Name: התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו פרוטוקול של תשעה ימים להתמרה והרחבה של תאי T מקופי רזוס לייצור תאים אימונותרפיים. השיטה מייצרת תאים עם פנוטיפ זיכרון מרכזי לטיפול ב-HIV ומחלות נגיפיות אחרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי NIH מענקים 5R01AI096966-06S1 (PS, EC, ו-EB), 1UM1AI26617 (PS, EC ו-EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN להגיע להעניק 5R01AI096966-03 (PS), 1UM1AI26617-01 (PS ו-EB), 1UM14126617 (PS ו-EC) כמו גם קרנות שסופקו על ידי חטיבת NIAID של מחקר הפנים והפנים NIH התוכנית ויראלית. Anti-CD3 ו-anti-CD28 בשימוש במחקרים אלה סופק על ידי משאב מגיב הפרימטים של NIH Nonhuman (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 בשימוש במחקרים אלה סופק על ידי מאגר Preclinical של NCI. אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו בפרוייקט CD4-mbl/CXCR5 הזה, ד ר. אליזבת ' קוניק באוניברסיטת אריזונה, ד ר. אדוארד ברגר ב niaid, NIH, ד ר. אווה G rakasz במרכז לחקר הפרימטים הלאומית של ויסקונסין וד ר ג'ף הארט וגברת פרייס הרן באוניברסיטת מינסוטה, ד ר לסלי kean בבית הספר לרפואה של הרווארד וד ר קתרין בולרד במכון ל אנחנו גם מודים ד ר סקוט McIvor באוניברסיטת מינסוטה, ד ר. כריסטופר פיטרסון בבית פרד האצ סרטן המרכז, ד ר מתיו Trivett ב-NIH, ד ר. לזניה טרביטביוט בבית החולים סיאטל ילדים, וד ר קונרד ראסל קרוז במכון לחקר הילדים על הסיוע המועיל שלהם באופטימיזציה של פרוטוקול זה אנו מכירים גם את מיס צ'י פאן וגברת ג'ומארי אלגריה-Berrocal באוניברסיטת מינסוטה לייצור מוצרים ויראליות, וגברת קים וייגראו באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון לבידוד רזוס מקוק.

<ol><li>Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+gene-engineered+T+cell+immunotherapy+for+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic T cell engineering.</a> Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).</li>
<li>Kuhlmann, A., Peterson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+approaches+to+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).</li>
<li>Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+chimeric+antigen+receptors+targeting+the+CD4+binding+site+and+high-mannose+Glycans+of+gp120+optimized+for+anti-human+immunodeficiency+virus+potency+and+breadth+with+minimal+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity.</a> Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).</li>
<li>Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+Follicles+Are+Sites+of+Heightened+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+%28HIV-1%29+Replication+and+Reduced+Antiretroviral+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).</li>
<li>Connick, E., Mattila, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Fail+to+Accumulate+at+Sites+of+HIV-1+Replication+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).</li>
<li>Connick, E., Folkvord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Simian+Immunodeficiency+Virus+Replication+within+Secondary+Lymphoid+Tissues+of+Rhesus+Macaques+Is+Linked+to+Disease+Stage+and+Inversely+Related+to+Localization+of+Virus-Specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL.</a> The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).</li>
<li>Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus+%28SIV%29-specific+chimeric+antigen+receptor-T+cells+engineered+to+target+B+cell+follicles+and+suppress+SIV+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication.</a> Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).</li>
<li>Ayala, V. I., Deleage, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR5-Dependent+Entry+of+CD8+T+Cells+into+Rhesus+Macaque+B-Cell+Follicles+Achieved+through+T-Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering.</a> Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).</li>
<li>Redeker, A., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+adoptive+T+cell+therapy%3A+The+particular+role+of+T+cell+costimulation%2C+cytokines%2C+and+post-transfer+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination.</a> Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).</li>
<li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+Through+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Sorting Through Subsets.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li>
<li>Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Central+and+Effector+Memory-Derived+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T+Cell+Clones+in+Rhesus+Macaques+during+Acute+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection.</a> The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).</li>
<li>Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking%2C+persistence%2C+and+activation+state+of+adoptively+transferred+allogeneic+and+autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+clones+during+acute+and+chronic+infection+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).</li>
<li>Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapies+for+HIV+%3A+Preclinical+successes+and+current+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies.</a> Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).</li>
<li>Chambers, C. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+regulation+of+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Costimulatory regulation of T cell function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).</li>
<li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+for+T+lymphocyte+clonal+anergy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.</a> Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).</li>
<li>Bajgain, P., Mucharla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+M+series%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015(2014).</li>
<li>Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transduction+and+expansion+of+transduced+T+cells+with+maintenance+of+central+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).</li>
<li>Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>Berger, C., Sommermeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+targeting+ROR1+in+primates+with+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).</li>
</ol>

ד ר פמלה סקינר היא המייסד המשותף והקצין המדעי הראשי של מארפם פרמה.

