שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

זה שחפת מולקולרית בקטריאלי Assay, עונה על שלוש שאלות מפתח. אחד: מהו גודל נטל המחלה של המטופל? שתיים:כיצד מגיב נטל המחלה החולה לתרופה נגד שחפת?

ושלוש:מה הקשר בין נטל המחלה לתגובת הטיפול? מבחן זה מייצר תוצאה כמותית של נטל השחפת החולה, ומודד כיצד נטל זה משתנה עם הטיפול בזמן קצר. עם שינוי, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על פתוגנים חיידקיים אחרים.

כבר פיתחנו טכנולוגיה דומה לאבחון של מיקובקטריה לא-תותית, וחיידקים הקשורים למחלת ריאות חסימתית כרונית. בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, צפה בסרטון ותרגל את השלבים. חשוב מאוד להתאמן עם דגימות כי אינם נחוצים לתוצאות אבחון המטופל.

הדגמה חזותית היא קריטית משום שהיא מפשטת את הלמידה ואת השליטה בשלבים, במיוחד בחלקים אלה של השיטה שקשה להסביר בטקסט. התחל בהכנת תרבות התאים. על ספסל מעבדה נקי או בקתה אחת בכיתה, לקצור aliquots מיליליטר אחד של שלב אקספוננציאלי Bacille Calmette-Guerin או תרבות BCG לתוך צינורות פלסטיק 15 מיליליטר ולסגור אותם בחוזקה.

בעת הכנת דגימות כיח של המטופל, לעבוד בחלל מאוורר היטב ופעל לפי ההנחיות במדריך GL One Stop TB. בזהירות לפתוח את הדגימה ואת פיפטה aliquots מיליליטר לתוך צינורות צנטריפוגה פלסטיק 15 מיליליטר. לאחר מכן, סגור היטב את הצינורות.

מעבירים את צינורות הדגימה למדף מחזיק שקוע באמבט מים שחומם מראש ל-95 מעלות צלזיוס, ומוודאים ש-3/4 מכל צינור שקוע. מרתיחים את הדגימות במשך 20 דקות. לאחר מכן, להעביר את הצינורות לספסל להתקרר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

בצע מיצוי RNA במכסה המנוע אדים אם באמצעות ערכה עם פנול כלורופורם או אתנול הון הגידול. הליך ה-RNA המאויר כאן הוא הליך החילוץ של פנול כלורופורם. עם זאת, שיטות חלופיות עבור מיצוי RNA ניתן להשתמש גם.

מעבירים מיליליטר אחד של דגימת החום המנוטרל ל-1.5 צינורות מיליליטר ומעבירים 100 מיקרוליטרים של בקרת מיצוי לכל דגימה. סוגרים את הצינורות ומערבבים אותם על ידי היפוך שלוש פעמים. צנטריפוגה הצינורות ב 20, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות.

לאחר מכן, שאפו את העל-טבעי, והשאירו 50 מיקרוליטרים של מעים. אנחנו להשעות את המעים ב 950 microliters של חיץ תיזה על ידי צינורות ולהעביר את כל ההשעיה לתוך צינורות מטריצת lysing המסופקים עם ערכת החילוץ RNA. סגור היטב את הצינורות וודא שהם מסומנים הן על המכסה והן על הצד.

לאחר מכן, הומוגניזציה הדגימות במשך 40 שניות ב 6, 000 סל"ד. צנטריפוגה ליאזט ב 12, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להכין צינורות מיליליטר טריים, ולהוסיף 300 microliters של כלורופורם.

השתמש פיפט מיליליטר אחד כדי לשאוף בזהירות את supernatant מבלי לגעת מטריצת lysing ולהעביר אותו לצינור עם כלורופורם. מערבולת הצינורות במשך חמש שניות ולהשאיר אותם להסתפק במשך חמש דקות או עד שלושה שלבים גלויים בבירור. צנטריפוגה הצינורות ב 12, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות.

לאחר מכן, בזהירות pipette השלב העליון ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של קרח קר 100% אתנול לדגימה, סוגרים את הצינור, והפוך אותו שלוש פעמים כדי לערבב. דגירה הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן, לטעון את הצינורות לתוך צנטריפוגה מיקרו מקורר מראש צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 70% אתנול קר כקרח וצנטריפוגה לעוד 10 דקות ב-13,000 פעמים גרם. השלך את כל העל-טבעי.

ו דגירה הצינורות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לייבש את גלולת חומצת הגרעין, הקפד לשמור על הצינורות פתוחים חלקית כדי לאפשר אידוי של אתנול. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של מים ללא גרעין לכדור ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. Vortex את הדגימה במשך שלוש שניות ולהמשיך עם הסרת DNA או לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.

