Name: בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למדו לבודד ולאפיין מסחטות ממברנות מ-Mycobacterium tuberculosis בתנאי ברזל נמוכים. פרוטוקול זה מאפשר ייצור מוגבר של מסחטות טהורות לניתוח ביוכימי ופונקציונלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה לרפאל prados-rosales עבור שיתוף anti-mev קטריולוגיה ו navneet dogra לביצוע ניתוח מעקב ננו-חלקיק.

1. הכנת ברזל מוגדר מידי המדיום
<ol><li>להכין 1 L של בינונית מינימלית (MM) על ידי המסת 5 גרם של KH2PO4, 5 g של L-אספרגין, 20 מ ל של גליצרול, ו 2 גרם של דקסטרוז ב 900 ml של מים מוהים במיכל פלסטיק. להימנע זכוכית כדי למנוע זיהום ברזל. כוונן את ה-pH ל 6.8 עם 5 N NaOH ונפח ל 1 L עם מים.</li>
	<li>הוסף 50 g של שרף מתכת הכלף (MCR) ומתפרעים בעדינות באמצעות משחק מגנטי בר עבור 24 שעות ב 4 ° c. חטא והסר את mcr באמצעות סינון באמצעות יחידת סינון של 0.22 יקרומטר עם מקלט פלסטי. כדי להאיץ את הסינון ולמנוע סתימת מסננים, הנח לשרף לעבור כ -30 דקות לפני הסינון. הערה: מדיום זה מכיל פחות מ 2 μM שיורית ברזל, כפי שנקבע על ידי ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית.</li>
	<li>תוספת MM עם 0.5 mg/L של לאוסול2, 40 Mg/l של mgso4, ו 0.1 Mg/l של mgso4. בנפרד, להכין מניות מרוכז (1, 000x) של כל אחד מתוספי מתכת במים המזים ולעקר על ידי סינון לפני תוספי MM. ברזל התרוקן, מתכת בתוספת MM יהיה התייחס כאן ברזל נמוך MM (LIMM).</li>
	<li>מתוך 50 מ"מ מלאי של פוריות3 מומס 10 מ"מ, להוסיף 1 מ ל 1 L של limm (50 משנת הריכוז הסופי) כדי להכין ברזל גבוה mM (הימלM).</li>
</ol>2. גידול בקטריה ברזל-תנאים מוגבלים
<ol><li>להפשיר את 50 μL של מלאי קפוא 15% גליצרול של Mtb ו פס לצלחת אגר שיושלם עם 10% ADN העשרה (5 g/L אלבומין, 2 g/L דקסטרוז, ו 0.85 g/L נתרן כלוריד, 0.2% גליצרול ו 0.05% יצירת רצף-80)10. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עד מושבות גלויים.</li>
	<li>איחסן מושבה אחת של Mtb10 ב 2 מ ל של בינונית של ציר של פטרת (שולחן חומרים) שיושלם עם העשרה adn. מודטה עם עצבנות ב 37 ° c.</li>
	<li>ניתן לתרבות Mtb לצמוח לשלב המאוחר לוגריתמי (OD540 הוא ~ 0.8). כדי לבדוק את זה, למדוד את OD540 באמצעות ספקטרוסקופיה.</li>
	<li>התפשטות 200 μL של התרבות לוגריתמית מאוחר על לוחותהלוח של החיידק של החומר (טבלה של חומרים) שיושלם עם 0.2% גליצרול, 0.05% רצף-80, ו-adn. מחסן לפחות 5 צלחות. מודמת את הצלחות ב-37 ° צ' עד שהגידול החיידקי נראה כשכבה שוטפת. זה לוקח ~ 1 שבוע עבור Mtb.</li>
	<li>להרטיב מנקי כותנה סטרילית ב LIMM. השתמש בספוגית זה כדי לאסוף חיידקים מלוחות אגר ו חסן mL של limm להכין הבולם חיידקי מרוכז עם OD540 של ~ 1.0.</li>
	<li>לדלל את ההשעיה 10 פעמים 1 L עם LIMM ולחלק אותו לשתיים, 2 L בקבוקי פלסטיק סטרילי, כל אחד המכיל 500 mL של התרבות.</li>
	<li>קחו 2 מ ל של תרבות והעבירו אותו לצינור התרבות של 5 מ ל. הוסף 10 μL של 10% vol/vol tyloxapol.</li>
	<li>מודפה את התרבויות ב-37 ° c בעמידה 14 יום.</li>
</ol>3. אוסף של MEVs
<ol><li>למדוד את OD540 של התרבות 2 מ ל בזמן איסוף. הפוך 1:10 לדילול סדרתי של התרבות והלוח 100 μL של כל דילול על צלחות אגר עם ADN ו 0.05% רצף-80.</li>
	<li>העבר את התרבות כדי 5 225 mL מצינורות צנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה ב 2,850 x g עבור 7 דקות ב 20 ° c.</li>
	<li>לאסוף את התרבות supernatant עם פיפטה 50 mL ומסננים לעקר אותו באמצעות יחידת מסנן יקרומטר 0.22.</li>
</ol>4. בידוד של MEVs