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיית הפקה תא T לטיפול אשר מנצל וקטור gammar, כדי לשנות את רזוס מקוק PBMC המוביל לאוכלוסיית תא T המבטא רכב אנטי ויראלי, כמו גם את הזקיקים קולטן ביות, CXCR5. עם סך של 8 ימים של התרבות vivo ex הזמן, קיימא, פונקציונלי מכונית T מיוצרים בכמות שהיא בתוך טווח שפורסם10,21, 22 משמש22 לעירוי לתוך פרימטים אנושיים עבור בדיקות יעילות טרום קלינית.
ההצלחה של פרוטוקול התמרה מסתמך הן בריאים, מגורה PBMCs ועל ההכנות איכות של וירוס gammar,. כדי להשיג גירוי והתמרה מוצלחת, חיוני שטיפול נאות יילקח בהקפאה ובהובלה של PBMCs לאחר האיסוף. באופן אידיאלי, אם התאים נאספים מחוץ לאתר, הם נשלחים בחנקן נוזלי וממוקמים במהירות באחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך. PBMCs חייב להיות פעיל באופן מיאוסטי כדי להיות מושפע בהצלחה על ידי וירוס gammar,. אחד צריך לפקח באופן חזותי עבור האשכולות של התאים לאחר גירוי עם אנטי CD3/anti-CD28. כשל בהפעלה כהלכה יגרום ליעילות נמוכה של התמרה. חשוב גם לעקוב אחר הכדאיות בתאים מגורה. הכדאיות המסכנה לאחר שלב הגירוי מובילה בדרך כלל להתמרה פחות מוצלחת. אם ההכנות וירוס מיוצרים במעבדה או מיקור חוץ, הם צריכים להיות מאוחסנים ב-80 ° c בשימוש יחיד ali, כדי למנוע הקפאת מחזורי הפשרה כי יכול לפגוע בווירוס ולפגוע התמרה יעילות. הווירוס חייב להיות מבוקר כך כמויות עקביות של וירוס ניתן להשתמש בכל ניסוי. בעת שימוש בווירוס לצורך התמרה, הפשרת הווירוס במהירות והחנות על הקרח עד הצורך. הבחירה של היזם, משפר ומעטפות חלבונים עלולים להשפיע על יעילות התמרה וביטוי של הטרנסגנים בתאי היעד. לפיכך, יש לקבוע באופן אמפירי את משרד הבית. בנוסף, השימוש במדיה המיועדת לתמוך בתאי T ובלוחות עם בארות חדירות גז להתרחבות הובילו להתרחבות מעולה של תאי התמרה. עם זאת, קיימת בעלי חיים לשונות בעלי חיים בקצב ההרחבה של התא. אנו ממליצים על מחקר ניסיון כדי לקבוע את היכולת של הכנה תא מסוים להיות התמרה והרחבה. רמות הרחבה הן עקביות בהתמרה בקנה מידה קטן וגדול.
עם השימוש בפרוטוקול זה, הופקו עד 2.5 x 109 תאים לעירוי לתוך בדיקת חיות. למרות שמצאנו את זה מיותר לשנות את הפרוטוקול בשלב זה, השימוש 6 טוב לוחות הוא מגבלה על הכנת התא בקנה מידה גדול הפרוטוקול ידרוש שינוי כדי לייצר מספר גדול יותר של תאים. דוגמאות של שינויים פוטנציאליים כוללים ביצוע התמרה של שקית התרבות מצופה fibronectin כדי להגדיל את מספר התאים המותמרים ולהשתמש בכלי קיבול גז חדיר גדול יותר לשלב ההתרחבות. למרות שעדיין לא עשינו שינויים אלה, הם מנצלים מוצרים זמינים מסחרית ושינויים אפשריים לפרוטוקול הנוכחי.
באמצעות שיטה זו, יש לנו הפיק תאי התמרה מ-PBMC מבודדים בעלי חיים נגועים, סיב בעלי חיים נגועים בעלי בעלי חיים שנדבקו סיב מטופלים עם טיפול תרופתי (אמנות). עם זאת, אנו ציינו ירידה ביעילות התמרה בתאים שטופלו באמנות20. הפחתה זו נובעת ככל הנראה בשל העיכוב של היפוך הטרנסקריפטאז ו/או שילובי התרופות. התמרה של התאים מבעלי חיים שטופלו באמנות ידרוש שינויים בפרוטוקול זה, כגון הפחתת רמות תאיים של תרופות אמנות על ידי עצירת אמנות במשך מספר ימים לפני איסוף PBMC או באמצעות וקטור חלופי אשר אינו מושפע התרופות האמנות בדרך כלל בשימוש.
חשוב כי תאים המיוצרים עבור טיפול חיסוני להיות של פנוטיפ הבדיל מינימלית, כך שהם ממשיכות post-אינפוזיה12. למרות פרוטוקולים רבים עבור העברה המאמצת של תאים דורשים פעמים תרבות ארוכה, הזמן הvivo לשעבר התרבות הקטנה כבר בקורלציה עם הפחתת בידול ושיפור בתפקוד תא T רכב13. פרק הזמן המהיר יחסית של התמרה זו ופרוטוקול הרחבה מאפשר תחזוקה של הזיכרון המרכזי הרצוי הזכרון תוך שהוא עדיין מייצר תאים מספיקים לבדיקת הפוטנציאל החיסוני שלהם20.
המטרה של אסטרטגיית הייצור עבור מוצר זה חיסוני תא T היא לייצר תאים T שיזהו תאים נגועים סיב, התנועה לאתר של שכפול נגיפי ב זקיק התא B ו יהיה להתמיד בבעלי חיים וכתוצאה מכך לטווח ארוך תרופה פונקציונלית ללא צורך בתרופות אנטי-retroviral. לתרגום מוצר חיסוני האדם, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לשנות את התאים האנושיים T באמצעות השימוש בנוגדנים ספציפיים לאדם, ציטוקינים ויישום של תקני GMP עם המטרה האולטימטיבית של הפקת תרופה פונקציונלית עבור HIV.

