Name: להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למד הערכת תפקוד לב in vitro באמצעות קרדיומיוציטים עור מדגימות קטנות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תפקוד מיופילמנטים ורגישות סידן בביופסיות קפואות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT), האיחוד האירופי, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), פאנדו אירופה דה דסנוולוומנטו האזורי (FEDER) ומפעלי האופרה של Programa de Competitividade (להתחרות) על מימון יחידת המחקר של יוניק (UID/IC/00051/2013). פרויקט זה נתמך על ידי FEDER באמצעות COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalição (POCI), הפרויקט DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), הנתמך על ידי התוכנית התפעולית האזורית של נורטה פורטוגל (NORTE 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF), הפרויקט NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), הנתמך על ידי קרנות מבניות והשקעות אירופיות, התוכנית התפעולית האזורית של ליסבון 2020. פטריסיה רודריגז מומנה על ידי FCT (SFRH/BD/96026/2013) וז'ואאו אלמיידה-קואלו מומן על ידי אוניברסיטת פורטו/FMUP ו-FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa אופראי אזורי לעשות נורטה, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

<ol><li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+compliance%3A+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocardial+stiffness+by+%CE%B2-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li>
<li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCokkinos%2C+DV+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).</li>
<li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li>
<li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes%3A+a+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li>
<li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFalcao-Pires%2C+I+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).</li>
<li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Physiology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).</li>
<li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+structure+and+theories+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li>
<li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+role+of+ADP+and+Ca%282%2B%29+in+diastolic+myocardial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li>
<li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human%2C+murine%2C+and+porcine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Regulatory+Integrative+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics%3A+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li>
<li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+%28reverse%29+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).</li>
<li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li>
<li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li>
<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
<li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biology+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li>
<li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).</li>
<li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cardiac+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+Practice%22%5BJournal%5D)">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים.