<ol><li>להעביר את פילטרט התרבות לתוך מערכת מעורבב האולטרסאונד תא ממוקם על 4 ° צ' ולסנן את הריכוז ב < 50 psi דרך קרום החיתוך kda 100 ~ 50 mL.</li>
	<li>צנטריפוגה את פילטרט תרבות מרוכזת ב 15,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את supernatant.</li>
	<li>צנטריפוגה את פילטרט התרבות בצינורות פוליקרבונט ב100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.</li>
	<li>השהה מחדש את כדורי הקרומי בסכום כולל של 1 מ ל של תמיסת מלח סטרילית באגירה (PBS) על-ידי ליטוף עדין.</li>
	<li>מערבבים 0.5 mL של ההשעיה גלולה שהושג בשלב 4.4 עם 1.5 mL של 60% הפתרון יודיאקיול, מניב ריכוז יודיאקיול הסופי של 45% wt/vol. מערבבים את התערובת בתחתית של 13 מ"מ x 51 מילימטר ultracentrifuge שפופרת פוליפרופילן דק קירות.</li>
	<li>שכבת-על של MEV-יודיקסנול 45% השעיה עם 1 מ ל של 40%, 35%, 30%, 25%, ו 20% (vol/vol ב PBS) פתרונות יודיקסנול ו-1 mL של PBS בראש.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 18 h ב 4 ° c.</li>
	<li>לאסוף את השברים בצפיפות 1 mL החל מלמעלה באמצעות 1 מ"ל מזרק המילטון.</li>
	<li>לדלל כל שבר שנאסף ל 20 מ ל עם PBS ו צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט והשהה את הגלולה ב 0.5 mL של PBS. . אחסן את הגלולה ב -4 ° c</li>
</ol>5. קוונפיקציה של MEVs
<ol><li>למדוד את ריכוז החלבון בכל שבר על ידי שיטת ברדפורד (לוח חומרים), בעקבות הנחיות היצרן.</li>
	<li>
בצע ניתוח השומנים הממברנה.
	<ol>
<li>מודדת 10 μL של כל שבר מעבר צבע עם ממברנה פלורסנט בדיקה 1-(4-מתיונין לאמונופנקסיל) -6-פניאיל -1, 3, 5-הקספרין p-טולוט (tma-dph) בריכוז סופי של 1 μg/mL בנפח הסופי 50 μl של PBS ב 96 שחור טוב צלחות.</li>
		<li>מודקון את הצלחות ב 33 ° c עבור 20 דקות.</li>
		<li>למדוד את הזריחה ב 360 הריגוש ננומטר ו 430 הפליטה nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. אנליזה איכותית של MEVs
<ol><li>
לבצע אלקטרופורזה בחלבון.
	<ol>
<li>מערבבים כ 1 μg של דגימות MEV ב 16 μL עם 4 μL של מאגר טעינה של 5x לדוגמה (10% w/v SDS, 10 מ"מ מילימטר, 20% v/v גליצרול 0.2 M טריס-HCl, pH 6.8 0.05% w/v ברומרופנול כחול) ולחמם את דגימות במאגר לדוגמה ב 85 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
		<li>טען ב 10% טריס/גליצין SDS-polyacrylamide ג'ל11 ולהפעיל ב 10 V/cm במאגר פועל (25 מ"מ בסיס טריס, 190 מ"מ גליצין, 0.1% sds) עד החזית לצבוע כחול מגיע לתחתית של ג'ל.</li>
		<li>הכתם את הג בתמיסה בעלת רגישות גבוהה לחלבון מכתים (טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביצוע הנקודה החשופה.
	<ol>
<li>טען 2 μL של השעיה MEVs עם ריכוז של כ 0.5 μg/μL, וכפולה מדלל סדרתי על קרום התאית ניטרוגליצרין תהליך לכתם נקודה על פי הוראות היצרן.</li>
		<li>השתמש בנסיוב חיסון הגדל עכברים נגד הכנת MEVs ב דילול של 1:5000 כמו הנוגדן העיקרי עז נגד העכבר מצמידים לחזרת peroxidase (HRP) ב 1:10000 דילול כמו הנוגדן המשני. לזהות אנטיגן-נוגדן מתחמי עם מתאים מתאימים לזיהוי המצע HRP מגיב ומערכת הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בצע כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרוני.
	<ol>
<li>תקן 250 μL של MEVs עם 2% גלוראלדהיד ב 0.1 M cacodylate אוחר בטמפרטורת החדר עבור 2 h ו-דגירה לילה ב 4% פורמלדהיד, 1% גלוטרלדהיד, ו 0.1% PBS.</li>
		<li>הכתם את הדגימות קבוע עם 2% אוסמיום tetroxide עבור 90 דקות.</li>
		<li>מייבשים את המדגם באתנול ומטביעים את שרף האפוקסי של ספאר.</li>
		<li>התבונן ב-MEVs תחת מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