חיסוני הסלולר מתגלים כאמצעי חדש לטיפול במחלות כולל סרטן ומחלות זיהומיות. שיטות הטיפול החיסוני מעורבות בדרך כלל בתאים טיפוליים לבטא מולקולות ספציפיות. לדוגמה, כימאריק קולטן אנטיגן (רכב) תאים T מתוכננים לבטא מולקולה רכב כי יש תחום החילוץ כי נקשר במיוחד מולקולות על תאים חולים ומתחם איתות המפעיל את התאים החיסוניים להרוג את התא החולה. תאי T מכונית נמצאים בשימוש בהצלחה חיסוני סרטן, והיה יעיל במיוחד בטיפול B תא לוקמיה1,2,3. מכונית-T תאים גם מפותחים לטיפול בזיהומים נגיפי כגון HIV. HIV ספציפי מכוניות למקד את החלבונים המעטפה על פני השטח של תאים נגועים באופן ויראלי4. תאים אימונותרפיה יכולים גם להיות מהונדסים לבטא מולקולות ביות למקד את התאים הטיפוליים למיקומים רקמות ספציפיות. פיתחנו וקטורים כי מעביר הן מכונית ספציפית וירוס, כמו גם הלימפה זקיק מולקולה CXCR55.
שכפול נגיפי של וירוסים מסוימים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וירוס הכשל החיסוני קופיים (סיב), מרוכז ב-B זקיקי תאים ברקמות הלימפה המשני6. ב-זקיקי התאים הם אתרים מיוחסים במקצת, בהם רמות נמוכות של וירוסים ספציפיים לאישור CTL שכפול ויראלי מתמשך7,8. מסיבות אלה, מיקוד התאים HIV/סיב ספציפי T לתוך זקיק דרך הביטוי של CXCR5 היא אסטרטגיה חיסול של מאגר הזקיקים של תאים נגועים virally9,10. באופן ספציפי, אנו מיקוד התאים הספציפיים סיב מכונית T אל זקיקי התא באמצעות CXCR5 הביטוי המשותף.
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לשנות את המכונית/CXCR5 ולהרחיב PBMCs לייצר תאים מכונית/CXCR5 T של כמויות מספיקות אינפוזיה טיפולית. תאים שעברו התמרה עם שיטות אלה לשמור על הזיכרון המרכזי הפנוטיפים. מחקרים הראו כי תאים עם פנוטיפ פחות הבדיל, כגון הזיכרון המרכזי t תאים ותאי גזע t זיכרון להתמיד יותר מאשר תאים הבדיל יותר11,12. בנוסף, פרוטוקולים רבים שנועדו לייצר תאים שהועברו מאומצים יש זמן רב יחסית בתרבות כי התוצאה בתאים שיש להם פנוטיפ הבדיל יותר והתמדה מופחתת13. יתר על כן, תאים שהועברו מאמצים עם זמני תרבות ארוכים שהצטברו בתוך הריאות במקום רקמות14הלימפה היעד ב רזוסמקוק 14,15. בשיטות שאנו מתארים ולהדגים כאן, אנו מרחיבים במהירות ולהרחיב PBMCs רזוס מקוק לייצר תאי T מתתמרים לשמור על הזיכרון המרכזי הזיכרונות.
גם תאי CD4 ו-CD8 T נכללים בגישת החיסוני שלנו. זה האוכלוסייה תא מעורב נבחר כי, בניסויים קליניים, העדר CD4 + T תאים במוצר תא CD8 + T היה מתואם עם כישלון של תאים CD8 T מעורבב כדי להמשיך 16. השיטות המתוארות כאן מתחילות בהפעלת pbmcs עם נוגדנים anti-CD3 ו anti-CD28 אשר לעורר בסיפוק את הקולטן התא T ולספק אות שיתוף מגרה כדי למנוע שבטיים anergy17,18.
לאחר ההפעלה, תאים מותמרים עם קידוד וקטורי של gammaretroviral מכונית ספציפית וירוס ואת המולקולה הלימפה CXCR5. תאי התמרה מורחבת לאחר מכן באמצעות צלחות שנועדו עבור הפצת תאים שאינם חסיד אשר יש קרום חדיר גז בבסיס. קרום זה מתיר החלפת גז בתחתית הבאר המובילה הישרדות התא משופר זמינות מזינים19. באמצעות שיטות אלה, ניתן לייצר תאים פונקציונליים מספיקים בפרק זמן של 9 ימים במחקרים vivo אינפוזיה. למרות שפרוטוקול זה מיועד לצורך התמרה והרחבה של תאי מקוק רזוס, עם שינוי קל של נוגדנים מסוג מינים ספציפיים, ניתן להשתמש בו עם תאים ממינים אחרים. שיטות אלה מבוססות על מחקרים שפורסמו בעבר9,20.

