספריים עין ישר, החל מהקצה האחורי, והולך לרוחב קו האמצע.</li>
	<li>. המשך באופן זהה לגולגולת הערה: הקפד להפנות את קצות המספריים כלפי חוץ כדי להימנע מפגיעה בעורק המוח במהלך הניתוח.</li>
	<li>להוציא את המוח ולהעביר אותו לצלחת 60-mm מלא HBSS קר + 5 מ"ג/mL גלוקוז.</li>
	<li>בזהירות לנתח את המוח באמצעות מלקחיים בסדר ישר סטרילי (איור 1B). להעביר אותו על דיסק פלסטיק ממוקם על השולחן חיתוך של המסוק רקמות באמצעות מלקחיים סטרילי מעוקל בסדר.</li>
	<li>מכוון את הרקמה על ידי סיבוב שולחן החיתוך כדי לבצע מקטעים פאראבריים.</li>
	<li>הזז את שולחן החיתוך על-ידי משיכת כפתור השחרור של הטבלה ימינה, כך שהלהב ממוקם בקצה הרקמה.</li>
	<li>התאימו את עובי הפרוסה ל-350 יקרומטר ולמהירות הלהב לבינונית.</li>
	<li>. תתניע את המסוק ברגע שכל המוח חתוך (איור 1ג), כבה את המסוק.</li>
	<li>להסיר את הדיסק הפלסטי עם מלקחיים סטרילי.</li>
	<li>בזהירות להביא את הדיסק פלסטיק קרוב למנה 60-mm המכיל HBSS + 5 מ"ג/mL גלוקוז. פיפטה קר HBSS + 5 mg/mL גלוקוז על הרקמה באמצעות פיפטה העברה סטרילית כדי לאפשר קציר של פרוסות המוח בתבשיל מלא מאגר.</li>
	<li>הפרידו בין הפרוסות המוח. בעזרת מיקרו-לווין להוציא מקטעים באיכות טובה עם פיפטה העברה (מומלץ להשתמש בסעיפים הרקמה הקרובים vermis) ולשחרר אותם בתוך הוסף תרבות התאים לפני השפה (איור 1ד).</li>
	<li>מקמו את פרוסות המוח על הוסף תרבות התא באמצעות microprobe, ולאחר מכן להסיר בזהירות את העודף HBSS + 5 mg/mL הפתרון גלוקוז עם העברת הצנרת. הערה: בשלב זה הרקמה מאוד רכה ונוטה לנזק פיזי. המספר המירבי של פרוסות מרביות לכל תרבות התא תלוי בגיל בעל החיים התורם. 6 – 8 פרוסות יכול להיות מתורבת עבור חיה P0-P4-old, ו 4-6 פרוסות עבור בעלי חיים מבוגרים יותר P5.</li>
	<li>מניחים את קערת התרבות בחממה, משנה את המדיום לחלוטין כל 2-3 ימים.</li>
	<li>כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje, פרוסות ניתן לאסוף מוקדם ככל 5 ימים ב מבחנה. למטרות אחרות, ניתן לשמור אותם בתרבות במשך מספר שבועות (איור 1F). הערה: במקרה של Purkinje הישרדות התאים ניסויים, אין צורך לחדש את הטיפול תרופתי בעת שינוי תרבות התא בינונית (איור 1F).</li>
</ol>3. אימונולואורנציה
<ol><li>. תוציא את הצלחת ה -6 מהאינקובטור הסרת מדיום תרבות התא, לשטוף את הוספת תרבות התא עם 1x PBS, ולתקן את הפרוסות עם קר 4% פאראפורמלדהיד פתרון עבור 1 h, עם 1 mL תחת הוספת תרבות התא ו 500 μL על גבי הוספת תרבות התא.</li>
	<li>לשטוף את מוסיף 4x 10 דקות עם 1x PBS, עם 1 mL תחת ו-500 μL על גבי הוספת, על שייקר מסלולית.</li>
