Name: הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למד ליצור אורגנואידים אנושיים מרירית הרחם הכוללים תאים אפיתליאליים וסטרומליים לחקר תגובות הורמונליות ומנגנוני מחלה. שיטה זו מאפשרת בדיקת תרופות במודל פיזיולוגי רלוונטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הUG3 מענק (ES029073) ובית הספר נורת'ווסטרן פיינברג לרפואה גשר של הקרן (JJK). היינו רוצים להכיר את מתקן ליבת הפתולוגיה הצפון-מערבי לעיבוד האורגנואידים הקבועים להטבעת פרפין. היינו רוצים להכיר בצוות הUG3 כולו, כולל מעבדות וודרוף, בורדט ואורנק לדיונים ושיתופי פעולה בתובנה.

דגימות רירית הרחם נאספו מנשים טרום גיל המעבר שעברו כריתת רחם שגרתית לתנאי הרחם שפירים באוניברסיטת נורת'ווסטרן לנשים בבית החולים, על פי הלוח סקירה מוסדית מאושר פרוטוקול. הסכמה כתובה הושגה מכל הנשים הכלולות במחקר.
1. הכנת תבניות צמח
<ol><li>לפני תחילת בידוד התא, הטלת ושיווי משקל 1.5% agarose תבניות מיקרו (לוח חומרים) לבית האורגנואידים על פי הוראות היצרן.</li>
</ol>2. הדור של מארגני רירית הרחם
<ol><li>בציר סטרומה ראשוני ותאי אפיתל
	<ol>
<li>ב הקבינט אבטחה טיחות באמצעות טכניקה אספטית, להכין פתרון אנזים (2.5 mg/ml כגון הסוג אני + 0.1 mg/ml dnase אני ב 10 מ ל של dispase [500 יחידות]) ב 37 ° c, וסטרילי לסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק ב0.2 יקרומטר לתוך שפופרת חרוט 15 מ"ל.</li>
		<li>ב הקבינט אבטחה טיחות באמצעות טכניקה אספטי, לגרד את רירית הרחם מן הביופסיה ביופסיה ורקמות האוהב תחת כיסוי לתוך חתיכות קטנות מאוד עם אזמל. הערה: רקמת רירית הרחם היא לפחות 20 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ נדרש כדי ליצור מספר מספיק של אורגנואידים.</li>
		<li>הכניסו את הרקמה הטרייה לתמיסת האנזים בצינור של 15 מ"ל. סגרו את המכסה ועטפו את החלק העליון בסרט שעווה (לוח חומרים) כדי למנוע זיהום.</li>
		<li>הניחו את הצינורית בעזרת רקמה באמבט מים או בחממה ב-37 ° c למשך 30 דקות עם טלטול עדין (80-100 סל ד).</li>
		<li>מחסנית מסננת של תא 100 יקרומטר על גבי מסננת תא באורך 20 יקרומטר בשפופרת מלאה של 50 mL. לסנן את הפתרון דרך שני בכיינים, ולאחר מכן לשטוף את 15 מ"ל שפופרת חרוטי עם 10 מ ל של פתרון מלח מאוזנת של האנק (HBSS; רשימת חומרים) ולשים את הכביסה דרך מסננת כדי להבטיח את כל התאים נאספים. הערה: נוזל הזרימה מכיל תאים סטרומה וכדוריות דם אדומות (~ 20 מ"ל בסך הכל). תאים אפיתל נאספים על מסננת 20 יקרומטר. גושים של רקמה לא מתעכל להישאר על גבי מסננת 100 יקרומטר. השמט רקמה לא מתעכלת. למיכל פסולת ביולוגית</li>
		<li>היפוך 20 יקרומטר תא מסננת משלב 2.1.5 אל צינור 50 mL חדש ולשטוף את התאים האפיתל מתוך מסננת עם 20 מ ל של מדיה אורגנואיד (טבלת חומרים) שיושלם עם 1% עט/דלקת.</li>
		<li>צנטריפוגה את צינורות חרוט משלבים 2.1.5 ו 2.1.6 ב 500 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>עם תאים מסטרומה שנאספו, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 10 מ ל של מאגר פירוק הדם האדום של תא דם.  מודלת ב 37 ° c במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה את צינור החרוט ב 500 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה עם 200-300 μl של מדיה ארגונית (ראה שלב 2.2.2 לקבלת הוראות נוספות).</li>