<table><tbody><tr><td><חזק>הכנת גמארטרו-וירוס</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.025% טריפסין, 0.01% EDTA</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>293T תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>6 צלחות באר, מטופל</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hyclone מומת חום</td><td></td><td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td>מדיה מופחתת בסרום</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>מתנה מד"ר פטריק סלמון</td></tr><tr><td>pMSGV1 המכילה הזמנה מותאמת אישית של CAR P2A CXCR5</td><td>מ-GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RD114</td><td></td><td></td><td>מתנה מד"ר אד ברגר</td></tr><tr><td>צלוחיות T75</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td></td><td>pMD.G</td><td>מתנה מד"ר סקוט מקייבור</td></tr> <tr><td><גירוי תאי T חזק<> / חזק ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 צלחות באר, לא מטופל</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>NHP Reagent Resource</td><td>שיבוט: CD28.2</td><td></td></tr><tr><td>מגיב CD3 NHP נגד מקוק</td><td> שיבוט משאבים</td><td>: FN18</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>מקוק רזוס PBMC או CD8 תאי T</td><td>WNPRC</td><td></td><td>תאים ראשוניים</td></tr> <tr><td><חזקים>לציפוי פיברונקטין </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 צלחות באר, לא מטופל</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Fraction V)</td> <td>HyClone</td><td>SH 30574.02</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>TaKaRa</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td><חזק>להרחבת תאי T</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6 צלחת באר</td><td>Wilson Wolf</td><td>P/N 80240M</td><td>צלחות עם בארות חדירות לגז</td></tr><tr><td><חזק>רכיבי מדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>NCI Preclinical Repository</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 medium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>וריאציות של מדיה בשימוש</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום בסיסי: </td><td>X-Vivo 15 בינוני, 10% FBS מומת בחום, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרחבה:</td> <td>מדיום גידול + 50 מ"מ b מרקפטואתנול</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול:</td> <td>מדיום בסיסי + 50 יחב"ל/מ"ל IL-2</td><td></td><td>השלמת המדיה על ידי הוספת אנטי-CD28, IL-2 או b-מרקפטואתנול צריכה להתרחש ביום השימוש.</td></tr><tr><td><ספירת תאים חזקה></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי ספירת תאים רוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול, תמיסה 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr> <tr><td><ציטומטריית זרימה חזקה></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג נוגדנים Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A20186</td><td>לצימוד נוגדנים MBL</td></tr><tr><td>אנטי-CD28-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 562976-CD3-AF700 <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td> 557917-anti-CD4-FITC <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td> 556615-anti-CD8-BV788 <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td> 563824-anti-CD95-PerCP <td></td></tr><tr><td> Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>561655</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CXCR5-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1985-42</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-MBL</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-40145-S6</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח זרימה</td><td>FlowJo, LLC</td><td>FlowJo v10</td><td></td></tr><tr><td>זרימה ציטומטר</td><td>בקמן</td><td>CytoFlex</td><td></td></tr><tr><td>חי/מת ליד IR</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerosolve מיכלים להכיל דליפת אירוסול</td><td>בקמן</td><td>SX4750</td><td>ציוד בטיחות</td></tr><tr><td>בקמן אלגרה צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>סטרילגארד e3</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>תרמו פישר</td><td>Everlast 247</td><td></td></tr><tr><td>Class II קולט אדים זרימה למינארי</td><td>בייקר</td><td>הרסל ויוס 160i</td><td></td></tr><tr><td>מעיל מעבדה חד פעמי בטוח במיוחד</td><td>Fisher Scientific</td><td>359232</td><td>ציוד מגן אישי</td></tr><tr><td>מנשאי Microplate עם כיסויים ביו-מוסמכים</td><td>בקמן</td><td>SX4750A</td><td>ציוד בטיחות</td></tr><tr><td>פלטפורמת נדנדה</td><td>Benchmark</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>רוטור דלי מתנדנד</td><td>Beckman</td><td>X13-R</td><td></td></tr><tr><td>X-Gen כפפות ניטריל</td><td>Genesee</td><td></td><td>ציוד הגנה אישי</td></tr></tbody></table>

