Name: חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למד שיטת השתלה של תאי אפיתל בלוטות החלב בעכברושים לתוך משטח השומן הלבן הבין-כתפי. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות תאים מול מארח בסרטן השד ללא צורך בניקוי מוקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי המרכז לסרטן הולנגס של סרטן המרכז תמיכה גרנט P30 CA138313 מחקר הטייס מימון המכון הלאומי לבריאות (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>), וכספים מן המחלקה לפתולוגיה &Amp; מעבדה רפואה באוניברסיטת הרפואה של דרום קרוליינה. היינו רוצים להודות למרינה סמית. על שהקליט את הצהרות הראיון

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השתלת תאים אפיתל הפטמות האופטימיזציה לעבודה עם חולדות. מבודדים האפיתל הפטמות מבונואידים של חולדות תורם (3-5 שבועות של גיל) הם מושתלים לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות הנמען (גם 3-5 שבועות של גיל). ניתן לפרש את התוצאות במעט כמו 4-6 שבועות מאוחר יותר, תוך שימוש במיקרוסקופיה קלה לבדיקת הרקמה המחחטת; עם זאת, יש לקבוע את כמות הזמן המיטבית בין השתלת והקרבה לפני יישום הניסוי המלא. אם קצת יותר מדי זמן או יותר מדי חלף, התוצאות לא יהיו מתרגם שולחן או משמעות. כדי לייעל את הפרוטוקול, לנתח את הצמיחה בקבוצה ק...