להערכת חוץ של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור מייצג טכניקה חשובה כדי להבהיר את השינויים המתרחשים ברמת cardiomyocyte בפיזיולוגית (למשל, למתוח) והקשר פתולוגי (למשל, חוץמיה). מתודולוגיה זו יש מספר יתרונות כגון דרישת כמות מינימלית של שריר הלב כדי להעריך את הפונקציה cardiomyocytes המתקבל דגימות הפשרה; באמצעות קרדיומיוציטים ממגוון רחב של מינים(עכברים 13,חולדה 1,14,15,ארנב 16,חזיר 17,כלב 18,שרקן 19 ואדם 20) ומקומות לב שונים, כולל אטריה, חדרים שמאלה ויימין או אזור מסוים של הלב אוטם. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לספקריכוזים ספציפיים של Ca 2 + ואנרגיה (ATP) תוך מדידת הפונקציה של מבנים רגולטוריים והתכווצות בתצורה המקורית שלהם.
למרות הפשטות של טכניקה זו, ישנם כמה צעדים קריטיים. זה חיוני כדי להבטיח את האיכות של כל צעד מההתחלה, כולל איסוף מדגם. חלבונים myofilament רגישים פרוטאזות21. לכן חובה לאחסן דגימות בחנקן נוזלי מיד לאחר האוסף שלה. דגימות טריות, שלא הוקפאו קודם לכן, יפתחו כוחות גבוהים משמעותית, ולכן לא מומלץ לערבב מדידה שנעשתה בדגימות טריות וקפואות באותו פרוטוקול. הצעד השני הקריטי ביותר הוא החילוץ של הקרדיומיוציטים. במהלך הליך זה, זה חיוני כדי לשמור על המדגם על הקרח רוב הזמן. קוקטייל מעכב פרוטאז יכול לשמש כדי להפחית את הסיכון של השפלת חלבון במהלך החילוץ / permeabilization22. שלישית, יש לחתוך דגימות לחתיכות קטנות יותר באמצעות תנועות אזמל מדויקות שכן ציינו קרדיומיוציטים באיכות מופחתת כאשר צעד זה התעלם. צעד קריטי נוסף הוא שטיפת cardiomyocytes שכן קשה לקבל את האיזון הנכון בין שטיפת טריטון (מחלחל את התא אבל מקדם ungluing שלה) ושמירה על תאים רבים ככל האפשר על טבעי. חשוב לנסות תחילה את החילוץ ואת מספר סחף עבור כל מדגם, מין או פרוטוקול. למשל, בידיים שלנו, ציינו כי ZSF1 עקירות רקמת חולדה שמנים יש היבט "שומני", מה שהפך תאים אלה חלקלקים יותר במהלך ההדבקה אבל לא קשה יותר למדוד. הדרך בה אנו עוקפים את הבעיה הזו הייתה על ידי ביצוע ניסויים נוספים כדי שיהיה לנו מספר סביר של תאים לכל בעל חיים. יתר על כן, חשוב לבחור תא טוב להדביק, כלומר עם סטריציה טובה ואורך סביר. אם cardiomyocyte אין תכונות אלה, זה יהיה בעיקר להתנתק טיפים מחט או לפתח כוח לא / נמוך. חשוב גם להשתמש בדבק הנכון עבור התקשרות cardiomyocyte, בהתחשב בזמן הדבקה ויעילותו להדביק את התא למחט. בידינו, דבק הסיליקון(שולחן החומרים)מרפא מהר (10-15 דקות) וחזק מספיק. לבסוף, הצעד הקריטי האחרון קשור עם הרמת בזהירות את cardiomyocyte 5 דקות לאחר הדבקת התא (כדי למנוע הדבקה של התא לכיסוי) ולפני העברתו אל הבארים (כדי למנוע את התא להיגרר על ידי שלב המיקרוסקופ). טבלה 7 מסכמת את פתרון הבעיות המשויך לטכניקה זו, את הסיבות הבסיסיות שלה ואת הפתרונות האפשריים להתגבר על בעיות תכופות.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה לענות על כל השאלות הקשורות להתכווצות myofilament, כגון כמה מהר myofilaments להפעיל / להשבית. בהגדרת in vivo, depolarization ממברנה, תאיים Ca2 + להגדיל ואת הפיזור שלה myofilaments צריך להתרחש עבור myocytes להתכווץ, ואילו ב cardiomyocytes עור Ca2 + דיפוזיה myofilaments מתרחשת מיד כאשר התא שקוע בתספוס Ca2+ . קצב מהיר יותר זה של פיזור Ca2+ יהיה הטיה myofilaments הפעלה / ביטול ניתוח23.
ניסויים אלה מושפעים מגורמים שונים, כולל הטמפרטורה, ה- pH של הפתרון, הפרעה מכנית (מתיחה מחדש רפויה לעומת מרווח) והליכי התקשרות לתא (עניבת סיכה לעומת דבק), כל המשתנים הללו מהווים אי-התאמות בספרות במונחים של ktr והגברת תלוית האורך בסרקומרבכוח 4,12.
התקדמות עתידית של הטכניקה כוללת ביצוע מחקרים פונקציונליים ללא פגע ולא קרדיומיוציטים מחלחלים. טכניקה זו יש את החיסרון של הסתמכות על cardiomyocytes מבודד טרי (לא קפוא בעבר). נושא חשוב נוסף אינו קשור ישירות למתודולוגיה זו, אך זה עשוי להשפיע באופן משמעותי זה קשור לתקופה המקסימלית של אחסון קפוא מדגם. באופן ספציפי, חובה לקבוע את מידת השפלה myofilament לאורך זמן האחסון (כלומר, במשך כמה זמן דגימות קפואות ניתן לאחסן על מנת להבטיח נתונים פונקציונליים באיכות טובה נגזר cardiomyocytes שחולצו).

