פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

טכניקה זו יכולה לשמש ליצירת כדוריות תאים מסוגים בודדים ומרובים של תאים באמצעות פלטפורמת מעבדה על תקליטור, מערכת חלוצית לדור המהיר של כדוריות. הטכניקה משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי להפקיד תאים למיקרווולים ייעודיים, ומאפשרת התרומות מתמשך של סוגי תאים מרובים לייצור כדוריות מגוונות. עבור ייצור שבב תרבות CMS, תחילה להפוך תבניות פוליקרבונט עבור השכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות על ידי עיבוד שליטה מספרית במחשב.

הבא לערבב בסיס PDMS וסוכן ריפוי PDMS ביחס של 10 לאחד במשך חמש דקות לפני הצבת התערובת ב desiccator במשך שעה אחת כדי להסיר בועות אוויר. יוצקים את תערובת PDMS degassed לתוך תבניות שבב תרבות CMS, וממקמים את התבניות לתוך desiccator במשך שעה אחת נוספת כדי להסיר את כל בועות האוויר. בסוף degassing השני, לרפא את התערובת בתא חום ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפני הצבת השבבים בשואב פלזמה שואב עם המשטחים להיות מלוכדים מול למעלה.

חשוף את שבבי התרבות לפלזמה בסיוע אוויר בעוצמה של 18 וואט למשך 30 שניות, וקשר את שתי השכבות של השבב בתא החום ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להגדיל את עוצמת ההיתוך. לאחר מכן לעקר את שבב תרבות CMS autoclave ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להכין את התאים להיווצרות כדורית, להפשיר בקבוקון אחד מיליליטר המכיל חמש עד 10 פעמים 10 לחמשת התאים של עניין באמבט מים 36.5 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של DMEM לתאים עם ערבוב עדין.

לאחר מכן מוסיפים את התאים לצלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ המכילה 15 מיליליטר של מדיום 36.5 מעלות צלזיוס, ומ מניחים את המנה בחממה של תרבות התאים למשך 24 שעות. למחרת, החלף את העל-טבעי ב-15 מיליליטר של DMEM טרי, והחזר את התאים לחממה. כדי לנתק את התאים, ליצור את התרבות עם ארבעה מיליליטר של טריפסין במשך ארבע דקות ב 36.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לעצור את התגובה עם מדיום טרי כאשר התאים הרימו מתחתית המנה.

כדי לתייג את התאים, לחמם צבע פלואורסצנטי התא המתאים לטמפרטורת החדר לפני הוספת 20 microliters של דימתיל סולפוקסיד נטול מים לבקבוקון כדי להשיג פתרון מילימולרי אחד. מדללים את הפלואורסצנטיות לריכוז עבודה סופי של מיקרומולר אחד ב- DMEM, ומוסיפים את הצבע להשעיית התא המעניינים עם ערבוב עדין. לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור תרבות התא במשך 20 דקות.

עבור היווצרות כדורית מונוקולטורה, תחילה להוסיף 2.5 מיליליטר של 4%Pluronic F-127 פתרון חור inlet של שבב תרבות CMS תוך סיבוב השבב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה. לאחר הוספת כל הפתרון, סובב את השבב במהירות של 4,000 סיבובים בדקה למשך שלוש דקות באמצעות מערכת CMS. בסוף הסיבוב, הדגירה שבב התרבות לילה ב 36.5 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, להסיר את הפתרון הפלורוני, ולשטוף את שבב התרבות עם DMEM. לאחר ייבוש השבב במשך 12 שעות על ספסל נקי, מוסיפים 2.5 מיליליטר של המדיום ליציאת היציאה הקדמית, ומסובבים את השבב ב-4,000 סיבובים בדקה למשך שלוש דקות. בסוף הסיבוב, החלף 100 microliters של המדיום בנמל inlet עם 100 microliters של המתלה התא מוכן בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה.

לאחר מכן לסובב את השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות כדי ללכוד את התאים בכל microwell על ידי כוח צנטריפוגלי לפני הצבת השבב באינקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים, מרענן את המדיום כפי שהוכח כל יום. עבור הדור של coculture spheroid קונצנטרי, להוסיף את האוכלוסייה הראשונה של תאים ב 100 microliters של בינוני ליציאת התוך של השבב בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1, 000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות של סיבוב ב 3, 000 סיבובים לדקה. בסוף הסיבוב, להוסיף 100 microliters של אוכלוסיית התא השני בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה, ולסובב את השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות נוספות.

כאשר שני כרכים של תאים הוזרקו, למקם את השבב לתוך החממה תרבות התא ב 1, 000 כדי 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. עבור היווצרות spheroid יאנוס, להוסיף 100 microliters של האוכלוסייה הראשונה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1, 000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות ב 3, 000 סיבובים לדקה. בסוף הסיבוב, מניחים את השבב ב חממת תרבות התא לסיבוב ב 1, 000 עד 2, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש שעות.

בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של האוכלוסייה השנייה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה לפני סיבוב השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות. לאחר מכן מניחים את התאים ב חממת תרבות התא ב 1, 000 כדי 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. עבור היווצרות spheroid כריך, תחילה להוסיף 100 microliters של אוכלוסיית התא הראשון בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות של סיבוב ב 3, 000 סיבובים לדקה.

בסוף הסיבוב, מניחים את השבב על מסובב באינקובטור תרבות התא במשך שעתיים ב 1, 000 עד 2, 000 סיבובים לדקה לפני הוספת 100 microliters של האוכלוסייה השנייה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה. סובבו את השבב ב-3,000 סל"ד למשך שלוש דקות, והחזרו את השבב לאנקובטור לאגירה של שלוש שעות עם סיבוב. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטרים נוספים של אוכלוסיית התאים הראשונה בזמן השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה, ולסובב ולתרבת את התאים כפי שהוכח רק במשך 12 שעות.

בעקבות הפרוטוקול כפי שהוכח, שבב תרבות CMS בקוטר שישה סנטימטרים יכול להיות מפוברק בהצלחה. הערוץ של שבב התרבות CMS כולל יציאת יציאה, ואזורים מרכזיים, שקופיות ומיקרווולים. תמונות זמן לשגות של שני סוגים של תרבות התא נלקח ב 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 השעות הראשונות של תרבות בתוך שבבי CMS בודדים, כפי שהוכח, להראות היווצרות מוצלחת של כדוריות.

הדמיה של המיקרווולים לאחר שלושה ימים של תרבות מראה כי הספרואידים מפגינים אחידות וספיריות מצוינות. ניתן גם ליצור ספרואידים עם קוננטרי, יאנוס ומבני סנדוויץ'. בנוסף, תרבות תאים שנחשפו לכבידה גבוהה במשך שבעה ימים, ואחריה כתמים חיים /מתים, מראות שרוב התאים שורדים תרבות ארוכת טווח בתוך השבבים.

השכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות CMS צריכות להיות מיושרות בקפידה כאשר הן קשורות, אחרת מספר התאים בכל מיקרווול עשוי שלא להיות שווה. מחקר זה יכול להוריד את מחסום הכניסה למחקר ספרואיד coculture והוא יכול להיות בשימוש נרחב במחקרים coculture, למשל, לסינון תרופות חדשות של עניין.