מעקב על תחמוצת ברזל פאראמגנטית-מתויג תאי גזע Mesenchymal באמצעות ה-MRI לאחר Intranasal משלוח ב מודל טראומטי פציעה במוח

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור משלוח של תאי גזע mesenchymal לא פולשנית (MSC) ומעקב במודל העכבר של פציעה מוחית טראומטית. ברזל פאראמגנטי תחמוצת הברזל מועסקים כהדמיה תהודה מגנטית (MRI) בדיקה עבור התיוג MSC ו פולשני ב vivo מעקב אחר משלוח intranasal באמצעות MRI בזמן אמת.

שיטה זו יכולה לעזור לקבוע את התפלגות הבסיס של תא הגזע הלוביטי לאחר לידה תוך-רנסאלית למוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המאפשר משלוח לא פולשני ומעקב אחר תאי גזע mesenchymal למוח. כמו כן, המינונים מרובים ניתן למקסם את ההשפעות הטיפוליות של התאים המושתלים בשלב הכרוני לאחר הפציעות.

טכניקה זו ממקסמת את מספר התאים המועברים לאתר הפציעה וממזערת את התקדמות התא הלוביטי לרקמות אחרות. למרות טכניקה זו מספקת תובנה על השימוש בתאי גזע mesenchymal בטיפולים פגיעה מוחית טראומטית, זה יכול לשמש גם לחקירה של פגיעות מוח לא טראומטיות. לתיוג תאי גזע מזנצ'ימליים עם תחמוצת ברזל סופר פרמגנטית, הוסיפו שישה מיליליטר של תיוג בינוני לתרבות תאי גזע מזנצ'ימלית 80% בבקבוק T 75 עבור דגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.

למחרת, בזהירות שאפו את הנאנט סופר ולשטוף את התאים פעמיים עם שישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. כדי לקבוע אם התאים תויגו בהצלחה, בדוק את התרבות תחת מיקרוסקופ פלורסנט. כדי לגרום לפציעה CCI, לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, להשתמש קוצץ אלקטרוני לגלח את הפרווה מפני הגב של הגולגולת, ולנקות את האזור מגולח מספר פעמים עם ספוג כותנה סטרילי ספוג יוד.

השתמש ספוגית כותנה ספוגה 70% אתנול כדי להסיר את היוד לאחר ספוגית האחרונה ולניח את החיה במסגרת סטראוטקטית. אבטחו את העכבר עם פסי האוזן והאף ובצעו חתך של 2.5 ס"מ באמצע הגולגולת בעור המגולח כדי לגשת לפני השטח של הגולגולת. השתמש כרית כותנה כדי להסיר את הרקמה המכסה את הגולגולת ולנקות את פני השטח של הגולגולת במשך 10 שניות עם ספוג כותנה ספוג 3% מי חמצן.

יבש את הגולגולת עם כרית כותנה טרייה ולהשתמש בעיפרון כדי לצייר עיגול ארבעה מילימטר סביב הקואורדינטות של בחירה על העצם החשופה. באמצעות מקדחה זעירה המצוידת בבור עגול בקוטר 0.5 מ"מ, מדלל בזהירות את הגולגולת במעגל המסומן מבלי להפעיל לחץ. הסר כל אבק עצמות עם ספוגית כותנה נקייה ויבשה ולהשתמש מטליות מתויק סטרילי להסיר בזהירות את דש העצם וכתוצאה מכך.

כאשר דורה מאטר נחשף, להעביר את העכבר לתוך המסגרת הסטראוטקטית של מכשיר CCI, ולאבטח את החיה עם פסי האוזן והאף, כך הראש הוא ברמה בכיוון rostrocaudal. בהתאם להוראות בתיבת הבקרה, אפס את קצה המשפיע למשטח קליפת המוח החשוף באמצעות גלגלי הבקרה X ו- Y בבסיס המשפיע כדי ליישר את קצה המשפיע ישירות מעל הקואורדינטות הרצויות של קליפת המוח שיש להשפיע עליהן. השתמש בתיבת הבקרה כדי להגדיר את פרמטרי הניסוי במהירות של חמישה מטרים לשנייה, זמן התעכבות של 250 אלפיות שנייה, ועומק פציעה של מילימטר אחד כדי לגרום לפציעה קלה.

לאחר מכן, לחץ על לחצן ההשפעה בתיבת הפקד. ספוגית כל דימום המתרחשת עם ספוגית כותנה סטרילית ולהסיר את העכבר מהמסגרת. סגור את החתך עם תפרים כירורגיים משי ולהחיל אנטיביוטיקה אקטואלי לאתר לפני הנחת העכבר על כרית חימום עם ניטור עד התחדשות מלאה.

יום אחד לאחר הפציעה, לטפל תחמוצת ברזל סופר paramagnetic שכותרתו תרבות תאי גזע mesenchymal עם שלושה מיליליטר של טריפסין. לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להתחיל את התגובה עם שבעה מיליליטר של מדיום DMEM מחומם מראש, בתוספת 10% סרום חזיר עוברי ולאסוף את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב PBS לספירה.