		<li>עם התאים האפיתל שנאספו, להסיר את supernatant ו להשעות מחדש עם 100 μL של מדיה ארגונית (ראה שלב 2.2.2 לקבלת הוראות נוספות).</li>
	</ol></li>
	<li>זריעת תאים
	<ol>
<li>לאחר הטיית 1.5% בתבניות agarose בבארות (1 עובש לכל טוב) של צלחת 24-באר, להסיר מדיה ארגונית על החלק החיצוני של בתבניות agarose להטות את צלחת התרבות רקמה כך המדיום מן החדר הזורחת התא של מנות agarose יכול גם להיות הוסרו בקפידה.</li>
		<li>צפה האפיתל (משלב 2.1.9) ו סטרומה (משלב 2.1.8) שתלים סלולריים מתחת למיקרוסקופ.  הוספת מדיה אורגנואיד נוספים להשעיות האפיתל או השסטרומה של התא 100 μL בכל פעם, כך שהשעיות יהיו שוות בערך בצפיפות. הערה: תאים אפיתל יהיה לקבץ יחד, וזה לא מומלץ לעכל/טריסיזציה של תאים אפיתל לתוך השעיות תא יחיד.</li>
		<li>לשלב 1 חלק של תאים סטרומה עם 3 חלקים של תאים אפיתל על ידי נפח.</li>
		<li>פיפטה 50 μL (60,000 תאים) של השעיית התא המשולב לחדר הזריעה של התא של העובש האגקם.</li>
		<li>לאחר בתבניות agarose מלאים תאים, בזהירות להוסיף 400 μL של מדיה אורגאיד טרי לתוך הבאר של הצלחת 24. הערה: המדיום מגיע בדיוק מתחת לפני השטח של הצלחות והוא לא יגרום לתאים לרחף מתוך התבניות. לאחר 2-3 ימים, התאים יתייבו ויתחילו ליצור אורגנואידים.</li>
		<li>שנה בינונית כל יום שני עם 500 μL של מדיה ארגונית.</li>
		<li>לאחר 2-3 ימים, לשנות בינונית לאחד שיושלם עם 0.1 ננומטר אסטרדיול (E) ו 0.8 nm ננומטר (T) כדי לקדם ארגון של תאים אפיתל ו סטרומה. הערה: למרות הארגון של תאים אפיתל וסטרומה יכול להתרחש עם או בלי הורמונים, אורגנואידים יותר יהיה לארגן בנוכחות של הורמונים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. קציר אורגנואידים הרחם עבור ניסויים
הערה: לאחר הניסוי נעשה, אורגמנואידים רירית הרחם ניתן לעבד עבור היסטולוגיה או ניתוח RNA. השלבים הבאים מתארים כיצד לעבד את האורגנואידים.
<ol><li>
יסטולוגיה
	<ol>
<li>התמוססות 1.5% התעוררה בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) על ידי רתיחה. הניחו לנוזל להתקרר כ-50 ° c.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ מבתר, הטה את הצלחת 24-באר ופיפטה בזהירות את המדיום מחוץ לתבנית הצמח. פיפטה בזהירות את המדיום מתוך הפנים של עובש הצמח כדי למנוע שיבוש האורגנואידים.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ מבתר, פיפטה בזהירות 70-75 μL של חם (50 ° c) 1.5% agarose תעוררה לתוך החדר של הצלחת agarose. . תיזהרי לא להפריע לאורגנואידים</li>
		<li>תנו להתקרר ב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) לתוך כל באר של 24 צלחת ולתקן את העובש האטום כולו המכיל אורגנואידים לילה ב 4 ° c. ואז לאחסן ב-70% אתנול ב 4 ° צ' עד מוכן לעיבוד פרפין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בידוד רנ א
	<ol>
<li>תחת מיקרוסקופ מבתר, הטה את צלחת 24 הצלחות ופיפטה בזהירות את המדיום מתוך החדר של העובש האגקם.</li>
		<li>פיפטה בכוח 1 מ ל של מדיום אורגאיד טרי ישירות לתוך העובש האגקם כך האורגנואידים הם לרוקן את המיקרוגל. להיזהר לא ליצור יותר מדי בועות.</li>
		<li>חזור על הליטוף שוב עם אותו מדיום משלב 3.2.2.</li>
		<li>לאסוף את כל המדיום המכילה את האורגנואידים. צנטריפוגה במהירות מקסימלית כדי לאסוף את האורגנואידים ולהמשיך לחילוץ RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