	<li>עם מברשת, להעביר את הפרוסות המוח מתוך 1 תרבות תא להוסיף 1 היטב של 24-היטב pre-מלא עם 1x PBS, 0.25% טריטון X-100, ו 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/ובכן.</li>
	<li>חדירות ולחסום את הפרוסות על ידי דגירה ב-PBS-TB עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים העיקרי מדולל בפתרון PBS-TB, לילה ב + 4 ° c, על שייקר מסלולית, 200 μL/ובכן.</li>
	<li>ביום הבא, לבצע ארבע שוטף של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולית, 500 μL/ועוד.</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משני מדולל בפתרון PBS-TB, שעתיים בטמפרטורת החדר, על שייקר מסלולית, ומוגן מפני אור, 200 μL/ובכן.</li>
	<li>לבצע ארבע שוטף של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולית, 500 μL/ובכן.</li>
	<li>מנוגד את הפרוסות באמצעות Hoechst 33342, מדולל ב-1x PBS (2 μg/mL), עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור, 500 μL/ועוד.</li>
	<li>לטעון את פרוסות המוח בשקופית מיקרוסקופית עם פיפטה העברה. , תנו להם להתייבש לגמרי. מוגנים מפני אור מחולל לחות מחדש עם PBS 1x ולהחיל שמיכות מכוסה עם כמה טיפות של בינונית הרכבה (~ 80 μL). להימנע מלעשות בועות כלשהן.</li>
	<li>ברגע שהמדיום הגובר נרפא, מקטעים מקרבלאר מוכנים לדימות.</li>
</ol>4. הדמיה וקוונפיקציה של הישרדות התאים
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ ולייזרים על פי היצרן ו/או הוראות מתקן הדמיה ליבה.</li>
	<li>הפעל את תוכנת הרכישה.</li>
	<li>באמצעות מטרה 10x, לאתר פרוסות המוח לא שונה כי ההווה 9-10 אוניות (בדרך כלל מקטעים המוח קרוב vermis).</li>
	<li>הפעל את רכישת מחסנית z. הגדר את הטווח של מחסנית z כדי לכלול את כל תאי Purkinje הנמצאים בפרוסת המוח. להגדיר גודל 2 יקרומטר צעד ולהתחיל את הרכישה. שמור את התמונה שנרכשה בתבנית של יצרן תוכנת הרכישה כדי לשמר את המטא-נתונים המשויכים.</li>
	<li>פתח את הקובץ הנרכש ב-ImageJ באמצעות התוסף הביו-תבניות18.</li>
	<li>עבור לתמונה > ערימות > Z-פרוייקט. ..</li>
	<li>בחרו ' עוצמה מקסימלית ' בתפריט הנפתח ' סוג הקרנה ' ולחצו על ' אשר ' ('איור 2ב').</li>
	<li>תמונה דו-ממדית משוטח תיווצר. לחיצה כפולה על הכלי מרובת הנקודות כדי לאפשר לחלון הצבע של הכלי להופיע. בטל את הסימון באפשרות נקודות התווית כדי להקל על הדמיית תאים שנספרו. לאחר מכן, לחץ ישירות על סומה של תא Purkinje כדי להתחיל לספור (איור 1E). המספר הכולל של התאים שנספרו יציין בתחתית חלון הכלי (איור 3). הערה: בדרך כלל, לפחות 3 סעיפים שאינם פגומים המכילים 9-10 אוניות לכל תרבות התא ניתן לכמת. כדי להעריך את ההשפעה הנוירומגנה של סוכן תרופתי, לפחות 3 ניסויים עצמאיים יש לבצע.</li>
</ol>