באופן מסורתי, הערכה של תכונות מכניות שריר הלב נוסתה בעיקר בהכנות רב תאיות, כגון שרירי papillary ו trabeculae1,2. רצועות שרירי לב רב תאיים כוללות אוכלוסייה הטרוגנית של תאים, כולל קרדיומיוציטים מתכווצים עם דפוס לא ידוע של אוריינטציה ודור כוח, פעילות חשמלית והפצת מתח / זן, כמו גם מטריצת רקמת חיבורמקיפה 3,4. הכנה ללא קולגן ומכילה קרדיומיוציט יחיד תאפשר מדידה של אורך סרקומר ומאפיינים מתכווץ חוצה גשר בצורה מדויקת ומבוקרתמאוד 5,6. לכן, במהלך ארבעת העשורים האחרונים, פותחו מספר מתודולוגיות המאפשרות לחקור את המאפיינים המכניים, מתכווצים והרפיה של קרדיומיוציטיחיד 6,7. הפונקציה מתכווצה של תאים אלה תלויה מאוד באורך סרקומר וקינטיקה רכיבה על אופניים חוצהגשרים 3. לכן, רצוי לחקור את תפקוד השריר ישירות בתאי לב בודדים בודדים, בהתחשב בכך שהוא מאפשר הערכת אורך וביצועים sarcomere, כמו גם תפקוד חוצה גשר ומאפיינים מתכווץ. עם זאת, בידוד והצמדת cardiomyocytes פונקציונלי עם רזולוציה sarcomere אופטי סביר תוך הקלטת מדידת כוח ברמת μN הוא עדיין מאתגרומתפתח 3,6. אתגרים נוספים הם הלוגיסטיקה שיש להתקין כדי לבודד קרדיומיוציטים מהביופסיות שנאספו לאחרונה. הבלתי צפוי של איסוף ביופסיות אנושיות, למשל, עלול לסכן את ההיתכנות של הניסויים.
יתר על כן, חששות אתיים לגבי החלפה, הפחתה ועידון של ניסויים בבעלי חיים עבור הליכים מדעיים (עקרונות של 3Rs) קידמו שינויים במחקר ברמה התאית והרקמות, רצוי בביופסיות אנושיות, או בדגימות קטנות יותר של בעלי חיים. אכן עידון פרוגרסיבי של מתודולוגיות להערכת תפקוד הלב במבחנה ברמה קטנה יותר של מורכבות מאפשר אינטגרציה נכונה של התוצאות לגוף כולו ולתרגם אותן לתרחיש הקליני7. בסך הכל, באמצעות דגימות המאוחסנות ב -80 °C (69 °F) כדי לחלץ קרדיומיוציטים עשוי להיות חלופה מושכת.
רקמת שריר הלב נחתכת לחתיכות קטנות והומוגנית עם מרגמה ועלי. התוצאה של הומוגניזציה זו היא השעיה של תאים ארוזים ומבודדים עור בדרגות שונות של נזק סרקולם, שבו קוצר ראייה חשוף למדיום הרחצה וכל הרכיבים התאיים נשטפים החוצה. מבנים כגון myofibrils כי הם רחוקים יותר מן הסרקולמה נשמרים. לכן, סרקומר קיצור ומאפיינים פונקציונליים הקשורים מנגנון myofibrillar נשמרים שלמים ניתןתועד 8,9.
מערכת מדידת הכוח הקרדיומיוציטים מורכבת ממונע אלקטרומגנטי, המשמש להתאמת אורך קרדיומיוציטים, ומתמר כוח, המודד התכווצות אירוביומיוציטים איזומטרית. קרדיומיוציט מחלחל, או עור, ממוקם בתא ניסיוני המכיל פתרון מרגיע ([Ca2+] < 10 nM) וסיליקון מודבק ל 2 מחטים דקות: אחד מחובר למנוע והשני מתמר הכוח. מערכת אופטית משמשת לקביעת מורפולוגיה קרדיומיוציט ואורך סרקומר. הפרוטוקול הניסיוני מורכב לעתים קרובות מסדרה של הקלטות כוח על פתרונותחיץ המכילים ריכוזים שונים של Ca 2+ , קביעת קינטיקה חוצת גשרים של Actin-myosin ומדידת המתח הפסיבי של הקרדיומיוציטים המותקנים באורכים מוגדרים מראש של סרקומר (איור 1). בידוד של קרדיומיוציטים מחלחלים מדגימות שריר הלב המוקפאות בחנקן נוזלי (ולאחר מכן מאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס) היא טכניקה המנצלת מכניקה תאית וביוכימיה שלחלבונים למדידת כוח קה 2+-מופעל (פעיל) לכל אזור חתך (Tפעיל, kN∙m-2 ), Ca2+-עצמאי (פסיבי) מתח (Tפסיבי,kN∙m-2),myofilaments Ca2 +רגישות (pCa50),שיתוף פעולה myofilaments (nHill), שיעור פיתוח כוח מחדש (ktr) כמו גם תלות באורך sarcomere של Tפעיל,Tפסיבי , pCa50, nHill ו ktr.
מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש ולסכם את הפוטנציאל של מערכת מדידת כוח cardiomyocyte כהליך אמין כדי להעריך את המאפיינים המכניים הפונקציונליים של קרדיומיוציטים עור יחיד מבודד מדגימות קפואות ממינים שונים.