התמרה והרחבה של תאי t ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

חיסוני המתעוררים לטיפול במחלות זיהומיות וסרטן לעתים קרובות כרוך התמרה של אוכלוסיות סלולריות עם גנים קידוד מחלות מיקוד החלבונים. לדוגמה, כצ קולטן אנטיגן (רכב)-T תאים לטיפול בסרטן וזיהומים נגיפי כרוך התמרה של תאים T עם גנים סינתטיים קידוד מולקולות רכב. מולקולות רכב להפוך את התאים T במיוחד לזהות ולהרוג סרטן או תאים נגועים virally. תאים יכולים גם להיות מהתמרה משותפת עם גנים אחרים של עניין. לדוגמה, תאים יכולים להיות משותפים עם גנים קידוד חלבונים היעד תאים למיקומים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשנות את הדם ההיקפי העיקרי תאים מוננונקה (PBMCs) עם גנים קידוד מכונית ספציפית וירוס ו תא B זקיק מולקולה מולקולת כימוקין סוג 5 (CXCR5). הליך זה לוקח תשעה ימים ותוצאות התמרה אוכלוסיות תא T לשמור על הזיכרון המרכזי הפנוטיפ. תחזוקה של זיכרון מרכזי או פנוטיפ פחות מובחנים הוכחו לשיוך להתמדה של תאים שלאחר העירוי. יתר על כן, תאים המיוצרים עם שיטה זו להראות רמות גבוהות של יכולת הכדאיות, רמות גבוהות של ביטוי שיתוף של שני גנים התמרה, וכמויות גדולות מספיק של תאים עירוי חיסוני. פרוטוקול זה בן תשעה ימים עשוי לשמש בהרחבה עבור תא CAR-T וגישות אחרות לחיסוני תא T. השיטות המתוארות כאן מבוססות על מחקרים שהוצגו בפרסומים הקודמים שלנו.

