בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

בידוד תאי גזע נותר אתגר גדול עקב בידוד שותף של תאים סניטריים בשיטות הנוכחיות. פיתחנו סמן ביולוגי חדשני כדי לבודד תאי גזע הרה-חיים של תווי עורב מעורבים. היתרון העיקרי של זה מבוסס כדורית, שמירה על תווית assay, זה יכול להרחיב ולבודד תאי גזע חיים מן אביהם בתם על ידי FACS באמצעות CFSE או תיוג אדום רחוק.

בעוד טיפולים קונבנציונליים לחסל את רוב התאים סרטן הערמונית, תאי גזע סרטניים להישאר בשל התנגדות טיפולית, ובכך מניעים את התקדמות המחלה. בידוד תאים דמוי גזע יאפשר זיהוי של גנים חדשניים שיכולים להיות ממוקדים טיפולית להפוגת מחלות יעילה. ההחזקה שלנו ישימה לבידוד תאי גזע תקינים מרקמות ותאים שונים, ולחקר תאי גזע סרטניים.

חשוב לציין, זה assay של ישים סרטן תאי אפיתל אחרים, כגון סרטן השד וסרטן המעי הגס. התחל על ידי ציפוי 100 מילימטר מנות תרבות עם שני מיליליטר של 2.5 פתרון פיברונקטין מיקרוגרם דגירה אותם לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שאף את הפתרון ותן לצלחות התרבות להתייבש בארון הביו-בטיחות במשך 45 דקות.

מוסיפים תשעה מיליליטר של תא אפיתל הערמונית צמיחה בינונית לצלחת מצופה פיברונקטין ולשמור אותו חם באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. להפשיר בקבוקון אחד של תאי אפיתל ערמונית אנושיים קפואים באמבט מים צלזיוס 37 מעלות, ו resuspend התאים ב 10 מיליליטר של מדיום חם. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 500 פעמים g במשך חמש דקות.

ואז שאף והשליך את העל-טבעי. תן את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם ולהעביר מיליליטר אחד של ההשעיה ישירות לצלחת מצופה fibronectin עם המדיום מחומם מראש. ואז להחגירה את המנה באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.

אם אתם מתייגים במשותף את התאים, הכינו תאים המסווים ב- BrdU בתרבות דו-מימדית של 10 ימים כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן להוסיף חמישה CFSE מיקרומולרי או אדום רחוק דגירה התאים במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, בזהירות לשאוב את המדיום עם הצבע ולשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS חם.

לאחר מכן, לבצע עיכול אנזימטי עם 05% טריפסין EDTA על פי הוראות כתב היד. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. התאים היו מתווסתים במטריצת קרום מרתף קרה כקרח, מטריצת קרום מרתף אחד לאחד ותערובת בינונית תרבותית להיווצרות פרוסטספירה תלת-מימדית.

כדי להכין את תרבות הפרוסטספרה במערכת מטריצת מרתף תלת מימדית, הפשיר את מטריצת קרום המרתף בארבע מעלות צלזיוס בן לילה ולשמור אותה על קרח לפני השימוש. לאחר מכן הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח לנפח שווה של מדיום תרבות קר כקרח. פיפטה למעלה ולמטה לערבב, דואג לא להציג בועות אוויר.

יש להזרים חמש פעמים 10 עד 1/4 תאי אפיתל של הערמונית האנושית במטריצת קרום מרתף קרה כקרח של אחד לאחד ותערובת מדיה תרבותית לנפח כולל של 500 מיקרוליטרים. פיפטה הפתרון לקצה התחתון של כל באר לערבב את הצלחת כדי להפיץ את התערובת באופן שווה. מניחים את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני 37 מעלות במשך 30 דקות כדי לאפשר למטריצה להתגבש.