יצרנו אורגנואידים רירית האדם מורכב של תאים אפיתל ו סטרומה של רירית הרחם ללא שימוש בחומרים לגרדום אקסוגני. אמנם זה כבר הוכח כי תאים הראשי האפיתל רירית הרחם יכול ליצור אורגנואידים6,7, תאים אלה היו מוטבעים במטריצה ז'לטין של חלבונים שמופרשים על ידי תאי סרקומה של העכבר (ראה טבלת חומרים) כדי לעזור יצירת מבנים דמוי ספרואיד. בנוסף, תאים סטרומה רירית הרחם נעדרו. אנו משערים כי התאים סטרומה במערכת שלנו, שהיא מרכיב תומך חיוני של רקמת רירית הרחם, בתנאי הפיגום...

רירית הרחם האנושי קווי החלל הרחמי ומשמש כאיש הקשר הראשון עבור העובר בזמן השרשה. רירית האנדויום מורכב של לומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, מסטרומה, בתאי האנדותל ותאי החיסון התומכים. יחד, אלה סוגים תא להפוך את רקמת רירית הרחם שהיא אחת הרקמות התגובה ביותר כדי למין הורמונים סטרואידים1. השינויים המתרחשים בכל מחזור וסת מרשימים. הצמיחה המתאימה שיפוץ של רירית המוח נדרש כדי לאפשר השתלת העובר להתרחש. התגובה החריגה אסטרוגן ופרוגסטרון יכול לגרום לרירית הרחם עקשן כי אינו מאפשר הקמתה מוצלחת של ההריון והוא יכול גם לגרום למחלות כולל רירית הרחם neoplasia.
על מנת ללמוד את התגובות הורמון ושינויים חיוניים המתרחשים רירית הרחם, תאים מרקמות רירית הרחם מקבל מטופלים במהלך ניתוח או ביופסיה רירית הרחם הופץ בתרבות התא. תאים סטרומה רירית הרחם מעדיפים להתרבות ולהפיץ בקלות, ותהליך של בידול הנגרמת על ידי פרוגסטרון יכול להיות מסכם מבחנה. כתוצאה מכך, הרבה למדו בתהליך בידול זה, כינה את דצידוליזציה2,3. הסוג השני של התא העיקרי רירית העין, הלומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, עם זאת, לא לגדול גם monolayers המסורתית, לאבד קוטביות, להיות הסנדק, ולאחר פוטנציאל מתרבים מוגבלת. כתוצאה מכך, פחות ידוע של הביולוגיה שלהם ואת תפקידם באנדורירית האנושי. כמו neoplasia רבים מקורם בתאי האפיתל, מנגנונים הקשורים היפרפלזיה או טרנספורמציה לתאי סרטן להישאר מוגדרים לחלוטין. יתר על כן, מחקרים הקימו כי תגובת הורמון כרוך פעולות הפרדרין אינטימי בין התאים אפיתל ו סטרומה של רירית האנדויום4,5.
לאחרונה, התרבות האורגאידית תלת-ממדית של תאים אפיתל רירית הרחם הוקמה על ידי שתי קבוצות עצמאיות6,7, שהן הדיווחים הראשונים של אורגנואידים שנוצרו רקמת רירית הרחם. האורגנואידים האלה היו מורכבים של תאים אפיתל רירית הרחם מוטבע בתוך מטריצת חלבון (הטבלה של חומרים) ולא כללה תא חשוב ורמונאלי תגובה של רירית הרחם רירית, סטרומה. כמו חלבונים מטריקס יכול להשתנות הרבה הרבה והוא יכול להפעיל מסלולים איתות כי לא בהכרח להתרחש ברקמה, זה יהיה אידיאלי כדי להחליף את החלבונים מטריקס עם רכיבים של רירית העור. במחקר הנוכחי, פרוטוקול לייצר לגרדום ללא האדם אורגנואידים רירית הרחם של תאים אפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי מוצג. הנוכחות של תאים סטרומה לא רק מספק את התמיכה עבור תאים אפיתל אלא גם מספק את פעולות הפרפרין הדרושים אשר הוקמו להיות חשוביםעבור תגובה הורמון ריריתהרחם 4,8,9 .
אורגאיד החדש של רירית הרחם מציעה מערכת מודל של רירית הרחם כי הוא פשוט לייצר והמשלבת הן תאים אפיתל ו סטרומה. אורגנואידים אלה יכולים לשמש ללימוד שינויים הורמונליים לטווח ארוך ואירועים מוקדמים של מחלות כגון tumorigenesis בשל חוסר איזון הורמונלי או עלבונות אקסוגני. המורכבות של האורגנואידים האלה יכול בסופו של דבר להתרחב כדי לכלול סוגי תאים אחרים, כולל התאים אנדותל והחיסון עם תאים myometrial שפט באמת לחקות את הפיזיולוגיה של רקמת האדם.