<table><tbody><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט (Na2ATP)</td><td>סיגמא</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>סידן פחמתי (CaCO3)</td><td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2.6H2O)</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מגנזיום כלוריד (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Bis(2-הידרוקסיאתיל)טאורין (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>פוספוקריאטין דיססודיום מלח הידרט (Na2PCr)</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית (C3H6O2)</td> <td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>צינור סחיטת סיליקון</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td> <td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton&reg; X-100 10%</td> <td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות (בקרת מנוע GKH GT)</td>בקר אורך <td>Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(דגם 315C-I)</td>מתמר כוח <td>מדעי</td><td></td><td></td>Aurora</tr><tr><td>(דגם 403 A)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sotware VSL (דגם 900B)</td><td>מיקרוסקופ הפוך מדעי</td><td></td><td></td>של אורורה</tr><tr><td>(IX51)</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

במאמר זה, אנו מתארים את הצעדים הנדרשים כדי לבודד קרדיומיוציט מחלחל יחיד ("עור") ולצרף אותו למנגן מדידת כוח ומנוע לבצע מחקרים פונקציונליים. מחקרים אלה יאפשרו מדידה של נוקשות קרדיומיוציט (כוח פסיבי) והפעלתו עם פתרונות שונים המכילים סידן (Ca2+) המכילים פתרונות כדי לקבוע, בין היתר: פיתוח כוח מקסימלי, myofilament Ca2 +רגישות (pCa50),שיתוף פעולה (nHill) ואת קצב פיתוח כוח (ktr). שיטה זו מאפשרת גם קביעת ההשפעות של תרופות הפועלות ישירות על myofilaments ועל הביטוי של חלבונים רקומביננטי אקסוגניים על תכונות אקטיביות ופסיביות של קרדיומיוציטים. קלינית, מחקרים קרדיומיוציטיים עור להדגיש את הפתופיזיולוגיה של מחלות שריר הלב רבות ולאפשר הערכה במבחנה של ההשפעה של התערבויות טיפוליות מיקוד myofilaments. בסך הכל, טכניקה זו מאפשרת בירור של פתופיזיולוגיה לבבית על ידי חקירת מתאמים בין פרמטרים במבחנה ו- in vivo במודלים של בעלי חיים ורקמות אנושיות המתקבלות במהלך ניתוח לב פתוח או השתלה.

פרוטוקול זה נועד לתאר צעד אחר צעד את הטכניקה של מיצוי והערכה של תפקוד הלב באמצעות cardiomyocytes עור. מתודולוגיה זו מאפשרת מדידה ואימודולציה חריפה של תפקוד myofilament באמצעות ביופסיות קפואות קטנות שניתן לאסוף ממקומות לב שונים, מעכברים לגברים.