תמהיל אחד של DNA מוכן על פי הוראות כתב היד ופיגט 11 microliters לתוך כל צינור המכיל תמצית RNA. מערבולת במשך שלוש שניות ולהסתובב למטה לזמן קצר כדי להסיר את כל טיפות מקיר הצינור. לאחר מכן, חופרים את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בבלוק חם או אינקובטור.

לאחר הדגירה, מוסיפים מיקרוליטר אחד נוסף של האנזים היחיד של הדנ"א ישירות לצינור, ומערבבים היטב על ידי מערבולת. לאחר מכן, הדגירה את הצינורות עוד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להפשיר ולמערבולת את ההפשרה של הדנ"א.

לאחר מכן, להוסיף 10 microliters לכל תמצית RNA. ולהדרור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבולת הצינורות שלוש פעמים במהלך שלב הדגירה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב 13, 000 פעמים גרם במשך שתי דקות בזהירות להעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר RNA חינם, הקפדה לא לגעת בכל מטריצת איון. לדלל את כל דגימות RNA לא ידוע אחד עד 10 במים החופשיים של RNA אז, לערבב אותם על ידי מערבולת במשך חמש שניות ולסובב אותם לזמן קצר למטה. להפשיר דגימות MTB ו- EC-RNA ולעשות שבעה ושישה דילולים פי עשרה בהתאמה עבור עקומה סטנדרטית.

הכן RT פלוס RT מינוס PCR מאסטר מתערבב בהתאם לכיווני כתב היד. Vortex RT פלוס לערבב ולהעביר 16 microliters לתוך כל RT בתוספת צינור PCR. לאחר מכן, מערבולת RT מינוס לערבב ולהוסיף 16 microliters לתוך כל צינור RT מינוס PCR.

הוסף ארבעה microliters של תמצית RNA או מים לשכפל RT בתוספת צינורות. המים הם פקד שאינו תבנית או NTC. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמצית RNA או מים לצינורות RT מינוס.

לטעון את צינורות התגובה לתוך מכונת PCR בזמן אמת, לתכנת את התגובה כמתואר בכתב היד ולהפעיל את התגובה. כדי לפרש את תגובת הטיפול, השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי להמיר ערכי CQ לעומס חיידקי ולחשב את התגובה כשינוי בעומס החיידקים לאורך תקופת המעקב הטיפולית. הנפילה בעומס החיידקים לאחר הטיפול מסמלת תגובה חיובית בעוד שאין שינוי או עלייה בעומס החיידקים מרמז על תגובה שלילית.

כדי לוודא כי כל Bacilli שחפת היו חום מושבת, צפיפות אופטית של התאים נמדדה בהשוואה לזה של תאים חיים. לא נצפה שינוי ב- OD לאורך זמן עבור דגימות בלתי פעילות חום המציין אין צמיחה. דגימות חום מושבתות היו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקבוע אם RNA משפיל בעקבות איון חום של תאים.

לא נמצא הבדל בין ה-RNA שנקטף מיד לאחר אי-הפעלת החום, לבין ה-RNA שבודד אחד, שניים, שלושה וארבעה ימים לאחר מכן הן בתרבויות BCG והן בליח חיובי של TB. כאשר אנזים A של RNA נוסף באופן אקסוגני לדגימות, לפני ואחרי איון חום, אובדן RNA התרחש בכל דגימות חום מושבת על פני ארבעה ימים של דגירה. ההשפעה של איון חום על RNA ריבוזומלי נמדדה בתרבויות BCG וליטם מחולים חיוביים TB.

העומס החיידקי הנמדד של תרבות הבקרה היה גבוה יותר מעומס החיידקים המשולב של חום מושבת ב 80 מעלות צלזיוס, 85 מעלות צלזיוס, ו 95 מעלות צלזיוס עבור דגימות BCG וליטם. איון חום של הדגימות גורם לאובדן מינימלי של RNA, משאיר RNA נאותה עבור TB-MBLA במורד הזרם ובדיקות מולקולריות במורד הזרם. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור שימש כדי לחקור אם תאים lysed על ידי איון חום.

בדיקה של התאים בהגדלה נמוכה וגובה יותר חשפה את קירות התאים שלמים ואת גופי השומנים התאיים הנראים לעין. התאים נראו מוארכים, אבל לא lysed. בעת ניסיון הליך זה, זה קריטי לזכור להוסיף את בקרת החילוץ, אשר שולט על כל תוצאות שליליות שווא עקב מיצוי RNA לקוי.

גישה זו יכולה להיות מיושמת על חיידקים הקשורים למחלת ריאות חסימתית כרונית, זיהום mycobacteria nontuberculous, ופתוגנים נשימתיים אחרים. התוצאות הכמותיות של שחפת-MBLA אפשרו מודלים מתמטיים ופרמקו של איך חולים מגיבים לטיפול בשחפת. אנו מצפים ליישם את הטכניקה בטיפול שגרתי שבו חולי שחפת מנוהלים.