התפתחות בלוטת החלב פוסט לידה ו ductal מורגנזה הם תהליכים המושפעים במידה רבה על ידי איתות הורמונלי בתחילת ההתבגרות. בעכברים וחולדות, בשימוש נפוץ במודלים של ביולוגיה של בלוטת החלב, תהליך זה מתחיל בסביבות 3 שבועות של גיל, שבו התפשטות מהירה ובידול התוצאה היווצרות של המבנה הבוגר. בלוטת החלב הבוגרת יכולה לעבור סבבים רבים של התרחבות ואינוולוציה, נכס שנחקר מאז תחילת המאהה -20. במסגרת ההקשר של היפרהפצה והתפתחות הסרטן, פותחו טכניקות השתלת בלוטת החלב בשנות ה-50 שלהמאה העשרים,והופרו על ידי המתודולוגיה הכמותית שתרמה גולד ואח '. ב-19772,3,4. עידון של טכניקת ההשתלה אצל מכרסמים תרם להתקדמות מרכזית בהבנת ביולוגיה רגילה של בלוטת החלב, כי הם עדיין בשימוש נרחב כדי ללמוד את ההשפעה של טיפולים שונים מניפולציה גנטית על פיתוח בלוטת החלב רגילה ומצבי מחלה.
השערות רבות נוצרו ונבדק לאחר מכן באמצעות השתלת בלוטת החלב, שתוארה לראשונה על ידי DeOme et al. ב 19591. ניסויים בכמה עשורים הראו את הנטייה של רקמת דוטל שנתרמה מבלוטות החלב של התורמים כדי לאכלס מראש את כל משטח השומן5,6,7 והצביע על כך שרכיב קריטי בהתפתחות בלוטת החלב שוכן במבני אפיתל אלה. מחקרים מאוחרים יותר בעכברים הראו כי תא גזע בודד יכול לאכלס משטח שומן נקי ותרם לגילוי של מעשה יחיד, משותף של התאים האפיתל הבליים והלומיאל של חלבשמונה,9,10. בשורה עם מסקנות אלה, הוצע כי ההשתלה מגדילה את בריכת התאים עם ריבוי היוחסין-מאכלס מחדש את הפוטנציאל כתוצאה של פלסטיות, ומאפשר לתאים המושתלים לצמוח בלוטת חלב תפקודית7,10,11,12,13. חשוב מכך, השימוש בטכניקות השתלת מכרסמים מתגבר על מגבלות של תאים המושרה התרבות התאי14 ולעתים קרובות מספק תוצאות רק עניין של שבועות.
בעוד ההליך תוארה במקור בהקשר של נגעים preneoplastic בעכברים, זה היה מורחב במהרה חולדות משמש בשילוב עם הטיפול מסרטן כדי להקים ריבוי כמדד של הרגישות לסרטן15, אבל הפופולריות של טכניקות השתלת עקב התפתחות של כלים גנטיים עבור כל מין. למרות לימודי העכבר המשלבים השתלת תרמו ממצאים טרנסלבותית רבים, המקרוב של בלוטת הפטמות של החולדה דומה לאדם הדוק יותר16,17 ומציע יתרונות ברורים ללמוד קולטן אסטרוגן-חיובית (ER +) סרטן השד. גידולי הפטמות מinducible בשני המינים, אך הם נבדלים במונחים של רגישות הורמונלית ופרופילי ביטוי גנטי. ההבדל העיקרי הוא כי גידולי הפטמות העכברים לבטא ותלוי בתפקוד של קולטני הורמונים השחלות ובלוטת יותרת השכל, כלומר, אסטרוגן ופרוגסטרון (PR), בדומה ללומיאל-סוג של סרטן השד האנושי. אכן, השתלת תא האפיתל הפטמות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, נעשה שימוש כדי ללמוד משתנים גנטיים המעורבים בסרטן השד ולקבוע את האוטונומיה התאית של ההשפעות על תאים אפיתל הפטמות18.
