הערכה סטריאוולוגית של אורך סיבים Cholinergic בגרעין באסליס של מיינרט של המוח עכבר

Neurodenegration בהפרעות נוירולוגיות רבות הוא תהליך כרוני שבו אובדן סיבים עצביים מתרחשת לעתים קרובות לפני אובדן גוף התא. כימות סטריאולוגי של סיבים עצביים בשלושה ממדים מספק שיטה רגישה ומדויקת לגילוי שינוי נוירודגנרטיבי מוקדם. טכנולוגיה זו מנצלת את השברים הבלתי משוחדים מבוססי המחשב האמינים והיעילים של כדורי חלל כדי למדוד את האורכים של מבנים דמויי קו כגון סיבים עצביים תלת-מימדיים.

הדגמת ההליך תיעשה על ידי פרבהאקר סינג, פוסט-דוק ומומחה לסטריאולוגיה, ודיוויד פנג, עוזר המחקר במעבדה שלי. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה, transcardially perfuse עם כ 50 מיליליטר של קרח קר 0.1 DPBS טוחן, ואחריו כ 25 מיליליטר של 4%PFA ב 0.1 PBS טוחן. בסוף הזיופה, לאחר לתקן את המוח במיכל של טרי 4% PFA במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, לשטוף את המוח עם שלוש שטיפות של דקה עד שתי דקות ב DPBS טרי לכל לשטוף ולהעביר את המוח לתוך 15% סוכרוז בתסנובה 0.1 DPBS לילה. למחרת בבוקר, למקם את המוח לתוך פתרון סוכרוז 30% ו 0.1 DPBS טוחנת במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מעבירים את המוח לתא קריוטום שנקבע מראש למינוס 20 מעלות צלזיוס.

מוח יכול להישמר בצינורות אטומים ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לצורך חתך, להטמיע את דגימת הרקמה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית הטבעה בינונית ולהטמיע את המדגם על דיסק דגימה. לאחר מכן לרכוש קטעים טוריים 30 מיקרומטר עבה במישור coronal ב cryotome, העברת כל קטע לתוך בארות בודדות של צלחת תרבות 24-well המכיל פתרון cryoprotectant כהכנה לאחסון מינוס 20 מעלות צלזיוס.

כדי לזהות את החלק הראשון ו האחרון של כל מוח, השווה את התכונות המורפולוגיות עם אטלס מוח עכבר סטנדרטי. NBM מתחיל ב bregma מינוס 0.0 מילימטרים ומסתיים במינוס 1.6 מילימטרים. הבחירה בכל מקטע שמיני מניבה בסך הכל שישה עד שבעה חלקים ומאפשרת מקדם שגיאות מתאים הן להערכת נפח והן להערכת אורך סיבים.

לתיוג אימונוהיסטוכימי של מקטעי הרקמה, לאחר חסימת כל כריכה לא ספציפית עם סרום חזיר 10%-נורמלי ב-0.1% טריטון X-100 בתמיסת מלח עם מאגר טריס, סמן את החלקים בנוגדן העניין העיקרי במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך שלוש דקות טרי מאגר מלוחים לכל לשטוף, ואחריו דגירה עם נוגדן משני biotinylated המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים מלוחים טריים מאגר טריים כפי שהוכח, ואחריו כתמים עם מתחם ביוטין פרוקסידאז אבידין ותמיסת מצע פרוקסידאז DAB על פי פרוטוקולי היצרן.

לאחר הכביסה, הר את כל החלקים מדגימה אחת של רקמת מוח על מגלשה אחת שעברה ג'לטין ואפשר לדגימות להתייבש באוויר. כדי לייבש את החלקים, לטבול את הדגימות פעמיים במשך חמש דקות לדילול בפתרונות אתנול עולה ברצף כפי שצוין, ואחריו ניקוי עם שתי שטיפות קסילן 10 דקות. לאחר מכן השתמש במדיום הרכבה מתאים כדי למקם כיסויים על השקופיות.

לסטריאולוגיה, פתחו מחקר חדש בתוכנה. תיבת דיאלוג לאתחול מחקר תיפתח. מלא את פרטי המחקר ואשר שנבחר בסיס שבר רב-שכבתי.

