ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות

מיקרוסקופ כוח המתיחה משמש למדידת כוחות שנוצרו על ידי תאים. פרוטוקול זה מפשט את ניתוח האיסוף של נתוני כוח המתיחה, על מנת להפוך אותם לנגישים יותר למשתמשים לא מנוסים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פלטפורמות מיקרוסקופיות קיימות של כוח משיכה ללא התייחסות, הוא שליטוגרפיה של מולטיפוטונים מאפשרת עיצוב מחדש של הגדרת תבנית מהירה וקלה בהתאם לצרכים ניסיוניים אישיים.

ישנם שלבים מרכזיים רבים בהמצאה וביישום של פלטפורמת המתיחה החדשה נטולת הייחוס שקל יותר להבין באמצעות ייצוג חזותי ולא באמצעות טקסט בלבד. עבור פוטופולימריזציה של הידרוג'ל הבסיס, תחילה להוסיף שלושה microliters של פתרון טרום פולימר על גיליון דק, שטוח של alkanes perfluoroalkoxy, ולמקום שטוח 150 מיקרומטר עבה PDMS רצועות המקיפות, אבל לא במגע עם, טיפה של פתרון טרום פולימר. מניחים כיסוי אקרילאט סילני על PDMS, עם טיפת טרום פולימר ממורכז מתחת לכיסוי כדי לשטח את טיפת טרום פולימר לעובי של מפזרי PDMS.

חשוף את תווי הטרום פולימר הכריכים לאור UV למשך כדקה. כאשר הידרוג'ל נוצר במלואו, הפרד בזהירות את הכיסוי ממרחבי PDMS. השתמשו בהצמדה אקרילית דו-צדדית עם ביצועים גבוהים כדי לחבר צלחת פטרי תחתונה פתוחה לכיסוי.

יש לדאוג במיוחד בעת דבקות כיסוי הידרוג'ל עמוס צלחת פטרי. צלחת רטובה או מעט מדי לחץ במהלך היישום יאפשר דליפות להיווצר, הורס את המדגם. החל לחץ על משטח המגע דבק כדי ליצור חותם שלם בין כיסוי, דבק, צלחת פטרי, דואג לא לפצח את הזכוכית.

השתמש PBS מסונן סטרילי לשטוף את הידרוג'ל. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של NVP ל-800 מיקרוליטרים של פתרון המעבדה שהוכן לסינתזת ההידרוגל. להמרת תמונה בינארית למסיכה דיגיטלית, פתחו את MATLAB פתחו והפעילו את הכתב.

m תסריט MATLAB. בחר את קובץ TIF הבינארי להמרה ובחר תיקיה לשמירת קבצי האזור. הזן את הגודל הסופי הרצוי במיקרונים של התמונה שנבחרה.

תמונת הקלט תשתנה ותתאים לפרמטרים אלה. כדי ליצור מערך פיקסלים בודד, באפשרויות אזור מחולל העניין, בטל את סימון התיבה הסר טיק תחת אזורים קטנים/פיקסלים בודדים, סמן את התיבה טיק ריבועים ו בטל את הסימון השתמש תחת קווי מעבר אופקיים. לאחר מכן, לחץ על אישור. קובץ OVL יימצא בתיקיה שצוינה קודם לכן.

פתח את הקובץ בתוכנת המיקרוסקופ וטען את האזורים הרצויים ששלטו בתריס הלייזר במהלך שתי ליטוגרפיה של סריקת לייזר פוטון. השלבים הבאים צריכים להתבצע בתנאים עם אור מינימלי. לייצור מערכי סמן נאמנות בתנאי תאורה נמוכה, יש לערבב ביסודיות 200 מיקרוליטרים של פתרון מעבדת NVP שהוכן בעבר עם 20 מיליגרם של אלקסה פלואור 633 ולהסיר את כל ה- PBS מהמנה המכילה את ההידרוגל.

מוסיפים את תערובת PEG-633 להידרוגל כטיפת המקיפה לחלוטין את הידרוג'ל הבסיס ועומסים את צלחת פטרי על מחזיק הדגימה של שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן מכסים את המנה ומאפשרים לתספוס הדוגמאות להשרות את ההידרוגל לפחות 30 דקות, מוגן מפני אור. כדי להגדיר את המיקרוסקופ להדמיה, בחר את הלייזרים והמסננים המתאימים להדמיית אלקסה פלואור 488.