בנוסף לביולוגיה של הגידול, האפיתל הדוטל של בלוטת הפטמות הרגילה מציגה רמה גבוהה יותר של הסתעפות ומוקף בשכבה עבה יותר של משתית מאשר העכבר. חשיבותו של הסטרומה מתועדת היטב במחקרים של השתלות האפיתל. אפיתל הפטמות חייב לקיים אינטראקציה עם משתית שומן, ובאופן אידיאלי משלה mesenchyme, כדי לעבור את המאפיין שלה מורפולגנזה19,20. השתלת רקמה בבלוטת החלב של המטופל מספקת סביבה אופטימלית; עם זאת, הנוכחות של אפיתל אנדוגני יכול להפריע לתוצאות. ניקוי בלוטת החלב של אפיתל אנדודוגני מבוצע בדרך כלל באמצעות השתלת העכבר בחני ודורש כריתה כירורגית של רקמת חלב אנדוגניים ו/או הסרת הפטמה1,21,22. למרות האפשר, מראש לנקות את האפיתל הפטמות בחולדות פוסט-weanling אינו מבוצע באופן נרחב, בעיקר בשל חוסר היעילות של ניקוי עץ הפטמות הגוברת בחולדות פוסט-weanling. מאז הוכח כי אזורים של רקמת האדיפוז במקום אחר בגוף יכול לתמוך בצמיחה של אפיתל החלב המושתלת21,23,24, תהליך של מראש ניתן להימנע בקלות חולדות על ידי השתלת רקמות לתוך pad שומן לבן הגלימה.
שיטת ההשתלה המתוארת במאמר זה כרוכה בהזרקה של אורגנואידים בלוטת החלב אנזיטיתיים (שברי האפיתל של הפטמות וסוגי תאים אחרים המסוגלים להיות מורפולגנזה) או תאים חד מפוצלים לתוך משטח השומן הבין-משני ב מונוגניים, או זנים של עכברי מעבדה2. בגלל pad שומן החוצה הוא נטול בדרך כלל של רקמת הפטמות, הוא מספק סביבה מתאימה עבור אתרי השתלת מרובים ללא צורך ברור מראש אפיתל אנדוגניים. כתוצאה מכך, האנדוגניים בעלי החיים המארחים, בלוטות החלב מבולי הבטן אינם כפופים לטיפול כירורגי, מפתחים כרגיל, ואינם יכולים להפריע לפרשנות של תוצאות. בנוסף, ניתן להשתמש בבלוטות החלב ללא שינוי לצורך השוואת המחשב המארח לעומת השפעות התורמים בהתפתחות האפיתל של החלב ובטומוריגנזה18,25. למרות שאכלוס מחדש של בלוטת החלב מתא גזע אחד זמין עבור עכברים, זה עדיין לא פותחה עבור עכברוש, בעיקר בשל חוסר הזמינות של נוגדנים לבחור עבור העכבר הפטמות גזע בתאי25,26,27. למרות זאת, השתלת תאים אפיתל מונוציתיים לכמת מחדש את הפוטנציאל ניתן לבצע בהצלחה, ותאים אלה יפתחו בדרך כלל כאשר מושתל במסגרת המתאימה2,3,4. בעוד אורגנואידים הם טובים עבור מטרות רבות, תאים חד מפוזרים נדרשים עבור יישומים כמותיים, למשל, כדי לקבוע את מספר התאים האפיתל החלב הנדרש עבור החניכה סרטן בעקבות טיפול קרינה מייננת28 או להשוואת מאפייני הזרימה הצילתית של הפטמות של תאים האפיתל שנבחרו בשנת29.
עד היום, ההליך המתואר כאן הוא השיטה החזקה ביותר של ביצוע השתלת בלוטת החלב בחולדה עם מטרה כוללת של לימוד פיתוח בלוטת החלב ומנגנונים בבסיס התפתחות סרטן השד. לעתים קרובות, התורם ו/או בעלי החיים נחשפים למשתנים שונים לפני, במהלך, או אחרי השתלת האפיתל. דוגמאות כוללות לימודי גנים בודדים מעורבים כימיים קרצינובגנזה30, קרינה28,31,32, מניפולציה גנטית של מארח/הגנום תורם18, ו מניפולציה הורמונליים12. היתרון העיקרי של הדיסוציאציה האנזימטית המתואר בפרוטוקול זה הוא ההזדמנות לבודד תאי אפיתל או תאים חד מבודדים עבור ניסויים משלימים הכרוכים בזרימה, תרבות תלת-ממדית, עריכת גנים ועוד. יישומים עתידיים של טכניקה זו יכלול מניפולציה נוספת של התורם ו/או מארח רקמות עם הנדסה גנטית. לדוגמה, תאים תורמים יכולים להיות מהונדסים גנטית לשעבר vivo בכל מקום גנומית שנבחרה באמצעות CRISPR-Cas9 המערכת לעריכת גנים. באופן דומה, חולדות הנמען יכול גם להיות שונה גנטית כדי ללמוד את האינטראקציה בין התורם לבין המטופל הנדסה גורמים גנטיים.