<table><tbody><tr><td>Agarose HS, ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>תבניות אגרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג II, אבקה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>כתם אוזין</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>קולטן אסטרוגן (SP1), נוגדן חד שבטי ארנב</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield עם DAPI, מדיום הרכבה היסטולוגי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום</td></tr><tr><td>תמיסת כתמי המטוקסילין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>ניסוח האריס שונה,</td></tr><tr><td>תמיסת הפרין</td> ללא כספית <td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>נוסף למדיה של MammoCult</td></tr><tr><td>פתרון מלאי הידרוקורטיזון</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>נוסף למדיה של MammoCult</td></tr><tr><td>מדיה אורגנואידית - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>בתוספת 2 ומיקרו; L/mL הפרין ו-5 ומיקרו; L/mL הידרוקורטיזון</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, תמיסה 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט, pH 7.4</td><td>קולטן פרוגסטרון Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr>, <tr><td>PgR 1294, לא מצומד, תרבית סופרנטנט</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת חלבון - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד E-cadherin עכבר מטוהר</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-וימנטין רקומביננטי [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ליזה ובידוד RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>טסטוסטרון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>טריכרום כתם</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>סרט שעווה - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

רירית האדם האנושי הוא אחד הרקמות הורמונאלי ביותר בגוף והוא חיוני להקמת ההריון. רקמה זו יכולה גם להיות חולה ולגרום לתחלואה ואפילו מוות. מערכות מודל ללמוד ביולוגיה רירית הרחם האנושי הוגבלה במערכות תרבות מבחנה של סוגי תאים בודדים. בנוסף, התאים האפיתל, אחד מסוגי התא העיקריים של רירית הרחם, לא מופצים היטב או לשמור על התכונות הפיזיולוגיות שלהם בתרבות, ולכן ההבנה שלנו של ביולוגיה רירית הרחם נשאר מוגבל. יצרנו, בפעם הראשונה, אורגנואידים רירית הרחם המורכבים משני התאים האפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי. אורגנואידים אלה אינם דורשים כל חומר הגרדום האקסוגני ובמיוחד לארגן כך תאים אפיתל להקיף את המבנה דמוי ספרואיד ולהיות מקוטב עם תאים סטרומה במרכז המייצרים ומפרישות קולגן. אסטרוגן, פרוגסטרון וקולטנים אנדרוגן מבוטא בתאי אפיתל, סטרומה וטיפול ברמות פיזיולוגיות של אסטרוגן וטסטוסטרון לקדם את הארגון של האורגנואידים. מערכת זו מודל חדש יכול לשמש כדי ללמוד ביולוגיה רירית הרחם נורמלי מחלות בדרכים שלא היו אפשריות לפני.