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

טכניקה זו מאפשרת בירור הפתופיזיולוגיה של מחלות לב באמצעות חקירת המתאם בין פרמטרים in vitro ו-in vivo במודלים של בעלי חיים ובני אדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור את תפקוד השרירים העמוקים באמצעות ביופסיות קטנות מאוד או דגימות שאוחסנו קפואות. טכניקה זו מאפשרת להעריך במבחנה את ההשפעה של התערבויות טיפוליות על מיופילמנטים.לפני שתנסה ניסוי, רצוי לתרגל את מיצוי הקרדיומיוציטים מספר פעמים כדי ללמוד כיצד לבחור, להדביק ולהפעיל את הקרדיומיוציטים בגודל, פסים וצורה טובים. לפני תחילת ההליך, כוונן את הטמפרטורה של מנגנון הבדיקה בתא ל-15 מעלות צלזיוס והפעל את מתמר הכוח ואת המנוע. הפשירו שלושה עד חמישה מיקרוגרם של דגימת שריר הלב בצלחת פטרי המכילה 2.5 מיליליטר של תמיסת ISO מרגיעה והשתמשו באזמל כדי לחתוך במדויק את הרקמה לחתיכות קטנות מבלי לגרום נזק מיותר לתאים.לאחר שכל הרקמה נחתכה, השתמש בקצה פיפטה חתוך כדי להעביר את כל נפח התמיסה ושברי הרקמה לכוס Potter-Elvehjem והשתמש במטחנה כדי לשבש מכנית את הרקמה במהירות של 30 עד 40 סיבובים לדקה. כאשר הושג מתלה תאים טוב, הוסף 250 מיקרוליטר טריטון לצינור של 15 מיליליטר המכיל 2.25 מיליליטר ISO הרפיה והוסף את תרחיף התא לתמיסה המתקבלת. הפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים לערבוב ותן לצינור לשבת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, ולאחר מכן דגירה של ארבע דקות על קרח.בסוף הדגירה של הקרח, הביאו את הנפח הסופי של הצינור עד 15 מיליליטר עם ISO הרפיה נוסף וערבבו את הצינורות שלוש פעמים בהיפוך כפי שהודגם, ואז צנטריפוגה את התאים, ואז הסירו בזהירות כמעט את כל הנוזל מלבד שלושת המיליליטרים האחרונים של הסופרנטנט. לאחר השטיפה האחרונה, הסר את הסופרנטנט עד לנפח של חמישה עד 10 מיליליטר של תרחיף תאים. לבחירת קרדיומיוציטים עם עור, הוסף טיפה של מתלה תאים על כיסוי המונח על גבי שקופית זכוכית במחזיק שקופיות מיקרוסקופ הפוך והשתמש במטרה 20X כדי לבחור קרדיומיוציט בצורת מוט יחיד עם דפוס וגודל פסים טובים.השתמש בשתי ידיים כדי לסובב את הכיסוי עד שהקרדיומיוציט שנבחר ממוקם אופקית כשקצותיו מיושרים עם המחט של מתמר הכוח והמנוע והשתמש בקצה פיפטה כדי להניח קו דק של דבק לאורך הצד של הכיסוי. כדי להדביק את התא למקומו, טבלו את קצות המחט של מתמר הכוח והמנוע בקו הדבק כדי ליצור הילת דבק סביב שני הקצוות והזיזו במהירות את קצה המחט של מתמר הכוח כלפי מטה כך שהוא נדבק לקצה אחד של הקרדיומיוציטים. חזור על הליך זה עם קצה המנוע והגפה השנייה של התא.לאחר חמש עד שמונה דקות, הזז את שני המניפולטורים המיקרו בו זמנית כדי להרים את המחטים כ-15 מיקרומטר כדי למנוע הדבקת התא לכיסוי. כדי למדוד את הכוחות האקטיביים והפסיביים ואת רגישות הסידן, מלאו את באר הניסוי הראשונה ב-55 עד 100 מיקרוליטר של תמיסה מרגיעה ומלאו את באר הניסוי השנייה ב-55 עד 100 מיקרוליטר של תמיסה מפעילה. באמצעות תוכנת המצלמה, הגדר את אזור העניין לאזור של הקרדיומיוציט עם דפוס ברור של פסים והגדר את אורך הסרקום ל-2.2 מיקרומטר.מדוד את המרחק בין שני הקצוות של הקרדיומיוציט ורשום את הערך כאורך המיוציט בתוך התוכנה. לאחר מכן, הזיזו את המחטים מעט גבוה יותר והזיזו בעדינות את שלב המיקרוסקופ כך שהתא יעבור מהחלקה לבאר המכילה את התמיסה המרגיעה בגב הבמה. בחר את הפרוטוקול המכיל קיצור של שני תאים שיתרחש כאשר התא מופיע ברצף בתמיסות הסידן וההרגעה.כדי לעורר התכווצות איזומטרית, הזיזו את שלב המיקרוסקופ כך שהקרדיומיוציט יעבור מהתמיסה המרגיעה לתמיסה המפעילה. עם ההגעה למישור הכוח, התחל לרשום את נתוני הכוח. לאחר 10 שניות, העבר את התא לתמיסה המרגיעה ורשום את הנתונים עד להפסקת הבדיקה.כדי לקבוע את הרגישות לסידן, החלף את התמיסה המפעילה ב-55 עד 100 מיקרוליטר מכל תמיסת סידן ורשום את הנתונים כפי שהודגמו זה עתה. בתום המדידה, מתחו את קצות מתמר הכוח והמנוע כדי להוציא את המחטים מהתא והשתמשו בצמר גפן ספוג באצטון כדי להסיר בזהירות את הילת הדבק מקצות המחטים. למרות שצפויה מידה מסוימת של הידרדרות וירידה בכוח לאחר ניסויים ממושכים, ערכי המתח הפעיל בתוך הקרדיומיוציטים החדירים התפקודיים צריכים להיות יציבים יחסית.כאן, מוצגות עקבות כוח מייצג של שלוש מתוך שמונה הקלטות כוח הדרושות לביצוע פרוטוקול של רגישות לסידן מיופילמנט. על ידי העברת התא לבאר המכילה את התמיסה המפעילה, הקרדיומיוציטים מתחילים לפתח כוח עד שהם מגיעים למישור. לאחר בדיקת רפיון מהירה, ניתן להשיג את ערכי הבסיס של אפס כוח.ניתן להשתמש בשיפוע של החלק האחרון של עקומה זו כדי לקבוע את הערך של קצב התפתחות הכוח מחדש, שהוא מדד לקצב הנראה של חיבור וניתוק גשר צולב. לאחר העברת התא בחזרה לבאר המכילה את התמיסה המרגיעה, התא נרגע וכוחו יורד. בנוסף לרגישות הסידן של השריר ומדידות ההפעלה התלויות באורך, ניתן לחשב את תלות אורך הסרקומר של המתח הפסיבי ואת התלות באורך הסרקומר של הכוח המופעל בסידן לכל שטח חתך והמתח הבלתי תלוי בסידן.לבסוף, חשוב לציין כי האופן שבו הקרדיומיוציטים מבודדים משפיע באופן משמעותי על התוצאות. שימוש בקרדיומיוציטים עוריים להערכת תפקוד הלב במבחנה הוא טכניקה חשובה להבהרת השינויים המתרחשים ברמת התא וכן לחקר מנגנוני מיופילמנט במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. לשיטה זו יש יתרון בכך שהיא דורשת כמות מינימלית של דגימת שריר הלב ומאפשרת שימוש בקרדיומיוציטים ממגוון רחב של מינים, מיקומי לב ופתולוגיות.