<table><tbody><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנני מזרק M</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-715G</td><td>חומרי עיכול קולגנאז מסננים סטריליים</td></tr><tr><td>1.5 - 2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה (סטריליים)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td>המכילים תאים תלויים ו/או תערובת הומוגנאט מוח</td></tr><tr><td>100 ומיקרו; מסנני תאים M</td><td>קורנינג</td><td>431752</td><td>סינון מוח הומוגנאט</td></tr><tr><td>100 uL מזרקים אטומים לגז עם 25 מחטים מד</td><td>המילטון</td><td>81001 & 90525</td><td>להזרקת תערובת שתל לבעלי חיים נמענים (1 לכל גנוטיפ/מצב תורם)</td></tr> <tr><td>1000 uL קצות פיפטה + פיפטה</td> <td>-</td><td></td> <td>העברת תאים/תערובות/רקמות</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור פוליפרופילן</td><td>פלקון (קורנינג)352196</td><td></td><td>מוח אחסון תערובת הומוגנית, או תא : תערובת הומוגנית להשתלה</td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסנני תאים</td><td>M קורנינג</td><td>431750</td><td>סינון אורגנואידים לאחר שטיפת גלולת התא</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פוליפרופילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-539-6</td><td>לעיכול קולגנאז של רקמת בלוטת החלב התורם</td></tr><tr><td>כלים 60 מ"מ Thermo</td><td>Scientific</td><td>130181</td><td>לטחינת רקמות</td></tr><tr><td>אלום אשלגן סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>243361/237086</td><td>צביעת בלוטת החלב הר שלם שקופיות</td></tr><tr><td>וופורייזר הרדמה לשימוש וטרינרי</td> <td>-</td><td></td> <td>עקוב אחר פרוטוקול מוסדי</td></tr><tr><td>בטא-דין או יוד</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צינור תרבית זכוכית בורוסיליקט להומוגניזציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-961-26</td><td>להומוגניזציה של המוח (השתמש בצינור מתאים להומוגניזציה)</td></tr> <tr><td>קרמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6152/1022</td><td>מכתים את בלוטת החלב שקופיות הר שלם</td></tr><tr><td>מכשיר ספירת תאים</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>כלובי בעלי חיים נקיים להתאוששות</td> <td>-</td><td></td> <td>עקוב אחר פרוטוקול מוסדי</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 3</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה קורפ.</td><td>LS004183</td><td>עיכול אנזימטי של רקמת בלוטת החלב הטחונה מחולדות תורמות</td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td> <td>-</td><td></td> <td>לתמיסות כימיות</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>לטחינת רקמות, מצעי עיכול קולגנאז והשעיית תערובות תאי אפיתל</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>תערובת מונופיזרציה</td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>מקבע שקופיות של תושבת שלמה, שטיפת שקופיות של תושבת שלמה, ניקוי אתרי חתך כירורגיים (מדולל)</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td></td><td>תמיסת אינאקטיבציה</td> <td>של היקלון</td></tr> <tr><td>גזה</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A38-212</td><td>שימוש לקיבוע שקופיות שלם של חלב (1:4 חומצה אצטית קרחונית ב-100% אתנול)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>תערובת מונופיזרציה</td></tr><tr><td>רפידות חימום</td> <td>-</td><td>-עקוב</td> <td>אחר פרוטוקול מוסדי</td></tr><tr><td>דליי קרח (x2)</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור עם סיבוב מסלולי</td> <td>-</td><td>חייב</td> <td>להיות מסוגל לשמור על 37&deg; C, רעידות במהירות 220-225 סל"ד (לעיכול קולגנאז של רקמת החלב)</td></tr> <tr><td>הרדמה איזופלורן</td> <td>-</td><td></td> <td>עקוב אחר פרוטוקול מוסדי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור או מצלמה דיגיטלית</td> <td>-</td><td></td> <td>הדמיה של אפיתל חלב שלם ו/או רכישת תמונות</td></tr><tr><td>הומוגנייזר מכני</td><td>פישר רקמות מדעיות</td><td></td> <td>או דגמים חלופיים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי, טהור</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>אחסון לטווח ארוך של תושבות שלמות של בלוטת החלב</td></tr><tr><td>המנוקה מיכלי חמצן להרדמה וופורייזר</td> <td>-</td><td></td> <td>עקוב אחר הפרוטוקול המוסדי</td></tr><tr><td>מגבות נייר או מגבוני משימות עדינים</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>רקמת בלוטת החלב תושבות שלמות</td></tr><tr><td>לאחר הניתוח משכך כאבים</td> <td>-</td><td></td> <td>פרוטוקול מוסדי</td></tr><tr><td>מדידות</td><td></td><td></td><td>משקל גוף של בעלי חיים, מינון נכון של תרופות נגד כאבים</td></tr><tr><td>מכונת גילוח</td> <td>-</td><td></td> <td>קוצץ חשמלי</td></tr><tr><td>, או צנצנות צביעה</td> אחרות <td>-</td><td></td> <td>מינימום 1 לכל שטיפה כימית, גודל מתאים למספר המגלשות, זכוכית מועדפת</td></tr><tr><td>וילונות שדה סטריליים</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>משמש במהלך ההשתלה</td></tr><tr><td>מספריים ומלקחיים סטריליים x3 (אוטוקלאב</td>) <td>-</td><td></td> <td>כלים כירורגיים לחיטוי המשמשים לתורמים ומקבלי</td></tr><tr><td>מזרקים: 5 מ"ל (או יותר)</td> <td>-</td><td></td> <td>לסינון סטרילי של מצע עיכול קולגנאז</td></tr><tr><td>תערובת מונופיזר</td><td>טריפסין</td><td>וורת'ינגטון</td><td></td></tr><tr><td>כלי קיבול לאיסוף פסולת לנוזלים (מוזגים או נשאפים)</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>יישום קליפ פצע, קליפסים וכלי להסרה</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>סגירת חתך העור מעל כרית הרפידה הלבנה הבין-שכמה</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>ניקוי בלוטת החלב שלם מחליק לאחר צביעה</td></tr></tbody></table>