תרשים שרטוט של הפרוטוקול מתואר באיור 1. רקמת הרחם הושגה מהניתוח לאחר שנבדק על ידי פתולוגים. רירית רירית הרחם הופרד מ myometrium על ידי גירוד ואת רקמת רירית הרחם היה מתעכל בהתאם לתאים כפי שמתואר בפרוטוקול. תאים אפיתל וסטרומה נוספו למיקרוגל בתבניות agarose. לאחר שבעה ימים בתרבות, טופלו בארגון E ו-T במשך 7-14 ימים נוספים.
לעיבוד היסטולוגית, התבניות המאובנת המכילות אורגנואידים של רירית הרחם נסגרו בעקבות הקיבעון באמצעות קיבוע של 4% בעלי לילה. תבניות אלה עובדו עבור הטבע...

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

רירית האנדומטריום היא רקמה משתנה מדי חודש בתגובה להורמונים. חוסר איזון הורמונלי יכול למנוע התקשרות עובר וגם לגרום למחלות כמו סרטן. הפרוטוקול שלנו בונה מחדש את האנדומטריום כך שניתן יהיה ללמוד אותו מחוץ לגוף האישה בצורה פיזיולוגית.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מבנה תלת מימדי של תאים המורכבים משני סוגי תאים מגיבים הורמונלית, תאי האפיתל והסטרומה המארגנים ומתנהגים באופן ספציפי כפי שהם מתנהגים בגוף. מאז האורגנואידים יכולים לחקות טוב יותר התנהגות רקמות, הם יכולים לשמש בסופו של דבר כדי לבדוק תרופות שונות. אורגנואידים רירית הרחם ניתן להשתמש כדי ללמוד השפעות ישירות של גורמי סיכון ידועים כיום לסרטן, כולל השמנת יתר ותסמונת השחלות הפוליציסטיות.האורגנואידים שלנו מדגישים את החשיבות של פעולות פרקטריניות בין שני סוגי תאים. חשוב להתחיל עם כמות מספקת של רקמה. קבלת הצפיפות הנכונה של תאים אפיתל וסטרומל יכול להיות מסובך.כמו כן, האורגנואידים הם די קטנים וקשה לדמיין אותם עם כתמי IHC. הדמיה של הליך זה חשובה מכיוון שיש כמה שלבים שיהיה הרבה יותר קל להבין לאחר שראו אותם. אלה כוללים קבלת שכבת הרקמה הנכונה של הרחם, מקבל את הצפיפות הנכונה של תאים לשלב, וזרע את תבניות אגרוז.לפני תחילת בידוד התא, יציקה לצייד 1.5% agarose מיקרו תבניות על פי הוראות היצרן לשכן את האורגנואידים. ב ארון biosafety, להשתמש בטכניקות aseptic להכין פתרון אנזים ב 37 מעלות צלזיוס מסנן סטרילי את הפתרון באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2 לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. באמצעות אזמל, לגרד את אנדומטריום מן ביופסיות הרחם טחון את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד.מניחים את הרקמה הטרייה בצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל את פתרון האנזים. סגור את הכובע ולעטוף את החלק העליון של הצינור עם סרט שעווה כדי למנוע זיהום. מניחים את הצינור לתוך אמבט מים או אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם רעידות בעדינות.לאחר מכן, מחסנית מסננת תא 100 מיקרון על גבי מסננת תא 20 מיקרון על צינור חרוט 50 מיליליטר. סנן את הפתרון דרך שני מסננים. לשטוף את הצינור חרוט 15 מיליליטר עם HBSS ולשים את זה לשטוף דרך מסננת כדי להבטיח כי כל התאים נאספים.לאחר מכן, להפוך את מסננת תא 20 מיקרון על צינור חרוט חדש 50 מיליליטר ולשטוף את תאי האפיתל את מסננת עם 20 מיליליטר של מדיה אורגנואידית בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין. צנטריפוגה צינורות חרוט ב 500 G במשך חמש דקות. עבור תאים סטרומה שנאספו, להסיר את supernatant ו resuspend את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ תות דם אדום.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה תאים אלה ב500 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה עם 200 כדי 300 microliters של מדיה אורגנואידית.עבור תאים אפיתל שנאספו, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה ב 100 microliters של מדיה אורגנואידית. לאחר 1.5% תבניות agarose הם שיווי משקל, להסיר את התקשורת organoid בצד החיצוני של תבניות אגרוז להטות את צלחת תרבות הרקמה, כך המדיום מתא זריעת התא של מנות אגרוז ניתן גם להסיר בזהירות. הצג את המתלים אפיתל ותא סטרומה תחת מיקרוסקופ ולהוסיף מדיה אורגנואידית יותר המתלים, הקפד להוסיף רק 100 microliters בכל פעם, כך ההשעיה שווים בערך בצפיפות.