ייצור תאים התוצאות המוצגות בפרסום זה דומות לאלה שבעבודתנו הקודמת שפורסמה בשנת9,20. ניצול הפרוטוקול המוצג כאן, אנו מצפים לפחות 8-קיפול הרחבה של תאים בין ימים 5 ו 9 (חציון 11.1 קיפול, טווח 8.7 – 13 קיפול). חדירות גז בארות שופרה בצפיפות התחלתי של 5 x 106 תאים ואחרי 4 ימים של צמיחה, השגנו צפיפות חציון של 55.6 x 106 תאים לכל באר (טווח 43.5 – 64.8 x 106) (איור 1א). ספירת תאים עם הדרה טרילון כחול מראה כי התאים לשמור על הכדאיות גבוהה ברחבי הפרוטוקול (יום 9 החציוני 85.8%, טווח 83 – 95%) (איור 1B). אנו מוצאים בעלי חיים לשונות בעלי חיים ביכולתם של התאים להתרחב; עם זאת, עם האוכלוסייה ההתחלתית של 50-100 x 106 תאים ביום 1, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לייצר מספיק תאים עבור עירוי רזוס מקוק של 1 – 2 x 108 תאים/ק"ג.
ביטוי משותף של הגנים המותמרים היה במעקב עם הזרימה cy, (איור 2א). ביטוי של המכונית וCXCR5 על פני התאים המותמרים היה יציב יחסית בין הימים 5 ו -9 של פרוטוקול זה הרחבה. ביום 5, חציון של 42.8% (טווח 36.5 – 46.9%) של התאים היו מותמרים עם CD4-MBL רכב ו CXCR5 ואילו ביום 9, הביטוי החציוני היה 47.6% (טווח 44.5 – 64.5%) בסיבוב אחד של התמרה (איור 2ב'). למרות שפרוטוקולים מסוימים מתקשרים לסיבוב נוסף של התמרה, לא ראינו תועלת במונחים של תאי התמרה מוחלטת בסיום הפרוטוקול (הנתונים אינם מוצגים).
פנוטייפ תאי התמרה נותחו על ידי מיכלי הזרימה. לפני התמרה והתרחבות, נאיבי, זיכרון מרכזי ואוכלוסיית הזיכרון של אפקטור מזוהים (הנתונים אינם מוצגים) אך האוכלוסייה התמימה אובדת באמצעות התאים, ובראשם בעיקר תאי זיכרון מרכזיים לפי יום 5 (איור 3A) ויום 9 (איור 3ב) כפי שזוהה על-ידי CD95+ CD28+ ביטוי. שימוש זה התמרה מהירה ופרוטוקול הרחבה הפיק תאים אשר בעיקר בתאי זיכרון מרכזי וכך יהיה סיכוי גבוה יותר להתרבות ולהימשך כאשר החדרת לתוך בעל חיים בדיקה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig01.jpg"> איור 1: התמרה ופרוטוקול ההרחבה מייצרת תאי התמרה שופע הנמצאים בעלי קיימא מאוד. (א) התרחבות התאים המתמרים מ -6 בעלי חיים שונים מימים 5 עד 9 בכלי קיבול הגזBויכולת הכדאיות של ה-pbmc המחלחל מ-6 בעלי חיים. הדרה של טרילון כחול באמצעות מונה תאים אוטומטי שימש לניטור מספר התאים והכדאיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig02.jpg"> איור 2: פרוטוקול התמרה מפיק תאים השומרים על ביטוי משותף של שני הגנים המותמרים. (א) מגרש זרימה ייצוגית של רזוס pbmc ביום 9 של התמרה ופרוטוקול הרחבה להפגין ביטוי הן CD4-MBL המכונית ו CXCR5. (ב) ביטוי של CD4-MBL המכונית ו CXCR5 על התמרה רזוס pbmc מתוך 6 בעלי חיים שונים בימים 5 ו 9 בתרבות כפי שנמדד על-ידי cy try זרימה. גייטס הוגדרו על CD3+ תאים בשידור חי. התמרה תאים שזוהו כ-MBL+ CXCR5+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig03.jpg"> איור 3: רוב התאים המיוצרים בפרוטוקול 9-יום יש מרכזי זיכרון פנוטיפ. זרם הנציג cy,לנסותחלקות של (א) יום 5 ו (ב) יום 9 מכונית/CXCR5 התמרה רזוס pbmc. גייטס הוגדרו על חיים, CD3+, CD8+ תאים. הזיכרון המרכזי הוגדר כ-CD28+ CD95+. הזיכרון של אפקטור הוגדר כ-CD28, CD95+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מתארים פרוטוקול של 9 ימים עבור התמרה והתרחבות של דם היקפי רזוס מקוק תאים מונמוננקה שתשואות תאים עם ביטוי מעולה של הגנים של העניין במספר מספיק עבור מחקרי אינפוזיה של יעילות התא.