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

מוקדם כמו שנות ה-70, החוקרים הושתל בהצלחה תאים אפיתל החלב לתוך משטח שומן לבנים לבן של חולדות. השתלת אפיתל החלב באמצעות טכניקות השתלת מנצל את הסביבה ההורמונלית המסופקים על ידי מארח מכרסם המתבגר. מחקרים אלה מתאימים באופן אידיאלי כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציות ביולוגיות שונות על פיתוח בלוטת החלב ולנתח היבטים רבים של בלוטת החלב ביולוגית. נפוץ, אבל מגביל, תכונה היא כי התאים האפיתל המושתלים מושפעים מאוד על ידי משתית מסביב והתחרו על ידי אפיתל אנדוגניים; כדי לנצל את רקמת הפטמות הילידים, pad שומן לבן בבטן העור חייב להיות מנוקה כדי להסיר אפיתל הפטמות מארח לפני ההשתלה. מכשול גדול בעת שימוש באורגניזם מודל החולדה הוא שניקוי עץ הפטמות המתפתח בחולדות שלאחר-מכן אינו יעיל. כאשר מושתלים לתוך רפידות שומן ללא בלוטת, התאים האפיתל התורם יכול לאכלס משטח מארח נקי שומן ליצור בלוטת החלב תפקודית. משטח השומן הרפית הוא מיקום חלופי עבור השתלים אלה. היתרון העיקרי הוא שהוא חסר מבני ductal עדיין מספק את משתית נורמלי כי יש צורך לקדם את הצמיחה אפיתל והוא נגיש בקלות בחולדה. יתרון מרכזי נוסף של הטכניקה היא כי הוא פולשני מינימלית, כי זה מבטל את הצורך לצרוב ולהסיר את עץ הפטמות האנדוגניים גדל. בנוסף, פד שומן מכיל כלי דם המדיאלי שניתן להשתמש בו כדי להפריד אתרים להשתלת. בגלל בלוטות אנדודוגני להישאר שלם, טכניקה זו יכולה לשמש גם למחקרים השוואת בלוטת החלב אנדוגניים לבלוטה המושתלים. נייר זה מתאר את השיטה של השתלת תא האפיתל הפטמות לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות.

בלוטות החלב של התורם והנמען השלבים כדי לבודד ולהכין את התאים האפיתל החולדה החלב עבור השתלת מוצגים באיור 1א. בגיל 4 שבועות, בלוטת החלב אנדוגניים של עכברוש התורם החלה התבגרות האפיתל ניתן לדמיין על שקופיות רכוב שלם מוכתם עם אלום כרמיין (איור 1B). עכברוש אחד התורם בגיל זה יספק כ 1 x 106 תאים להשתלה. אם כמות רקמת התורם שנאסף או בעקבות המבצע ה...