לאחר מכן לשלב חלק אחד של התאים stromal עם שלושה חלקים של תאי האפיתל לפי נפח. פיפטה 50 מיקרוליטרים של ההשעיה התא המשולב לתוך תא זריעת התא של עובש אגרוז. לאחר תבניות agarose מלאים בתאים, בזהירות להוסיף 400 microliters של מדיה organoid טרי לתוך הבארים של צלחת 24 היטב.הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני, הקפדה לשנות את המדיום כל יום שני עם 500 microliters של מדיה אורגנואידית. לאחר שבעה ימים, לשנות את המדיום לאחד כי הוא הוסיף 0.1 אסטרדיול ננו-מולאר ו 0.8 טסטוסטרון nanomolar כדי לקדם את הארגון של התאים אפיתל וסטרומל. ראשית, להמיס 1.5% agarose ב PBS על ידי רותחים.מניחים את הנוזל התעורר לתוך מקור של מים חמים ולאפשר לו להתקרר כ 50 מעלות צלזיוס. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להטות את הצלחת 24 היטב בזהירות pipette החוצה את המדיום מבחוץ של עובש אגרוז. ואז בזהירות pipette את המדיום מפנים של עובש אגרוז, כדי למנוע שיבוש האורגנואידים.בזהירות להוסיף בין 70 ל 75 microliters של חם, 1.5% התעורר לתוך התא של צלחת אגרוז, נזהר לא להפריע האורגנואידים. תן לצלחת להתקרר בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4% paraformaldehyde לכל באר של צלחת 24 בארות ותקן את כל עובש אגרוז אטום לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, לאחסן את הצלחת ב 70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לעבד להטמיע פרפין. כדי להתחיל בבידוד רנ"א, הצג את הלוח תחת מיקרוסקופ לנתח. להטות את הצלחת בזהירות pipette את המדיום מן התא של עובש אגרוז.בכוח pipette מיליליטר אחד של מדיום אורגנואיד טרי ישירות לתוך עובש אגרוז, כך organoids הם סמוקים מתוך microwells, נזהר לא ליצור בועות רבות מדי. חזור על תהליך צינורות כוחני זה פעם אחת באמצעות אותו מדיום. לאחר מכן, לאסוף את כל המדיום המכיל את האורגנואידים.צנטריפוגה ב 500 G כדי לאסוף את האורגנואידים, ולהמשיך מיצוי RNA. במחקר זה, אורגנואידים רירית הדם האנושית המורכבת תאים אפיתל וסטרומלי של רירית האנדומטריום נוצרים ללא שימוש בחומרי פיגום אקסוגני. לעיבוד היסטולוגי, תבניות אגרוז המכילות אורגנואידים רירית האנדומטריאלית אטומים עם אגרוז, ואחריו קיבעון עם 4% paraformaldehyde לילה.תבניות אלה מעובדות להטבעת פרפין סטנדרטית חתוכה ומוכתמת בהיסטולוגיה, שפעת חיסונית או אימונוהיסטוכימיה. המטוקסילין מכתים אאוסין מגלה מבנה דמוי כדורית עם שכבה אחת של תאים רירית בחוץ ותאים במרכז. סמנים ספציפיים לתאים אנדומטריאליים, אפיתל וסטרומל חושפים תאי אפיתל המקיפים את האורגנואיד עם תאים סטרומה במרכז.סמנים של פיזיולוגיה רירית רירית האנדומטריה לאשר כי האורגנואידים רירית האנדומטריאלי שמרה על מאפיינים מסוימים של הרקמה המקורית. כתמים תלת-כרום, אשר מכתים קולגן כחול ותאים אדומים, מראה את נוכחותו של קולגן בתוך המרכז שבו התגוררו תאים סטרומה, המדגים ייצור פעיל הפרשת קולגן על ידי תאים סטרומה דומה לרקמה המקומית. בנוסף, כתמים אימונוהיסטוכימיים חושפים את נוכחותם של קולטני אסטרוגן, קולטני אנדרוגן, קולטני פרוגסטרון בתאי האפיתל והסטרומל.חשוב לצלחת את התאים בצפיפות, כך שיש לנו מספיק אורגנואידים לניסויים במורד הזרם. זה ייקח קצת תרגול. אורגנואידים רירית רירית האנדומטריה ניתן לתרבת בתנאים שונים ולאחר מכן שנקטפו לניסויים כמו אימונוהיסטוכימיה או כתם immunofluorescence ללמוד ביטוי חלבון או שנקטפו עבור RNA ללמוד ביטוי גנים.המעבדה שלנו חוקרת כיצד רירית הרחם מגיבה לרמות הורמונים משתנות, אשר יכול להוביל היפרפלזיה רירית הרחם וסרטן. אנחנו יכולים להשתמש אורגנואידים אלה לטיפולים ארוכי טווח של הורמונים ולהוסיף תנאים פתולוגיים כגון עודף טסטוסטרון נמצא תסמונת השחלות הפוליציסטיות, או אותות מ adipocytes לחקור שינויים רירית הרחם הנגרמת על ידי השמנת יתר. רקמות אנושיות נחשבות לביו-האזרדיות, וחשוב לנקוט באמצעי זהירות מתאימים.

