מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

שיטה זו תהיה מועילה עבור מחקרים ביולוגיים בסיסיים הקשורים לאינטראקציה בין מיקרוביוטה מעיים ובריאות המעיים. בנוסף, פרוטוקול זה עשוי לשמש לסינון פרוביוטיקה פוטנציאלית ו nutraceuticals כדי לרפא בעיות בריאות המעי, כגון תסמונת המעי הדולף ומחלות מעי דלקתיות. פרוטוקול זה משתמש במערכת הדמיה בתפוקה גבוהה כדי לאפשר ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חנונות מעיים ב C.elegans שטופלו בחיידקים וכימיקלים שונים.

אנו ממליצים למדען שאינם מכירים טכניקה זו להגביל את מספר הדגימות על מנת למנוע הטעיה וטעויות אחרות. הליך זה מורכב מצעדים רבים הדורשים הדגמה חזותית, כגון העברת תולעים לצלחות 96 בארות ושימוש במכונת אופרטה, כמו גם תוכנת הרמוניה. התחל על ידי הכנת 500 מיליליטר של בינוני LB סטרילי.

לחסן מושבה אחת של P.aeruginosa לתוך המדיום, ולהדקר את התרבות במשך 14 עד 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 150 סל"ד. למחרת, להפיץ באופן שווה את התרבות החיידקית לשני צינורות 500 מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 3, 220 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הסר את supernatant, משאיר 25 מיליליטר בכל צינור, עבור נפח שנותר הכולל של 50 מיליליטר, ולאחר מכן resuspend גלולה חיידקית.

לאחסן את תרבות החיידקים בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כדי לבדוק את ההשפעות של חיידקים על חנופת המעיים של C.elegans, להסיר את התרבויות מהמקרר, ביסודיות מערבולת אותם. הוסיפו בסך הכל 800 מיקרוליטרים לכל צלחת NGM טרייה, ואפשרו לצלחות להתייבש באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

להכנת צלחות דים, הוסיפו 50 מיליליטר של אגר בינוני NGM לבקבוק דים המכיל מרק NGM, ומערבבים היטב. לאחר מכן, יוצקים 20 מיליליטר של המדיום לתוך כל צלחת פטרי 90 על 15 מילימטר. הכינו צלחות DMSO על ידי הוספת 20 מיליליטר של DMSO המכילים מדיום NGM לכל צלחת פטרי, ולהשאיר את הצלחות בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות כדי לחזק.

מורחים 800 מיקרוליטרים של מערבולת E.coli או P.aeruginosa תרבות על כל צלחת NGM טרי, ולאפשר את הצלחות להתייבש באינקובטור 20 מעלות צלזיוס לילה. שטפו את זחלי L4 המסונכרנים לגיל עם S-buffer, והעברו כ-500 תולעים לצלחות ה-NGM המכילות חיידקים וכימיקלים שונים. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.

הכן את צלחות FITC-dextran בתוספת על ידי ערבוב שני מיליליטר של E.coli מושבת בחום עם ארבעה מיליגרם של FITC-dextran. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של התערובת לכל אחד מ-20 צלחות אגר NGM טריות, ומאפשרים לצלחות להתייבש במשך שעה על ספסל מעבדה נקי. לאחר 48 שעות של טיפול, לשטוף את התולעים עם S-buffer, להעביר אותם צלחות בתוספת FITC-dextran ו NGM צלחות ללא FITC-dextran, ו דגירה הצלחות לילה.

למחרת, לשטוף את התולעים עם S-buffer, ולאפשר להם לזחול בצלחת אגר NGM טרי במשך שעה אחת. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 4% פורמלדהיד לכל באר של צלחת שחורה, בעלת 96 בארות, עם תחתית שטוחה, והעברו כ-50 תולעים לכל באר. לאחר 1-2 דקות, להסיר את כל פורמלדהיד, ולהוסיף 100 microliters של מדיום הרכבה לתוך כל באר.

פורמלדהיד הוא כימיקל רעיל ויש לטפל בו בזהירות. כדי ללכוד תמונות פלואורסצנטיות, לחץ על סמל מכסה פתוח בתוכנת ההדמיה והכנס את הלוח למכונה. לחץ על התקנה, בחר את סוג הלוח והוסף את ערוצי השדה הבהיר וה- EGFP.

כדי להתאים את הפריסה, עבור אל הבחירה פריסה ובחר עקוב. הגדר את התמונה הראשונה במיקרומטר אחד, את מספר המטוסים ל- 10 ואת המרחק למיקרומטר אחד. בחר אחת מ בארות הטיפול ושדה לכידה אחד והקש Test במקטע הפעל ניסוי.

אם התמונות משביעות רצון, חזור למקטע התקנה ולחץ על סמל איפוס. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה. עבור אל הפעל ניסוי, הזן את שם הלוח והקש התחל.

כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, עבור אל המקטע ניתוח תמונה, הזן את התמונה ולמצוא את התא על-ידי בחירת ערוץ EGFP ושיטה B.Adjust הפרמטרים בהתאם לכיווני כתב היד ובחר את הממוצע כפלט. לחץ על סמל החל כדי לשמור את ההתקנה. השג מפת חום וטבלת נתונים על-ידי מעבר למקטע הערכה והתאמת פרמטר הקריאה ולאחר מכן התחל את ההערכה.

C.elegans הראה עלייה משמעותית פלואורסצנטיות FITC-dextran לאחר הדגירה עם P.aeruginosa לעומת שני זנים חיידקיים אחרים, המציין כי P.aeruginosa גרם נזק חיוני יותר מחסום המעי האפיתל וחדירות מעיים מוגברת. P.aeruginosa חי ומושבת חום עורר השפעות שונות מאוד על חודרות המעי ב C.elegans. עם איון החום, הן תמונות הפלואורסצנטיות והן הנתונים הסטטיסטיים מצביעים על כך ש- P.aeruginosa לא עורר רעילות כלשהי לנמטודות.

טיפול שותף של 48 שעות עם דים הפחית באופן משמעותי את עוצמת הפלואורסצנטיות FITC-dextran בתוך המעיים של תולעים שנחשפו P.aeruginosa, אשר מדגים כי דים יכול להיחשב מוצר טבעי טוב לרפא תפקוד לקוי של המעיים הנגרמת על ידי זיהומים חיידקיים. חשוב לזכור כי במהלך הכנת צלחות FITC-dextran מצופה, אתה צריך למזער את החשיפה לאור בגלל רגישות האור של FITC-dextran. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעות הפתוגניים ופרוביוטיים של חיידקי מעיים ואת הרכיבים הפעילים שלהם על ידי בדיקת החיידקים, כמו גם את ההרכב הכימי שלהם.