לחץ פעמיים על עוצמת הקול כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של עוצמת הקול. תן שם לתכונה המעניינים ובחר את בדיקה ספירת נקודות האזור ולחץ על הבא. לחץ פעמיים על אורך ולספק שם של התכונה.

בחר בדיקה כדור ולחץ הבא. בתיבת אתחול המקרה, כדי לקודד את הקבוצות לפני תחילת המחקר, הגדר את המספר הכולל של מקטעים החל מהמקטע הראשון המכיל את אזור העניין לסעיף האחרון המכיל את אזור העניין ואת מרווח הדגימה של המקטע לשמונה. לחץ לצד כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של אתחול הבדיקה שתגדיר באופן אוטומטי את ההגדלה הנמוכה ביותר עבור בחירת האזור והערכת אמצעי האחסון ותאשר את ההגדרות.

לחץ על תצוגה מקדימה כדי לבדוק אם ניתן לזהות את אזור העניין בהגדלה הנמוכה שנבחרה. הזן קוביית 50,000 מיקרומטר לנקודה עבור שבר עוצמת הקול של האזור ולחץ על תצוגה מקדימה ו בוצע. תחת הגדלה גבוהה של אובייקט, הגדר את האורך ל- 63X ואורך לחיצה כפולה כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של כדור האורך.

הגדר את הקוטר של כדור זה ל 10 מיקרומטר ולחץ נעשה. הגדר ערכים מתאימים לאזור המסגרת, לגובה המסגרת, לאזור השמירה ולרווח בין המסגרות. לאחר מכן לחץ על הבא ובצע את ההוראות שסופקו על-ידי התוכנה.

כדי להוסיף את המקטע הראשון, מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ תחת מטרה של 5X ולחץ על החץ הירוק כדי לצייר גבול שרירותי סביב ה- NBM כדי להגדיר את אזור העניין. לחץ על החץ הירוק ו בוצע כדי לשנות את המטרה 63X כדי להשיג את מדידות הסיבים של השבר הנוכחי. תיבת הדו-שיח עובי מקטע יופיע.

הגדר את המשטח העליון והתחתון של המקטע כדי למדוד את העובי הממשי של המקטע באמצעות ידית המיקוד הידנית של ציר z ולחץ על בוצע. הזז את ציר z לאט מלמעלה למטה בגובה המסגרת של המקטע כדי לסמן את כל הסיבים מצטלבים על פני השטח של החללית כדור וירטואלי. לאחר שכל הסיבים סומנו, לחץ ליד כדי להתקדם למיקום הבא.

לאחר השלמת כל השברים, לחץ על החץ הירוק. התוכנה תבקש להוסיף את החלק הבא. הבא את הדגימה הבאה בשקופית לפוקוס באמצעות המטרה 5X וחזור על מדידת הסיבים כפי שהודגם זה בלבד.

לאחר שנמדדו כל הסעיפים, התוכנה תיצור תוצאה עבור המקרה המציג את מקדם ערכי השגיאה. אם מקדם השגיאה קביל, המשך למקרה הבא. אם מקדם השגיאה אינו קביל, התוכנה תספק המלצות לשינוי חלק מה הפרמטרים.

לאחר השלמת כל המקרים, צור תוצאות עבור כל אירוע וקבוצה. בניסוי מייצג זה, קבוצת החלבון המוטנטית השוודית בטא עמילואיד הפגינו אורך סיבים נמוך משמעותית וצפיפות אורך סיבים בהשוואה לחבריהם לפסולת מסוג בר. התוצאות הראו גם כי לא היה הבדל משמעותי בהיקף ה-NBM בין שתי הקבוצות שניתחו.

טכניקה זו דורשת רכישה נכונה בכיוון הנכון ושיטת כתמים טובה עם תקופת הדגירה. פרוטוקול הסטריאולוגיה יכול לשמש להערכת כל פרופיל ליניארי כגון סיבים עצביים אחרים, תהליכי אסטרוציטים, או אפילו פרופילים של כלי הדם.