שיטות מרובות כדי לטהר תא איקריוטית הנגזרות המפותחות התפתחו12. לעומת זאת, יש מידע מוגבל על שיטות יעילות כדי לטהר חיידקים נגזר EVs7. בידוד יעיל של Mtb נגזר EVs צריך לשקול את הקשיים הפנימיים בגידול זה פטרת הפתוגני. Mtb יש זמן חלוקה ארוכה (~ 24 שעות) ויש לטפל ברמת בטיחות שלושה (BSL-3) תנאים. לכן, חשוב למטב את היעילות של שיטות בידוד MEV. מכיוון שהחיידקים משחררים גליקולפידים ומולקולות הידרופובי אחרות, שבהן מצטברים ומזהם בקלות את ההכנות של MEV גסה למדיום, חשוב לטהר ולאמת את Mev לפ...

מסחטות של פטרת שלפוחיות (MEVs) הם חלקיקים מאוגדים קרום, 60-300 ננומטר בגודל, באופן טבעי שוחרר על ידי מהיר-ו-לאט גדל בקטריה מפטרת1. Mevs שוחרר על ידי חיידקים פתוגניים מהווים מנגנון לאינטראקציה עם המארח באמצעות חלבונים פעילים חיסוני, שומנים, ו גליקולפידים מופרש באופן מרוכז ומוגן2,3,4. כדי לאפיין MEVs ולהבין הביוגנזה שלהם פונקציות, שיטות קפדניות ויעילות של שלפוחית השמש והאימות הם קריטיים. עד כה, mevs מבודדים מן filtrates תרבות של פטרת גדל בינוני עשיר ברזל1,5,6,7,8.
עם זאת, העבודה הקודמת הוכיחה כי מגבלת ברזל מעוררת במידה רבה שחרור שלפוחית ב Mtb, אולי כדי ללכוד ברזל דרך פטרת, siderophore מופרש MEVs9. למרות ההליכים עבור MEVs בידוד מ Mtb תרבותי בינוני ברזל גבוה תוארו, מתודולוגיה יעילה להשיג MEVs מתרבויות ברזל נמוך לא דווחו. לכן, המטרה של שיטה זו היא לבודד, לטהר, ולכמת mevs שהתקבלו מתרבויות ברזל נמוך, כך שהם יכולים לשמש עבור בחני הביוכימי ופונקציונלי לניתוח של דטרמיניזם גנטי של ייצור שלפוחית לפוחית ב בקטריה.