in-vitro-assessment-of-cardiac-function-using-skinned-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

האפיקרדיום הוא מקור חיוני לתאי אב קרדיווסקולריים רב-פוטנטיים ולגורמים פרקריניים הנדרשים להתפתחות והתחדשות הלב וכלי הדם. אנו מתארים כאן שיטה לתרבית תאים אפיקרדיאליים עובריים של עכברים.

במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

אנו מציגים מודל של מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes נגזר תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם, יחד עם שיטה להערכה כמותית של נזק לרקמות הנגרמת על ידי איסכמיה. מודל זה יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.

מודל של מחלות לב איסכמיות והשוואה מבוססת וידאו של התכווצות קרדיומיוציטים באמצעות קרדיומיוציטים נגזר hiPSC

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

ניתוח השינויים בתפקוד ההתכווצות ובשלמות התאים של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי הוא בעל חשיבות עצומה לפיתוח תרופות לא קליניות. מערכת היברידית של 96 תאים מטפלת בשני הפרמטרים בזמן אמת ובאופן פיזיולוגי לקבלת תוצאות אמינות ורלוונטיות לבני אדם, הנחוצות למעבר בטוח לשלבים קליניים.

מערכת ניתוח תאים היברידית להערכת שינויים מבניים והתכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי להערכת סיכון לבבי פרה-קליני

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

כאן, אנו מדגימים שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CM), מצופות על מצע גמיש, יחד עם מיקרוסקופ מבוסס וידאו. כלי זה יהיה שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות התכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה לבבית.

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

למד הערכת תפקוד לב in vitro באמצעות קרדיומיוציטים עור מדגימות קטנות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תפקוד מיופילמנטים ורגישות סידן בביופסיות קפואות.

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

גלה סרטונים נוספים