ואז לכסות אותו עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות חמה לגם, הקפד לא להפריע לטבעת. כדי לקצור את prostaspheres שכותרתו CFSE להחליף את המדיום עם שני מיליליטר dispapase ו pipette למעלה ולמטה לערבב מספר פעמים. להחגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לעכל את המטריצה, ולאחר מכן לאסוף את תערובת הכדור לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

צנטריפוגה הכדורים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. תבזבזו מחדש את גלולת הכדור ב-500 מיקרוליטרים של EDTA חם של 05% טריפסין, והעברו אותם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הדגירה את הכדורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף 500 microliters של PBS חם עם 10% FBS.

מעבירים אותם דרך מזרק של מיליליטר אחד עם מחט של 26 מד כדי לנטרל לחלוטין את הספירות. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. ואז שאף והשליך את העל-טבעי.

תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם עם מיקרוגרם אחד לכל יודיד פרופידיום מיליליטר כדי להכתים את התאים המתים לדגר אותם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. חזור על הצנטריפוגה, והשליך את העל-טבעי. ואז לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום חם.

חזור על הצנטריפוגה, והשליך את העל-טבעי. תן שוב את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם ולאסוף את התאים בצינורות תחתונים עגולים פוליסטירן חמישה מיליליטר על ידי סינון אותם דרך 35 מיקרון גודל צינורות התא מסננת הצמד. בצע ניתוח FACS של תאי פרוסטספירה עם תווית CFSE המפוזרים על-ידי טריפסין.

באמצעות תאים שאינם מסומנים בתווית שלילית ותאים המסומנו בתווית CFSE כפקד חיובי כדי להגדיר את השערים, הפעל את המדגם כדי למיין ולאסוף את תת-התיאום של תאים מופרדים בגובה CFSE ו- CFSE-low. תאי אפיתל הערמונית האנושיים הנורמליים העיקריים הוכנסו לתוך מנות תרבות מצופות פיברונאטין וצמיחת תאים נשמרה בתרבות 2D. עם ההעברה לתרבות תלת מימדית עם מטריצת קרום מרתף, תאי אפיתל מובחנים מתו לאט לאט ורק תאי גזע הערמונית נשארו.

תיוג כפול של תאי אפיתל הערמונית בתרבות דו-מימדית ואחריו היווצרות כדורית בתרבות תלת-מימדית הראו קולוקליזציה של BrdU, CFSE ו- Far Red באותם תאים השומרים על תווית. immunostaining כפול הראה כי תאים שומרי תווית להפגין רמות נמוכות יותר של קרטין חלבון cytokeratin 14, חלבון צומת התא ירד E-cadherin, תאי גזע מוגברת חלבונים סמן מוקדם Wnt10b ו ALDH1A1, חלבון אוטופגיה מוגברת LC3, ו IIB מיוסין מוגברת. יתר על כן, spheroid מבוסס, תווית שמירה assay בהצלחה מזהה תאים דמויי גזע סרטן בדגימות סרטן הערמונית.

CFSE שכותרתו שמירה על תאים סרטניים דמויי גזע וספירואידים שמקורם דגימות סרטן הערמונית האנושי הציג חלבון E-cadherin מופחת ביחס לתאי האחווה שאינם מסומנים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לשמור על מטריצה בצורה נוזלית להכנת תרבות בינונית. אחסנו אותו במשך הלילה בארבע מעלות, וצננים טיפים ב-PBS קר כקרח לפני חלוקת מטריצה.

לאחר בידוד של תאי גזע באמצעות מבדיקת שימור תוויות המבוססת על כדורית, ניתן לבצע רצף RNA חד-תאי וניתוח פרוטומי כדי לזהות גנים ספציפיים וסמנים ביולוגיים חדשניים בתאי גזע. בידוד של תאי גזע סרטניים חיים על ידי הראיה המבוססת על תווית spheroid מאפשר לחוקרים לגדל גידולים שמקורם בתאי גזע סרטניים במבחנה ולהסקרן תרופות חדשניות נגד סרטן.