הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

המשמעות של פרוטוקול זה היא שהוא מספק דרך חדשה להגביר את העמידות והצמיחה של נוירונים, גליה ותאי גזע במבחנה. זה ישים גם עבור תאים אחרים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא השימוש במטריצה העשויה משלד אלמוגים.

מטריצה זו מזינה ומגנה על תאי עצב והיא מקדמת צמיחה מחודשת. בהיותו תומך בתאים עצביים במבחנה, שלד האלמוגים עשוי לתפקד באופן דומה כשתל רגנרטיבי באתרי פגיעה מוחית. כדי להתחיל, השתמש בפטיש כדי לשבור את שלד האלמוגים, ולחלק אותו לשברים של 0.5 עד שני סנטימטרים.

על מנת להמיס שאריות אורגניות ולא אורגניות, יש להשרות את שברי שלד האלמוגים בתמיסת נתרן היפוכלוריט 10% למשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת במים מזוקקים כפולים. כדי להסיר את השאריות האורגניות שנותרו, יש להשרות את השברים בתמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת למשך חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת במים מזוקקים כפולים.

המשיכו בהסרת המשקעים האורגניים על ידי השריית השברים בתמיסת מי חמצן 30% למשך 10 דקות, ושטפו את השברים שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים. הסר כמה שיותר עודפי מים מזוקקים כפולים והשאיר את שברי האלמוגים במכסה המנוע לייבוש. לאחר מכן נקו את החלקות כיסוי הזכוכית על ידי השרייתם ב-10 מיליליטר של אתנול 95% בצלחת פטרי זכוכית של 100 מילימטר.

לאחר 15 דקות, הסר את האתנול ושטוף במים מזוקקים כפול שלוש פעמים, המתן 10 דקות בין כל שטיפה. מוציאים את המים המזוקקים הכפולים ומניחים את המנה על צלחת חימום שחוממת מראש של 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים בעדינות את החלקות הכיסוי עד שהמים המזוקקים הכפולים מתאדים.

חיטוי הכיסוי מחליק. טוחנים את שברי שלד האלמוגים בעזרת מכתש ועלי עד לפירוק מוחלט. מתקבלת תערובת של דגנים בגדלים הנעים בין 20 ל -200 מיקרומטר.

לחלופין, טוחנים את שברי שלד האלמוגים באמצעות מכונת השחזה חשמלית באורך להב של שישה סנטימטרים ורוחב של 0.5 עד סנטימטר, במהירות של 1000 סל"ד למשך 30 שניות. כדי לטהר את הגרגירים, העבירו את הגרגירים למסננת רשת מסנן חשמלית של 40 מיקרון. כוונן את הגדרות המסננת החשמלית לרעידות במהירות של 600 אמפליטודות לדקה, וקפיצה בשש פעמים בשנייה.

ואז חיטוי הגרגירים. בתנאים סטריליים, הוסיפו את גרגרי שלד האלמוגים לתוך 20 מיקרוגרם למיליליטר PDL, מומסים בתמיסה של האנק כדי להשיג ריכוז של חמישה מיליגרם או 10 מיליגרם גרגרים לתמיסת PDL של מיליליטר אחד. שופכים את התמיסה לצלוחיות וכלים בריכוז של כשני מיליליטר ל -25 סנטימטרים רבועים, ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

הגרגירים שוקעים ונצמדים לתחתית. למחרת, שטפו את הצלוחיות והכלים פעם אחת במים מזוקקים כפולים סטריליים. תן לצלוחיות ולכלים להתייבש במכסה המנוע.

כדי לצפות את כיסוי הזכוכית, הוסף תחילה גרגרי שלד אלמוגים למים מזוקקים כפולים בריכוז של חמישה או 10 מיליגרם למיליליטר. הנח את החלקות הכיסוי על צלחת חימום שחוממה מראש ל 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טפטפו 40 מיקרוליטר מתמיסת התבואה על מרכז החלקת הכיסוי, והמתינו 15 דקות לאידוי מלא.

זה יביא לכך שהגרגרים יידבקו להחלקת הכיסוי. אוטוקאב את החלקות הכיסוי המצופות, ואחסן בתנאים סטריליים. לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי על המכסה של צלחת סטרילית של 24 בארות, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם לתמיסת PDL של מיליליטר לכל החלקת כיסוי.