<table><tbody><tr><td>Amicon תא מעורבב דגם 108</td><td>EMD Milipore</td><td>UFSC40001</td><td>מערכת אולטרה-סינון תאים</td></tr><tr><td>BD פוליפרופילן 225 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר</td><td>05-538-61</td><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td></tr><tr><td>Biomax 100 kDa קרום אולטרה-סינון חתוך</td><td>EMD Milipore</td><td>PBHK07610</td><td>קרום אולטרה-סינון</td></tr><tr><td>שרף Chelex-100</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2842</td><td>מתכת שרף כלאט</td></tr><tr><td>מידלברוק 7H10 אגר</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>צלחות אגר מיקובקטריאליות</td></tr><tr><td>מידלברוק 7H9 מרק</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>מרק מיקובקטריאלי בינוני</td></tr><tr><td>ניטרו תאית ספיגת קרום</td><td>GE Healthcare</td><td>10600001</td><td>ממברנת ספיגה</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>יודיקסנול</td></tr><tr><td>פוליקרבונט אולטרה צנטריפוגה צינורות 25 מ"מ x 89 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>355618</td><td>צינורות צנטריפוגה אולטרה פוליקרבונט 25 מ"מ x 89 מ"מ</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td>צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13 מ"מ x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון</td> צבע <td>BioRad</td><td>5000006</td><td>ברדפורד צביעת חלבון</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S12000</td><td>כתם חלבון רגיש במיוחד</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>T204</td><td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td></tr><tr><td>צלוחיות סינון ואקום</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

בקטריה, כולל שחפת של פטרת (Mtb), הסוכן סיבתי של שחפת האדם, שחרור באופן טבעי ושלפוחיות (EVs) המכיל מולקולות פעילות חיסונית. ידע בנוגע למנגנון המולקולרי של שלפוחית הביוגנזה, התוכן של שלפוחיות, והתפקודים שלהם בממשק מארח הפתוגן הוא מאוד מוגבל. טיפול בשאלות אלה דורש הליכים קפדניים לבידוד, טיהור ואימות של EVs. בעבר, הפקת שלפוחית הייצור היתה משופרת כאשר M. שחפת נחשף הגבלה ברזל, מצב שנתקל Mtb בסביבה המארחת. מוצג כאן הוא פרוטוקול מלא ומפורט כדי לבודד ולטהר EVs מן הברזל מלקוי של ברזל. שיטות כמותיים ואיכותניות מוחלות על אימות EVs מטוהרים.

MEVs היו מטוהרים על ידי משקעי שיפוע דיפרנציאלי במילוי צפיפות (איור 1, איור 2). תחת התנאים שתוארו, MEVs מופרדים בעיקר השבר הדרגתי 3 (F3), אשר מתאים 25% יודיקסנול. מסקנה זו מבוססת על זיהוי חלבון, השומנים הממברנה, ויזואליזציה מיקרוסקופיים של MEVs שלמים, התפלגות ננו-חלקיק size, ופעילות מחודשת חיובית עם נסיוב נגד שלפוחית (איור 2, איור 3). החלבון וריכוז השומנים המנורמל ליחידות...