אתר את ההידרוגל באמצעות אות PEG-488 וחסום את האוסף של אורכי גל פליטה ארוכים יותר מהגלאי. השתמש בסריקות אריחים אנכיות ואופקיות כדי לאתר את מרכז ההידרוגל במישור XY ואפס את השלב במיקום זה. השתמש בסריקות קו בפונקציה מחסנית Z כדי לאתר את פני השטח של ההידרוגל ואפס את המוקד במיקום זה.

יישר את ההידרוגל על-ידי חזרה על סריקות הקו הרחק ממרכז ה- XY כדי לזהות את מיקום פני השטח, וכוונן את בורגי הסט לשלב המיקרוסקופ, לפי הצורך. בתוך סביבת העבודה של תוכנת המיקרוסקופ, צור קובץ ניסוי נפרד עבור פוטופטרנינג והגדר את העוצמה מרובת הפוטון ל- 1.8% ואת מהירות הסריקה לשישה. התאימו את גודל מסגרת התמונה והפיקסלים כדי להגיע לגודל פיקסל של 0.1 מיקרומטר לפיקסל ויחס גובה-רוחב של 100 לפיקסל ותטענו את קובץ האזורים ללשונית האזור.

השתמש במאקרו כדי להגדיר את כל האזורים כדי להשיג ולהפעיל את הפונקציה מחסנית Z. הגדר את המרווח ל- 3.5 מיקרומטרים לעומק כולל של 28 מיקרומטרים ולמספר הכולל של פרוסות Z של תשעה. לאחר מכן השתמש בפונקציה עמדות כדי להגדיר מיקומים ספציפיים על הידרוג'ל שבו מערכי סמן הנאמנות יהיה photopatterned.

ככל שזמן ההשריה מתקרב לסימן 30 הדקות, רכשו סריקות קו Z-stack רצופות של פני השטח של ההידרוגל כל חמש דקות כדי לבדוק נפיחות בהתבסס על שינויים במיקום פני השטח ביחס למיקום המיקוד המאפס. אם לא התרחש שינוי במצב פני השטח במהלך מרווח הזמן של חמש דקות, הפעל את הגדרות התבניות ולהשתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לוודא כי פני השטח של ההידרוגל לא זז במהלך דפוס. לאחר מכן להסיר את הידרוג'ל מן המיקרוסקופ, לשאוב את הפתרון PEG-633 מן צלחת פטרי, ולשטוף את המנה עם PBS מסונן סטרילי.

כדי לרכוש תא ותמונות סמן נאמנות, להחזיר את צלחת פטרי למחזיק המדגם כדי לאתר את האזורים בדוגמת. אתר תא מעניין ורכוש תמונה משודרת או פלואורסצנטית של התא. לאחר מכן לרכוש ערימת Z של המערך בדוגמת מתחת לתא כפי שהוכח, ולרכוש קבוצה שנייה של תמונות משודרות או פלואורסצנטיות של התא.

בעת איסוף ערימת תמונות, התמונות המתקבלות אמורות להציג מערך קבוע של תכונות בדוגמת מילוי המתנוודה בעוצמה כפונקציה של מיקום Z בתוך ערימת התמונות. המעקב. סקריפט m מספק מספר תמונות אבחון, כולל הקרנה Z של סמני הנאמנות הפלואורסצנטיים כדי להעריך את איכות העיבוד מראש, חלקה של centroids שזוהו, צבע מקודד כפונקציה של מיקום Z כדי להעריך את איכות זיהוי האובייקט, ועלילה של המסלולים המייצגים את centroids סמן זוהה כי קושרו לעמודות בכיוון Z כדי להעריך את איכות מעקב האובייקט.

סקריפט DISP 3D.m מספק התוויית עוצמה כפונקציה של מיקום Z עבור כל עמודה של תכונות שזוהו בערימת תמונות נתונה כדי להעריך את איכות פרופילי עוצמת הסמן הנאמנות. שניהם להתנתק תלת מימד.

m ו- DISP גיהוי. יחד מספקים היסטוגרמות של רעש התזוזה הנמדד בכל אחד מממדי הקואורדינטות הקרטזיות, כמו גם מפות חום משולבות של תזוזה. בנוסף, האינטרפ final3D_2.

m מספק מפות חום של משטחי הליכה המחושבים באמצעות הקוד במיקור חוץ. הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי פתרונות המכילים LAP רגישים לאור צריך להיות מוגן ככל האפשר ממקורות אור הסביבה. זכור כי NVP הוא תרכובת אורגנית נדיף תמיד צריך להיות מטופלים מכסה המנוע זרימה כימית.