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

פרוטוקול זה שימש במשך 40 שנה ונשאר השיטה האמינה היחידה להשתלת תאי חלב בחולדה. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור תא חלב אוטונומי לעומת השפעות מארח במחקר רגישות לסרטן השד. על ידי השתלת כרית השומן הבין-שרירית, שיטה זו עוקפת את הצורך לנקות את האפיתל הממברנה הא אנדוגני אשר אינו יעיל בחולדות.השיטה היא אפוא פחות פולשנית ואת בלוטות החלב אנדוגני יכול לשמש שליטה פנימית. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים חולדה נקבה המתת יתד על גבו ולאבטח אותו עם סיכות. לרסס את כל משטח הגחון עם 70% אתנול.בצע חתך בצורת Y קשתית המאפשר גישה לבלוטות החלב בית החזה, הבטן, ו inguinal. השתמש מספריים כדי לנתח את כל רקמת בלוטת החלב מן החולדה התורם ולהסיר את כל בלוטות הלימפה גלוי. לאחר מכן, השתמש במדפים כדי לחלץ את רקמת הקמרית.מניחים אותו בצלחת 60 מילימטר שכותרתו המכילה 500 microliters של מדיה DMEM F12 ללא סרום ולשמור אותו על קרח. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לטחון דק את רקמת הקמרי. ראשית, סובבו בזהירות את גופת החיה התורמת כדי למקם אותה במצב מועד ולאבטח אותה באמצעות סיכות.לרסס את הראש ואת הגב העליון עם 70% אתנול. אתר את בסיס הגולגולת ובצע חתך מתחת לתרוח העורפי, הכנס מספריים חדים מתחת לעור וגזור את העור מהגולגולת כולל דפנות הראש. לאחר מכן, השתמש חותכי עצם או מספריים חזקים כדי לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע מן העורף לעצמות חזיתיות תוך הקפדה לשמור על הלהב שטחי ככל האפשר זווית כלפי מעלה כדי למנוע את ההרס של רקמת המוח הבסיסית.השתמש Rongeurs או מדפים חזקים לקלף את העצם. הכנס את הכלי לצד השני אל המוח הקטן כדי לשבור את העצם משני הצדדים. לנתק את הקשרים למתן על ידי חשיפה מלאה של תעלת השמיעה.השתמש מדפים דקים מעוקל כדי להרים את המוח מתוך הגולגולת ולתקליט את משקלו. השתמש בהתחלה חדשה של אספקה למוחות תורמים נוספים. מיד להעביר אותו לצינור 15 מיליליטר המכיל כמות שווה של מדיה המאוחסנת על קרח.הומוגניזציה של המוח למשך 10 עד 15 שניות במהירות נמוכה. לאחר מכן לסנן את הומוגניט כדי להסיר חתיכות גדולות. יש לאחסן את הנוזל על הקרח עד לצורך.ראשית, חותכים סנטימטר אחד מקצה קצה פיפטי 1,000 מיקרוליטר וממקמים אותו ידנית על הצינור. השתמש טיפ פיפטה לחתוך להעביר את רקמת התורם טחון מכל צלחת 60 מילימטר לצינור העיכול קולגן. מערבבים בעדינות את הרקמה הטחון על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה פעם עד פעמיים.ואז לאבטח את הדגימות במצב אופקי באינקובטור רועד. אפשר לדגימות לעכל במשך 1.5 עד שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות במהירות שבין 200 ל-220 סל"ד. כאשר רקמת בלוטת החלב התורם מתעכלת במלואה, צנטריפוגה ההשעיה ב 1, 200 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר הבטחת גלולה נוצרה, להשתמש פיפטה כדי להסיר את שכבת השומן או בזהירות לשפוך את supernatant. לעכל בעדינות את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיה טרייה DMEM F12. חזור על תהליך זה כדי לשטוף ביסודיות את התאים.הכינו צינור אחד של 50 מיליליטר עם מסננת של 40 מיקרומטר לכל חיה תורמת. הרטב מראש את מסננת עם לפחות מיליליטר אחד של מדיה DMEM F12. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי להעביר את ההשעיה התא דרך המסנן כדי לאסוף שברי צינורית או אורגנואידים.עבור אורגנואידים, שמור רק את התאים שנותרו במסנן. להפוך את מסננת התא על צינור חדש 50 מיליליטר ולשטוף עם כל נפח של מדיה סטרילית הנדרשת כדי לאסוף את כל התאים. לאחר מכן, גלולה התאים שוב resuspend בנפח קטן של מדיה לספירה.הכן אצוות בודדות של חומר תורם עבור כל מושתלים על ידי שילוב כמויות שוות של ההשעיה התא עם הומוגני המוח 50% עבור כל אתר של השתלה. ראשית, לזהות את הבסיס של הגולגולת ולהתחיל את עמוד החוליות על בעל חיים הנמען. כשליש מהדרך במורד עמוד השדרה, מגלחים אזור של שלושה סנטימטרים בשני סנטימטרים בחלק החזי העליון של הגב.