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

שיטה זו מאפשרת culturing שחפת Mycobacterium בתנאי ברזל נמוכים קפדניים וטיהור וריתי קרום מן הסינון תרבות ברזל נמוכה. מכיוון שמגבלת הברזל ידועה כמעוררת ייצור ורירית הממברנה, פרוטוקול זה מניב שפע גבוה של ורי ורי ממברנה טהורים שניתן לנצל לצורך בדיקות ביוכימיות או תפקודיות נוספות. כאשר אנו מדגימים את הפרוטוקול באמצעות Smegmatis Mycobacterium, הזן הלא ארסי, פרוטוקול זה יכול להיות אחריו במתקני BSL-2 באמצעות שחפת Mycobacterium, הזן ארסי.כדי להתחיל, להכין ליטר אחד של מדיום מינימלי על ידי המסת חמישה גרם של מונופוטזיום פוספט, חמישה גרם של L-אספרגן, 20 מיליליטר של גליצרול, ושני גרם של דקסטרוז ב 900 מיליליטר של מים deionized במיכל פלסטיק. כוונן את ה- pH ל- 6.8 עם חמישה נתרן הידרוקסידי רגיל והתאם את הנפח לליטר אחד עם מים לא מיונים. לאחר מכן מוסיפים 50 גרם של שדון כלאט מתכת בעדינות להתסיס באמצעות מוט ערבוב מגנטי במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, להפסיק את ערבוב ולתת את המזרק שף במשך כ 30 דקות. לעקר ולהסיר את השדר הנותר מהפתרון על ידי סינון באמצעות יחידת סינון 22 מיקרון עם מקלט פלסטיק. עכשיו, תוספת בינונית מינימלית עם 0.5 מיליגרם לליטר אבץ כלורי, 40 מיליגרם לליטר מגנזיום גופרתי, ו 0.1 מיליגרם לליטר של סולפט מנגן.לחסן מושבה אחת של MTB בשני מיליליטר של מדיום מרק mycobacterial בתוספת העשרה ADN. דגירה עם תסיסה ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר יש צמיחה גלויה, לחלץ שני מיליליטר של התרבות ולמדוד את OD 540 על ספקטרופוטומטר.הפסק את הדגירה כאשר OD 540 מגיע ל- 0.8 המציין את השלב הלוגיתמי המאוחר. מורחים 200 מיקרוליטרים של התרבות הלוגאריתמית המאוחרת על לוחות אגר מיקובקטריאליים בתוספת 0.2 גליצרול, 0.5% Tween 80 ו- ADN. לחסן לפחות חמש צלחות.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס. ואחרי שבוע, צמיחת החיידקים נראית כשכבה נוחה. ואז להרטיב צמר גפן סטרילי במדיום מינימאלי ברזל נמוך.השתמש ספוגית זו כדי לאסוף חיידקים מצלחות אגר. לחסן את החיידקים ב 100 מיליליטר של ברזל נמוך מדיה מינימלית בצינור. לאסוף חיידקים מספיק כדי להכין השעיה עם OD 540 של אחד.מדללים את ההשעיה 10 פעמים לליטר אחד עם ברזל נמוך בינוני מינימלי ומחלקים אותו לשני בקבוקי פלסטיק סטריליים. לאחר מכן, להעביר שני מיליליטר של התרבות לצינור תרבות חמישה מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטרים של 10%volume לפי tyloxapol נפח.הדגירה את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים. מעבירים את התרבות לחמישה צינורות צנטריפוגה חרוטיים 225 מיליליטר וצנטריפוגה ב 2, 850 פעמים g במשך שבע דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאסוף את התרבות supernatant עם פיפטה 50 מיליליטר ולסנן לעקר אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון.כדי לבודד MEVs, להעביר את סינון התרבות לתוך מערכת אולטרה סינון תאים מעורבב ממוקם בארבע מעלות צלזיוס ולסנן את הריכוז בלחץ פחות מ 50 PSI דרך קרום ניתוק 100 קילודלטון. ואז צנטריפוגה התרבות המרוכזת לסינון ב 15, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינורות אולטרה צנטריפוגה פוליקרבונט. צנטריפוגה supernatant ב 100, 000 פעמים גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את כדורי קרום בסך הכל מיליליטר אחד של PBS סטרילי על ידי צינורות עדינים. מערבבים 0.5 מיליליטר של ההשעיה גלולה עם 1.5 מיליליטר של 60% פתרון יודיקסנול בחלק התחתון של צינור אולטרה צנטריפוגה דק פוליפרופילן מוקף חומה. שכבת-על זו MVE iodixanol 45%ההשעיה עם מיליליטר אחד של 40%35%30%25%ו 20%iodixanol פתרונות אחד של PBS בחלק העליון.צנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש במזרק המילטון מיליליטר אחד כדי לאסוף את שברי שיפוע צפיפות מיליליטר אחד החל מלמעלה. לדלל כל שבר שנאסף ל 20 מיליליטר עם PBS וצנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuspend ב 0.5 מיליליטר של PBS. אחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע ניתוח שומנים בקרום, לשלב 10 microliters של כל שבר שיפוע עם בדיקה קרום פלואורסצנטי TMA-DPH בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר ב 50 microliters של PBS בכל באר של צלחת שחורה 96 היטב.הדגירה את הצלחות ב 33 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. למדוד את הפלואורסצנטיות ב 360 ננומטר עבור העירור ו 430 ננומטר עבור פליטה. בפרוטוקול זה, MEVs טוהרו על ידי מעים דיפרנציאליים במילוי הדרגתי של צפיפות.תחת התנאים המתוארים, MEVs הופרדו בעיקר בשבר שיפוע שלוש אשר תואם 25%iodixanol. חלבונים הקשורים ל- Vesicle התרכזו בשבריר שלוש המוצג על ידי ניתוח כתמי נקודה. כתמים שליליים אישרו גם את נוכחותם של כלי רכב חשמליים בשבר שלוש וניתוח חלקיקים הראה שגודל ה- MEV היה בסביבות 100 ננומטר.ריכוז החלבון ושומנים מנורמל ליחידות יוצרות המושבה הראה עלייה של כשמונה פעמים של תפוקת MEV בברזל נמוך ביחס לתנאי ברזל גבוהים. ניתוח כתם נקודה הראה אות אינטנסיבי יותר מסמנים הקשורים ל- MEV בשברים הדרגתיים בצפיפות מתרבות MTB מוגבלת מברזל מאשר מתרבויות MTB מספיקות מברזל. בצע את ההוראות להכנת המדיום המינימלי כדי להבטיח תנאים מוגבלים ברזל ולמנוע זיהום של ורידים קרום עם אגרגטים lipoprotein.ורי הווסיקים הממברניים המטוהרים באופן זה יכולים לשמש לאפיון ביוכימי וניתוח תפקודי.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Gupta, S., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל כדי לגרום ללחץ ברזל ולקדם הפרשת סידרופורים התומכים בהישרדות חיידקים.