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תאי T-t של רזוס אימונותרפי המבטאים שני חלבונים: קולטן אנטיגן כימרי אנטי ויראלי קולטן כימוקין CXCR5 כי תאים היעד זקיקי הלימפה. הליך מהיר יחסית זה בן תשעת הימים מייצר תאי T עם פנוטיפ זיכרון מרכזי פחות מובחן עם פוטנציאל להתמדה ארוכת טווח לאחר עירוי לבעלי חיים. התאמת שיטה זו לתאים אנושיים תאפשר ייצור של תאי T אימונותרפיים עם פוטנציאל לגרום הפוגה עמידה ל- HIV ללא מתן תרופות אנטי-רטרו-ויראליות.שיטה זו יכולה לשמש באופן נרחב כדי לייצר רזוס T-תאים המביעים חלבונים אחרים של עניין. ועם שינויים קלים, זה יכול לשמש כדי ליצור תאי T מתומרים במינים אחרים כולל בני אדם. הצלחת ההתמרה תלויה ב-PBMCs מגורים בריאים.יש לדאוג לאיסוף, הובלה ואחסון. לפני ההעתקה, חשוב להעריך חזותית את הגירוי של התאים. התחל על-ידי הפשרת מחשבי רזוס ראשיים.הדגירה את התאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד רק כמות קטנה של קרח נשאר. בעדינות pipette התאים לתוך צינור חרוט. לאחר מכן לשטוף את הבקבוקון עם מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לאט להוסיף אותו לתאים.לאט לאט להוסיף תשעה מיליליטר נוספים של מדיום בסיסי חם לתאים. מניחים את הצינור במיכל עמיד בתרסיס וצנטריפוגה אותו ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 22 מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בכמות קטנה של מדיום צמיחה.כדי לספור את התאים, להוסיף 10 microliters של תאים 10 microliters של כחול טריפאן. טען את שקופית התא והוסף אותה לדלפק. לחץ על לחצן הלכידה כדי לספור את התאים.לחשב את המספר הכולל של תאים על ידי הכפלת ריכוז התאים לפי נפח לדלל אותם לשני מיליון תאים למיליליטר במדיום הצמיחה. הוסף אנטי CD28 לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. ואז פיפטה שלושה עד שישה מיליון תאים לתוך צלחות מצופות אנטי CD3.דגירה הצלחות במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מחממים צנטריפוגה ל 32 מעלות צלזיוס על ידי הפעלתו ב 2, 000 פעמים g במשך כ 30 דקות. בינתיים, חם הן ללא סרום והן מדיה צמיחה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר את הנגיף עם מערבולת עדינה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.ואז למקם אותו על קרח. לדלל את הנגיף לריבוי אופטימלי קבוע מראש של זיהום במדיום ללא סרום. הוסף שני מיליליטר של רטרווירוס מדולל לכל באר של צלחת מצופה fibronectin באמצעות מדיה לבד עבור תאי הבקרה השליליים.מניחים את הצלחות בצנטריפוגה מראש במנשאי מיקרופלאט וצנטריפוגה אותם ב 2,000 פעמים g במשך שעתיים. אם משתמשים מיד, שאפו את הכנת הנגיף מה בארות והוסיפו שני מיליליטר של מדיום צמיחה. בדוק את המחשבים הממריצים תחת מיקרוסקופ הפוך.התאים צריכים להיות עגולים, בהירים, והם צריכים לנטרל אור. הם צריכים גם מראה מגושם המציין גירוי. לאסוף את תאי היעד ולהעביר אותם לצינור חרוט 50 מיליליטר.לשטוף כל טוב פעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה ולהוסיף את זה לצינור. לאחר מכן ספור את התאים כפי שהודגם קודם לכן. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 32 מעלות צלזיוס.שאף את התקשורת מהכדור והתן מחדש את התאים במדיום הצמיחה בריכוז של 1.5 מיליון תאים למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא לכל היטב מצופה וירוס ולהוסיף MAC להתמר תאים בארות מצופה fibronectin שלא קיבל וירוס. צנטריפוגה הצלחות ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 32 מעלות צלזיוס ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.עבודה עם תאי רזוס ורטרווירוסים גמא דורשת שימוש בציוד מגן אישי כגון חלוקי מעבדה וכפפות והעבודה חייבת להתבצע בארון ביו-בטיחותי. יש לפענח את כל הפיפטות והפתרונות. פיפטה התוכן של כל באר למעלה ולמטה עם פיפטה חמישה מיליליטר כדי להשתמש שוב את התאים ולהעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר תאים חסידים. לאחר מכן ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה התאים ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים במדיה התפשטות לריכוז של מיליון תאים למיליליטר. זרע חמישה מיליליטר של תאים לתוך כל גז חדיר היטב של צלחת שש בארות בזהירות שכבה נוספת 25 מיליליטר של מדיה הרחבה ל הבאר. ואז להידגר התאים באין מפריע ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים.כדי לאסוף את התאים מן בארות, להסיר ולהשליך 20 מיליליטר של התקשורת דואג לא להפריע לתאים. פיפטה המדיה הנותרת למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. השתמש פיפטה העברה סטרילית לשטוף כל באר עם שלושה מיליליטר של מדיה ולאסוף את התאים שיורית.לאחר מכן ספור אותם כדי לבדוק אם קיימים מספר תא וכדאיות. פרוטוקול זה שימש להעתקה והרחבה של תאים משש חיות שונות. בארות חדירות גז נזרעו בצפיפות התחלתית של חמישה מיליון תאים ולאחר ארבעה ימים של צמיחה, הושגה צפיפות חציונית של 55.6 מיליון תאים ל באר.הכדאיות של התאים המנוטרים על ידי אי הכללה כחולה trypan נשמרה ב 83 עד 95% לאורך כל הפרוטוקול. ציטומטריית זרימה שימשה להתבוננות בביטוי שותף של הגנים שהתומרו. ביום החמישי, חציון של 42.8% מהתאים הותמר הן עם CD4-MBL CAR והן עם CXCR5.בעוד שביום התשיעי, הביטוי החציוני היה 47.6% עם סבב יחיד של ההעתקה. ציטומטריית זרימה שימשה גם לניטור פנוטיפ זיכרון. לפני התמורה וההתפשטות זוהו אוכלוסיות זיכרון מרכזיות נאיביות וזיכרון משפיע.האוכלוסייה הנאיבית אבדה עם culturing והתאים היו בעיקר תאי זיכרון מרכזיים ביום החמישי והיום התשיעי. ההצלחה בהעתקה תלויה בשימוש בריאגנטים באיכות גבוהה, תאים בני קיימא מאוד ווירוסים ציטרציה, כמו גם באופן עקבי בעקבות העיתוי של הפרוטוקול. התאים יכולים לשמש עבור בדיקות תפקודיות כולל הגירה ודיכוי ויראלי בדיקות, כמו גם עירוי לתוך בעלי חיים למחקרים פרה-קליניים כדי לבדוק את היעילות של האימונותרפיה.התקדמנו עם בדיקות פרה-קליניות של תאי T CAR ו- CXCR5 בבעלי חיים ומקווים לבדוק בקרוב את האימונותרפיה הזו אצל אנשים נגועים ב- HIV.