לאחר מכן, הכינו את השדה הסטרילי שישמש לניתוח וסדרו את כל האספקה הדרושה. רוקן את מזרקי המילטון עם מדיית DMEM F12 סטרילית כדי למנוע אובדן תאים. טען את כל נפח חומר התורם למזרק נפרד עבור כל תנאי.לאחר המזרק טעון במלואו, להפוך אותו ולחץ על הבוכנה מעט כדי להסיר בועות אוויר בקצה המחט. שמור את המזרק על קרח לאורך כל ההליך. ודא שהחיה לא מגיבה לגירויים עמוקים עם קמצוץ בוהן מוצק.לאחר מכן השתמש בלהב כירורגי חד כדי לבצע חתך בין-שרירי קטן. אתר את כלי הדם המדיקלים להתמצאות ולהשתמש במקלות כדי להרים את העור בצד אחד של החתך. החזק את העור הרחק כרית השומן ולהימנע שומן חום הבסיסית בזמן ההשתלה מבוצעת.לאחר מכן, הכנס את המחט לאתר השתל. בזהירות להזריק 40 microliters של תערובת התא לתוך רקמת כרית שומן לבן בין-שרירי. הסר את המחט לאט.החזק את הרקמה במקום ולאפשר לתאים המושתלים להסתפק בשלוש עד חמש שניות. חזור על הליך ההזרקה כולו כפי שתואר קודם לכן באתר השני של ההשתלה. לאחר מכן, לסגור את הפצע הכירורגי באמצעות פצע קליפים או תפרים ולאחר מכן להפסיק את ההרדמה.לאחר הקרבת החיה, הכינו אותה לפירוק. זהה את כלי הדם המדיקל המפריד בין אתרי השתלים בכריות השומן הבין-שריריות. בלמל את כל הפנקס כחתיכת רקמה אחת.מניחים את הרקמה על מגלשת מיקרוסקופ טעונה חיובית עבור הרכבה שלמה. מניחים את המגלשות ב 70% אתנול במשך שבעה עד 10 ימים כדי לבטל את השומן של הרקמה. לאחר מכן להכין את כתם קרמיין אלום ולעבד את השקופיות כאשר הרקמה אטומה מספיק.כאשר העיבוד הושלם והרקמות בשקופית התבהרו, השתמש במיקרוסקופ אור בעל עוצמה נמוכה או בצילום דיגיטלי ברזולוציה גבוהה כדי לרכוש תמונות של השקופיות לניתוח. במחקר זה, תאי אפיתל חלביים מושתלים בטכניקה המותאמת לעבודה עם חולדות שבה אורגנואידים אפיתל חלביים מבודדים של חולדות תורמות מושתלים לתוך כרית השומן הלבנה הבין-שרירית של חולדות הנמען. ניתן להעריך את הנוכחות, ההיעדרות או שפע האפיתל כדי לקבוע את הצלחת הניסוי, כמו גם את האוטונומיה של השפעות הקשורות למשתנים ניסיוניים.ניסוי השתלת הדדי שבו לכל גורם יש שתי רמות כגון סוג פראי לעומת נוקאאוט ייצור ארבע קבוצות השתלה לבדיקת השערה. כרית השומן הבין-שרירית הרכובה הייצוגית המוצגת כאן מכילה תוצאה חיובית של אפיתל בשני אתרי ההשתלה. בעת ניתוח השקופיות, חוסר אפיתל כרית השומן הבין-שרירית על פני דגימות רבות עשוי להצביע על בעיה טכנית עם ההליך ויש להתייחס אליו כאל תוצאה שלילית.ניתן להשוות את הצמיחה האפיתל התורם גם בלוטת החלב אנדוגני עשוי להקל על מסקנות נוספות. בדוגמה המוצגת כאן, התוצאות של השתלת הדדית באמצעות סוג פראי וחולדות נוקאאוט CDKN1B הציעו השפעות אוטונומיות של תאים שאינם ממארי על התפתחות בלוטת החלב. זכור תאי אפיתל תורם אורגנואידים חייב להיות מוכן בזהירות נשמר בחיים עד מוזרק לתוך החיה הנמען.חובה לתכנן מראש ולבצע את ההליך בזהירות וללא הפרעות. בדיקות קרצינוגנזה ראשוניות יכולות להתבצע לאחר ההשתלה כדי לחקור אוטונומיה של תאי חלב באטיולוגיה או בטיפול בסרטן השד. עריכת גנים יכולה גם להיות משולבת כדי להנדס גנטית את התאים התורמים או את החולדה הנמען.כשיטה היחידה לביצוע השתלת תאי אפיתל החלב בחולדות, הליך זה מקל על התפתחות בלוטת החלב, כמו גם מחקרים מסרטנים. טכניקה זו חשובה במיוחד לחקר אינטראקציות בין תאים סרטניים בשד ו/או תאי אפיתל חלביים עם המיקרו-וירוס המארח. זה מאפשר מחקרים בפיתוח בלוטת החלב, כמו גם מחקר סרטן השד.אלה המנסים טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לייעל את ההכנות תא התורם כדי להבטיח תפוקת תאים מקסימלית וכדאיות, ולאחר מכן לבצע ניסויים פיילוט קטן לתרגל הליכים כירורגיים ולקבוע מספרי תאים להזריק וגם לקבוע את זמני הדגירה שלאחר הניתוח הנדרשים לניסויים.