גידול Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל

מקור: גופטה, ס., מרסלה רודריגז, ג. בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הבידוד ההדרגתי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Mycobacterium tuberculosis שגודלו בתנאים מגבילים של ברזל המחקים את הסביבה המארחת. הוא מתאר את השימוש באולטרה-סינון, צנטריפוגה דיפרנציאלית והפרדת שיפוע צפיפות כדי להעשיר ולזהות שברים המכילים EV.

בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות המכילות סידרופור מ-Mycobacterium tuberculosis

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

סרטון זה מתאר שיטה המבוססת על כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות או כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מערכת החיסון במוח – תאי המיקרוגליה. כלי הרכב החשמליים פועלים כמטען מולקולרי כדי לספק מתווכים, המווסתים תגובה חיסונית. לכן, כלי הרכב החשמליים המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה לחקר הדיבור בין תאי עצב למיקרוגליה במהלך תגובה חיסונית עצבית.

בידוד מבוסס SEC של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן במיקרוגליה: טכניקה לבידוד בועיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית מותנית במיקרוגליה

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (EVs) מסנין התרבית של Mycobacterium tuberculosis (Mtb). הטכניקה משתמשת בעמוד שרף נקבובי כדי להשיג שברים מטוהרים של כלי רכב חשמליים. החלקיקים הנקבוביים מאפשרים באופן סלקטיבי לחלבונים קטנים יותר להיכנס לנקבוביות, וכתוצאה מכך ההדבקה איטית יותר. במקביל, כלי רכב חשמליים אינם נכנסים לנקבוביות בשל גודלם הגדול יותר והם מדוללים ראשונים.

טכניקת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות

שלפוחיות חוץ-תאיות הקיימות בדם הוצעו כסמנים ביולוגיים חדשים למחלות שונות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של מיקרו-שלפוחיות גדולות שמקורן בקרום פלזמה מדגימות דם היקפיות וניתוחם לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה קונבנציונלית ו-Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למדו לבודד ולאפיין מסחטות ממברנות מ-Mycobacterium tuberculosis בתנאי ברזל נמוכים. פרוטוקול זה מאפשר ייצור מוגבר של מסחטות טהורות לניתוח ביוכימי ופונקציונלי.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

גלה סרטונים נוספים