לאחר מכן, להתאים את ריכוז התאים ל 1.5 פעמים 10 לחמשת התאים לכל 18 microliters של PBS. למשלוח תאים, לאחר שאישר את חוסר התגובה לצביטת בוהן, גרד את העכבר תוך כדי שתק את הגולגולת. מניחים את קצה פיפטה המכיל ארבע יחידות של hyaluronidase לכל microliter של PBS ליד nare של העכבר בזווית של 45 מעלות, ולנהל שלושה microliters של המתלה היאלואורונידס לתוך כל נחיר.

מניחים את החיה עם הפנים כלפי מעלה על כרית נקייה במשך חמש דקות לפני החזרה על הטיפול ארבע פעמים עבור סך של 100 יחידות של טיפול hyaluronidase. לאחר הטיפול האחרון, מניחים את העכבר בחזרה על כרית במשך 30 דקות, לפני מרסן את העכבר כפי שהוכח רק. עם הראש משותק, לנהל שלושה microliters של ההשעיה תא גזע mesenchymal לתוך כל נחיר על פני תקופה של שלוש שניות לכל משלוח פתרון, מחזיק את העכבר בעמדה במשך 30 שניות עד טיפות המדגם נעלמו לחלוטין.

לאחר שתי דקות, לחזור על המסירה עד שלוש פעמים עד כל נפח של תא גזע mesenchymal נמסר. לאחר מכן, להחזיר את העכבר לכלוב שלה עם ניטור עד חקירה מלאה. כדי לעקוב אחר הנדידה של תאי גזע mesenchymal על ידי MRI, למקם את העכבר הרדמה על מחזיק ההדמיה של התמונה MR.

לאחר מכן, אבטחו את החיה במקום והזיזו את המחזיק למרכז סליל ה-MRI. הגדר את זמן החזרה ל- 1500 אלפיות שניה ואת זמן ההד ל- 2.8 אלפיות שניה. לאחר מכן, הגדר את שדה הצפייה ל-16 על 16 מילימטרים, את מטריצת הרכישה ל- 128 על 128 ואת עובי הפרוסה ל- 0.75 על 0.8 מילימטרים עם ארבעה ממוצעי אותות וזווית היפוך של 90 מעלות לרכישת סריקות משוקלללות של כוכב T2 באמצעות רצף הד ספין.

לאחר השלמת הסריקות, לסגת מחזיק העכבר ממרכז סליל MRI, ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה עם ניטור עד שליטה מלאה. כדי לעקוב אחר תאי הגזע הקסנצ'ימליים המסומן ולמת אותם בתמונות משוקלללות של כוכב T2, פתח את הנתונים בתוכנת ההצמדה של מארז IT ובחר תווית פעילה. כדי ליצור פילוחים של אזורי hypointense ואת הנגע או חלקים אחרים במוח של עניין, באמצעות צבעי תווית שונים עבור כל מקטע.

השתמש בכלי מצולע ב סרגל הכלים הראשי כדי לבחור את אזורי hypointense המייצגים את תחמוצת ברזל סופר paramagnetic שכותרתו תאי גזע mesenchymal ולחץ לקבל. האזורים המפולחים יופיעו באותו צבע כמו התווית הפעילה שהוקצתה למקטע מסוים זה. כאשר כל הפרוסות כבר מפולח, להשתמש בכלי אזמל לפתח מפה 3D של האזורים מפולחים כדי לייצג את התפלגות תאי גזע mesenchymal במוח כולו.

כדי לבצע ניתוח כמותי של ממוצע הנפח והעוצמה של אזורי hypointense המסוקרים המייצגים את התאים המסווים בתווית, לחץ על פילוח ובחר נפח וסטטיסטיקה. 24 שעות לאחר הלידה ההפונסיאלית, תחמוצת ברזל סופר paramagnetic שכותרתו תאי גזע mesenchymal מזוהים כמו אזורי hypointense חזקים המדיאליים לפציעה קליפת המוח על T2 כוכב משוקלל תמונות, המציין את הנדידה הממוקדת של תחמוצת ברזל סופר paramagnetic לאתר הפציעה. העברה זו נשארת גלויה עד 14 יום לאחר המסירה ללא כל הפחתה ניכרת באות.

בעלי חיים פצועים שטופלו ב- PBS אינם מציגים אזורי hypointense בשום שלב, מה שמצביע על כך שאזורי ההיפוינטנס שנצפו תואמים לתחמוצת הברזל הסופר-פרמגנטית המסומן בתאי גזע מזנצ'ימליים, והם אינם נובעים מחפצים מאותתים. ניתן לדמיין את ההפצה הביולוגית של תאי הגזע המזנצ'ימליים המסומנים באמצעות שחזור תלת-מימדי, היסטולוגית על ידי כתמים כחולים פרוסיים, או על ידי גילוי פלוארסנס של FITC שתייג תחמוצת ברזל סופר פרמגנטית בתוך תאי הגזע המזנצ'ימליים המסומנים. הקפד לאמת את תוצאות ה- MRI באמצעות esthology או שיטות אחרות.

כמו חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטי סופר יכול להישאר ברקמות לאחר התא מת, המוביל אותות חיוביים כוזבים. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מעקב לא פולשני מזגי לכמות כדי לענות על שאלות לגבי התחדדות היכולות ושמירה של תאי גזע mesenchymal במוח. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור שיטות לשיפור התחדדות התאים לאזורים מסוימים במוח.