rat-mammary-epithelial-cell-transplantation-into-interscapular-white

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme...

החלב להשתלות אפיתל נוהל

בדו"ח זה, אנחנו מדגימים מערכת לבודד התורם התרבות תאים מבלוטת החלב העכבר, ו orthotopically השתלת תאים אלה בעכברים הנמען לנתח סטרומה: אינטראקציות אפיתל במהלך התפתחות הגידול החלב.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

במאמר זה נדון כיצד לבסס מודל סרטן שד בעכברות נקבות על ידי הזרקת תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב. הפרוטוקול לדוגמה מדגים את ההזרקה האורתוטופית.

הזרקה אורתוטופית לפד שומן החלב: ביסוס סרטן השד בעכברות

הסרטון מדגים את טכניקת החיסון האורתוטופית לסרטן השד במודל עכבר. טכניקה זו מייצרת שיעור גידול גבוה עם פחות שונות בגודל הגידול וצורתו בהשוואה להזרקה תת עורית או לא ניתוחית.

הזרקה אורתוטופית: השתלת תאים סרטניים ספציפיים לרקמה בעכבר בוגר

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

למד שיטת השתלה של תאי אפיתל בלוטות החלב בעכברושים לתוך משטח השומן הלבן הבין-כתפי. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות תאים מול מארח בסרטן השד ללא צורך בניקוי מוקדם.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

גלה סרטונים נוספים