<ol><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886(2017).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone+%28RU486%29+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li>
<li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures%3A+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li>
<li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li>
<li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%3A+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li>
<li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li>
<li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985(2012).</li>
<li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin%3A+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li>
<li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li>
<li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells%27+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

התרבות פרוסה בלבלר הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מתוכנת Purkinje מתוכנתים המוות במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי במהירות מולקולות מועמד במסך עבור הפוטנציאל הנוירולוגי שלהם. היתרון העיקרי הוא כי ההתקנה היא פשוטה וחסכונית מאוד, והוא רק דורש השקעה צנועה ציוד (משחק הרטט יכול לעלות עד פי 3 יותר מאשר מסוק רקמות). יתר על כן, 10 כדי 15 פרוסות בריאות ניתן ליצור מגור אחד העכבר, המאפשר בחני שונים להתבצע במקביל באמצעות חיה אחת בלבד.
כדי לקבל תוצאות עקביות ולהתרבות, זה קריטי לבצע את התרבות ...

בדוגמנות חוץ גופית הוא כלי חיוני במחקר ביו רפואי. הוא מאפשר לחוקרים ללמוד ולשלוט היטב במנגנונים ספציפיים בסוגי תאים מוגבלים, או במערכות מבודדות/איברים. תרבות הפרוסה האורגנותית היא בשימוש נרחב בטכניקת מבחנה, במיוחד בתחום המוח המדעי1. השיטה הוקמה לראשונה על ידי Gähwiler, אשר מתרבות פרוסות המוח באמצעות טכניקת שפופרת רולר2, ומאוחר יותר שונה על ידי יאממוטו ואח ', מי הציג את השימוש של קרום מיקרונקבובי לבצע תרבויות פרוסה קורטיקלית3. בהשוואה לתרבויות התאים הראשוניים, תרבויות הפרוסה האורגאותיות מציגות את היתרון של שמירה על הארכיטקטורה הציטותאית של הרקמה, כמו גם התקשרויות מקוריות של תאי התא במישור של מקטע הרקמה.
פרוסות אורגאואיות מתורמות מחלקים רבים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס4,קליפת 5, סטריאטום6, המוח השני4,7, וחוט השדרה8,9, בין היתר. הם הוכחו להיות כלי רב עוצמה במחקר גילוי סמים10. ההשפעות של מולקולות נוירואקטיביות ניתן להעריך בדרכים רבות: הישרדות וניוון שימוש באמצעות חיסוני וביוכימיה assays, היווצרות מעגלים עצביים, או שיבוש באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה חיה.
מטרת העבודה הזאת היא לתאר שיטה פשוטה לביצוע תרבות פרוסה בצורת אורגנויוגית, שידועה כמודל רלוונטי לחיקוי התפתחות מעשית בתחום החוץ. במיוחד, התמקדנו במחקר של תא מוות התפתחותי של Purkinje. ב vivo, התאים Purkinje עוברים ואפופטוזיס במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, לשיא ביום לאחר הלידה 3 (P3)11. דפוס זהה הוא נצפתה בתרבות פרוסה של המוח, עם נוירונים purkinje מתים על ידי אפופטוזיס כאשר המוח נלקח מבעלי חיים בין P1 ו P8, עם שיא ב P34,12. השימוש בתרביות פרוסה בלבלר מאפשר לזהות מספר מולקולות נוירוגינים7,13, כמו גם הבנת חלק מהמנגנונים המעורבים במוות התאים המתוכנת הזה14,15,16. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על המחקר של סטופיני ואח '17 ב היפוקמפוס, והותאם המוח המהיר על ידי דוארט ואח '4 זה כולל חיתוך מהיר וחיתוך של המוח פוסט לידה; לחתוך את התרבות על הוספת תרבות התא המכיל קרום מיקרונקבובי, עם או בלי טיפול נוירומגן; וכתמים מאימונועצביים כדי להעריך את ההישרדות העצבית.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר IgG נוגדן משני</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>A21203</td><td></td></tr><tr><td>נשר בינוני בסיסי (BME)</td> <td>ThermoFisher 21010046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי ארון בטיחות ביולוגית Class II, סוג A2</td><td>NuAire</td><td>NU-540-400</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>מברשת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד קלבינדין D-28K (CB-955)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td>NuAire</td><td>NU-5700</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר שטוח תחתון 6 בארות צלחות תרבית תאים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים, 22 x 50 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חבישה,</td><td>ישר הרווארד מנגנון</td><td>72-8949</td><td></td></tr><tr><td>להבי קצה כפול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50949411</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 200 הוכחה</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לעיניים,</td><td>ישר הרווארד מנגנון</td><td>72-8428</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16-100-127</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 100X</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>25030149</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוקוז</td><td>ThermoFisher מדעית</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>הנקס תמיסת מלח מאוזנת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים, מושבת בחום, מקורו בניו זילנד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9914528</td><td></td></tr><tr><td>Microprobes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-850</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene יחידות סינון חד פעמיות סטריליות סטריליות עם קרום PES, 250 מ"ל</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements תוכנת</td> <td>הדמיהניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros Organics</td><td>41678-0010</td><td></td></tr><tr><td>פיפטס פסטר פישר</td><td>סיינטיפי</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>ProLong זהב Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה, ישר</td><td>הרווארד מנגנון</td><td>72-8403</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי רקדנית בטן</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRLS0003</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות, 60 מ"מ עם טבעת אחיזה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות, 24 באר</td><td>פלקון/קורנינג</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>פיפטות טרנספר, סטרילי</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>13-711-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

תרבות הפרוסה האורגנותית היא מודל רב-עוצמה החיקוי לvivo בתנאים הקרובים יותר מאשר בתרבויות תאים ראשיות שאינן מקבילות. בפיתוח מוקדם לאחר הלידה, המוח הפורקיאר Purkinje ידועים לעבור תקופה פגיעה, שבמהלכה הם עוברים מוות תאים מתוכנת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבצע העכבר באמצעות התרבות פרוסה בזמן קריטי זה. הפרוסות מסומנות עוד כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje ואת היעילות של טיפולים נוירומגן. שיטה זו יכולה להיות רבת ערך למסך עבור מולקולות נוירואקטיביות חדשות.