transduction-expansion-primary-t-cells-nine-days-with-maintenance

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובה חיסונית לאורך זמן בתוך העכבר זאת, בלוטות הלימפה ניתן להסיר ברצף על ידי ניתוח. כאן, אנו מתארים כיצד טכניקה זו ניתן לבצע.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

הדור של לימפוציטים T מ המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים נותן גישה חלופית של שימוש בתאי גזע עובריים על חיסוני מבוססי תאים T. השיטה מלמדת כי על ידי ניצול...

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול להפעלת תאי T ראשוניים אנושיים. הדגירה של תאי T נאיביים עם חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, ולאחר מכן טיפול באינטרלוקין-2 או אינטרלוקין-15, מובילה להפעלת תאי T נאיביים ולהתמיינותם והתפשטותם לתאי T משפיעים או זיכרון.

תרבית תאי T פעילים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T...

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי לבידוד ושיבוט של ישות תאי T הנדירה של תאי T Vδ1+CD4+ היקפיים, שהיא, כפי שהראינו לאחרונה, אב תאי T αβ חוץ-תימיים. טכניקה זו מאפשרת לבודד כמותי, לשכפל ולהרחיב ביעילות תאים אלה בתרבית ex vivo.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

מערכות ניסיוניות רבות כבר נוצלו כדי להבין את המנגנונים המסדירים פיתוח תאי T ולתפקד תגובה חיסונית. הנה גישה גנטית באמצעות תמרת retroviral מתוארת, אשר היא כלכלי, זמן יעיל, והכי חשוב, מאוד אינפורמטיבי בזיהוי מסלולים רגולטוריים.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לגידול תאי T ראשוניים, כולל בידדם, הפעלה, התרחבותם וטרנספקציה חולפת באמצעות אלקטרופורציה של mRNA. בנוסף, מוצע תהליך עבודה ופאנל נוגדנים לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ, סמני הפעלה, כדאיות וביטוי קולטני אנטיגן כימרי (CAR).

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

למדו פרוטוקול של תשעה ימים להתמרה והרחבה של תאי T מקופי רזוס לייצור תאים אימונותרפיים. השיטה מייצרת תאים עם פנוטיפ זיכרון מרכזי לטיפול ב-HIV ומחלות נגיפיות אחרות.

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

גלה סרטונים נוספים