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידים אפיתליאליות החל מהשן האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה חזקה ומשקמים מחדש את תאי הגזע האפיתליאליים של השן, כולל יכולת התמיינות האמלובלסט שלהם. המודל האורגנואידי הייחודי מספק כלי מבטיח לחקר הביולוגיה הדנטלית האנושית (תאי גזע) עם פרספקטיבות לגישות התחדשות שיניים.

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.

יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

פרוטוקול זה מתאר הקמת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמה מתאי אפיתל ראשוניים של פני השחלות האנושיות (hOSE). הפרוטוקול כולל בידוד של hOSE מהשחלות הטריות שנאספו, הרחבה תאית של hOSE, הליכי הפשרה בהקפאה וגזירת אורגנואידים. Immunofluorescence, ניתוח כמותי, והצגת השירות כפלטפורמת סינון כלולים.

אורגנואידים אפיתל פני השטח של השחלות האנושיות כפלטפורמה לחקר התחדשות רקמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs), המייצרים אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. שיטה זו מקלה על מחקרי מבחנה של מחלות רירית הרחם, ומאפשרת עריכת גנים ומניפולציות תאיות אחרות.

יצירה ואפיון של אורגנואידים ברחם חולדה מתאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לקביעת ומניפולציה גנטית של אורגנידים צוואריים בצוואר הרחם האנושי.

יצירה ומניפולציה גנטית של אורגנידים צוואריים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

מידול התפתחות המוח האנושי נפגע עקב המורכבות חסרת התקדים של רקמת האפיתל העצבית. כאן מתוארת שיטה לייצור חזק של אורגנואידים במוח כדי לתאר אירועים מוקדמים של התפתחות המוח האנושי ולדגמן מיקרוצפליה במבחנה.

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

למד ליצור אורגנואידים אנושיים מרירית הרחם הכוללים תאים אפיתליאליים וסטרומליים לחקר תגובות הורמונליות ומנגנוני מחלה. שיטה זו מאפשרת בדיקת תרופות במודל פיזיולוגי רלוונטי.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

גלה סרטונים נוספים