כפי שניתן לראות באיור 4, פרוטוקול זה מפיק בתרבויות הפרוסה האורגאולית שבהן ניתן להעריך את הישרדות התאים של Purkinje בעקבות הטיפול הimmunofluorescence ושלבי רכישת התמונה. תאים purkinje סומנו עם שילוב של אנטי Calbindin D-28K (דילול 1/200) ו Alexa594 נגד העכבר (דילול 1/300) נוגדנים. תפרים תמונה נעשה באופן אוטומטי על ידי תוכנת רכישת מיקרוסקופ (שקלים-אלמנטים) כדי לקבל תמונה של הפרוסה כולה המוח. מספרי תאים של purkinje לכל פרוסה הוזנו בתוכנת פריזמה 8 כדי ליצור את התרשים ולבצע ניתוח סטטיסטי. ב P6, הי...

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

תרבות פרוסות אורגנוטיפיק היא כלי רב עוצמה לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ותהליכים ניווניים או רגנרטיביים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לסנן במהירות מולקולות מועמד עבור הפוטנציאל הנוירו-קרן שלהם. שיטה זו מחקה באופן הדוק בתנאי vivo, בהשוואה לתרבויות תאים ראשיים ניתקו, כתוצאה מארכיטקטורת ערכת הרקמות וחיבורי תאי תא מקוריים נשמרים בתוך מישורי המקטעים.כאן אנו מדגימים את המחקר של מוות תאי Purkinje המוח הקטן המתפתח. אבל תרבות פרוסה אורגנותית מתאימה באותה מידה למודל מחלות ניווניות כמעט בכל אזור במערכת העצבים המרכזית. הדגמת ההליך עם ג'ניפר Rakotomamonjy יהיה שון מקדרמוט, טכנאי מהמעבדה שלי.לפני קצירת פרוסות המוח הקטן, בארון ביו-בטיחותי מעוקר, ממלאים כל באר של צלחת תרבות בת שש בארות במיליליטר אחד של מדיום תרבות מסונן ואקום, ומוסיפים את הסוכן הפרמקולוגי המעניין את בארות הטיפול, ונפח שווה של רכב לבארות הבקרה. באמצעות ממטרים סטריליים, מניחים מסנן ממברנה PTFE אחד בגודל 0.4 מיקרומטר מוכנסים לתוך כל באר, דואגים להימנע מבועות בממשק של כל קרום והבינוני, וציידים את המדיום בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. כדי לקצור את המוח הקטן, להשתמש מטליות ההלבשה ישר לתפוס את הראש גור על ידי האף, ולהשתמש מספריים העין ישר לחתוך לפתוח את הקרקפת מהקצה האחורי בצד השני עד קו האמצע.חותכים את הגולגולת באו

purkinje-cell-survival-in-organotypic-cerebellar-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

סרטון זה מדגים טכניקה להשגת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח הקטן ממוחו של גור עכבר וטיפוח הפרוסות במדיה בתוספת חומרים מזינים וגורמי גדילה כדי לחקות את התפתחות המוח הקטן במבחנה. בנוסף, פרוסות צרבלריות ספציפיות מטופלות בתרכובת בדיקה, ויכולת ההגנה העצבית של התרכובת מנותחת באמצעות טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית.

ניתוח הישרדות תאי Purkinje בתרביות פרוסות צרבלריות אורגנוטיפיות

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ניתנת לשחזור ליצירה ותחזוקה של פרוסות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של חוט השדרה שהושתלו בתאי גזע עצביים כמודל ex vivo לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים.

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

תאי Purkinje במוח הקטן (PC) רגישים במיוחד לליקויים בתגובת הנזק לדנ"א. פרוטוקול מוצג להערכה חזותית של הדינמיקה של תגובת PC לנזק לדנ"א, הכוללת צביעת שרשראות פולי קשורות לחלבון (ADP-ריבוז) בתוך תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן.

הדמיה של תגובת נזק לדנ"א בתאי Purkinje באמצעות תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן

למדו ליצור תרביות פרוסה אורגנוטיפיות של מוח עכברים לחקר מוות תאי Purkinje בזמן התפתחות עצבית. השיטה מאפשרת בדיקת תרופות נוירופרוטקטיביות ושימור ארכיטקטורת הרקמה.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

גלה סרטונים נוספים