השתמש בקצה כדי להבטיח שהנוזל מכסה את כל אזור התבואה ואת שאר משטח ההחלקה של המכסה. מכסים את המכסה בתחתית הצלחת, ועוטפים את דפנות המקום בניילון פרפין. דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, שטפו את החלקות הכיסוי פעם אחת במים מזוקקים כפולים וייבשו במכסה המנוע. לאחר הכנת ראשי גורי חולדות, החזיקו אותו מהפה בעזרת פינצטה גדולה. חותכים את העור המכסה את הגולגולת במספריים קטנים.

עם מספריים נקיים, היכנסו מתחת לגולגולת בצד המוח הקטן וחתכו את הגולגולת ימינה ושמאלה כדי לאפשר את הסרתה. בעזרת פינצטה קטנה מקלפים את הגולגולת מהמוח. הפרד את המוח מהראש והכניס אותו לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר המכילה שני מיליליטר של MEM קר.

תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בשתי פינצטות קטנות כדי לנתח את ההיפוקמפוס. מעבירים את ההיפוקמפוס לכלי 35 מילימטר מוכן המכיל MEM. חותכים את ההיפוקמפוס לפרוסות של מילימטר אחד בעזרת האזמל.

הוסף 200 מיקרוליטר תמיסת טריפסין. מערבבים בעדינות ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס וחמישה עד 10% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר MEM קר למנה כדי להשבית את הטריפסין.

לאחר מכן השתמש בפיפטה פסטר מזכוכית בקוטר הגדול ביותר כדי להעביר את הרקמה הטריפסינית לשפופרת של 15 מיליליטר המכילה מיליליטר אחד של מדיום היום הראשון, שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. שלש את הרקמה על ידי העברתה דרך פיפטת הזכוכית בקוטר הגדול ביותר 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן חזור על תהליך זה באמצעות פיפטת הזכוכית בקוטר בינוני.

המשך לטריטורציה עם הפיפטה בקוטר הקטן ביותר. הימנע מבעבוע כדי להפחית את מוות התאים. תנו לחתיכות הרקמה המנותקות לשקוע במשך שתיים עד חמש דקות.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור נוסף של 15 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. כדי להשיג את צפיפות התאים העדיפה בין 200, 000 ל -400, 000 תאים למיליליטר.

יש להשתמש במדיום ביום הראשון כדי לדלל. לאחר מכן, זרע 100 מיקרוליטר תאים על כל החלקה של כיסוי זכוכית. הקפד לכסות את כל תלוש הכיסוי בתאים.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה עד 10% פחמן דו חמצני. למחרת, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום גידול עצבי לבארות. בעזרת פינצטה, הסר את מדיום היום הראשון על ידי הטיית פתק הכיסוי, והעברה עדינה של כל פתק כיסוי לבאר המתאימה לו.

שאב את שארית המדיה מהמכסה. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה עד 10% פחמן דו חמצני. שמרו על החממה לחה בצורה מקסימלית באמצעות מגש מים בתחתית החממה.

אין להחליף את המדיום. ניתן לשמור על תרבויות בתנאים אלה עד חודש. במחקר זה, מכונות טחינה ידנית וטחינה חשמלית הניבו שתיהן תוצאות דומות, עם תערובת של גרגרים בגודל של 20 עד 200 מיקרומטר.

המסננות הידניות או החשמליות ייצרו שני סוגים של תערובות דגנים. האחד עם גרגרים בגודל של 40 עד 200 מיקרומטר, והשני בגודל של 40 מיקרומטר או פחות. מיקרוגרפיות ניגודיות פאזה מראות כי גידול תאי היפוקמפוס על תלושי כיסוי המצופים בגרגרי שלד אלמוגים יצר רשתות עצביות מורכבות בהיעדר ונוכחות המטריצה.

צביעת גרעיני התאים הצביעה על כך ש-14 יום לאחר הזריעה, צפיפות התאים הייתה גבוהה יותר על המטריצה מאשר על החלקות הכיסוי הלא מצופות. צביעה עם חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות הראתה שנוצרה רשת עצבית ודנדריטית מורכבת על המטריצה בהשוואה לביקורת. בנוסף, תאי גליה שגדלו על מטריצת שלד האלמוגים שהודגמו באמצעות החלבון החומצי הסיבי של גליה עברו שינויים מורפולוגיים משמעותיים.

הם רכשו מראה קוצני יותר, עם תהליכים ארוכים יותר, מאשר תאי הגליה שגדלו על מצע הביקורת, שם הם נראו עגולים ושטוחים יותר. בזמן בידוד התאים, חשוב לזכור לעבוד מהר, לשמור על ה-pH על ידי הוספת CO2 במידת הצורך, ולעבוד בעדינות ככל האפשר על מנת למנוע ניתוק של גרגרי אלמוגים.