שימוש Tg (Vtg1: mcherry) עוברי דג Zebrafish כדי לבדוק את ההשפעות אסטרוגניים של תרכובות משבשי האנדוקרינית

יש מספר גבוה של כימיקלים EDC בסביבה שלנו, בעיקר חומרים אסטרוגניים. המגוון הכימי של החומרים השייכים לקבוצה מקשה על הבדיקה שלהם, כיוון שנדרשות שיטות שונות לגילוים. בהתבסס על המבנה הכימי, זה באמת קשה לקבוע אם חומר הוא למעשה מסוגל לעבוד כמו אסטרוגן.

בנוסף, חומרים אלה לעולם אינם נוכחים בצורה טהורה בסביבה, ולכן ההשפעות שלהם עשויים להיות מושפעים תרכובות אחרות, מדי. בעיה זו נפתרת על ידי שיטות דיאלקטציה אפקט כגון השימוש בביומוניטור, אורגניזמים ביו-אינדיקטורים מראים אפקט אסטרוגן. ידוע כי גנים מסוימים מגיבים ברגישות לאסטרוגן באורגניזמים חיים.

זיהוי של מוצרי גנים בשיטות מולקולריות אפשרי גם ברמת החלבון או mRNA, אך בדרך כלל כרוך בהקרבת בעלי חיים. חוקי ההגנה על בעלי חיים מחמירים, ויש ביקוש גובר למערכות בדיקה חלופיות. טכנולוגיות חוצות גנטיות מייצגות את האפשרות עם התפתחות זו ועם גילוי חלבונים פלואורסצנטיים, הדרך ליצירת סמן ביולוגי נסללה.

בעזרת הפעלה כזו של גנים רגישים לאסטרוגן ניתן לבדוק ב vivo. בסרטון זה, שיטה אפשרית לשימוש vtg:1mCherry עוברי זברה-דג הטרנסג'נדר מוצג לבדיקה של חומרים אסטרוגניים בעזרת שתי תרכובות. הפרוטוקול יכול לשמש רקע לחקר אפקט האסטרוגן של דגימות כימיות או סביבתיות שונות על עוברי סמן ביולוגי.

קו דג הזברה המשמש בניסויים שלנו הוא קו דגי זברה מהוונגיניים של כתב ויטלוגנין. הקו נוצר באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. המבנה הטרנסג'יני המשמש לפיתוח נשא את רצף האמרגן הטבעי הארוך vitellogenin-1, עם מספר גבוה של צדדים ERI.

הביטוי של אות הפלואורסצנטי בנקבה הבוגרת מינית הוא מתמשך. עם זאת, אצל גברים בעוברים, זה מופיע רק על ידי פעולה או נוכחות של חומרים אסטרוגניים, ולכן האחרון מתאימים יותר לבדיקה. הרגישות וה השימושיות של העוברים של הקו נבדקו על מספר תרכובות אסטרוגניים, כמו גם על דגימות סביבתיות.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי חוק צער בעלי חיים בהונגריה וכל המחקרים הושלמו לפני שבעלי החיים הגיעו לשלב האכלה חופשית. ממלאים את מיכלי ההזדווגות במים מערכתיים ומגדירים את הדגים להזדווגות לפני קצירת הביצים. מניחים דגים זכרים ונוודים במיכל, ומפרידים אותם בעזרת מחיצה.

הסר את המפריד מהמיכלים כשהאור נכבה למחרת בבוקר. בדוק את מיכלי ההזדווגות לביצים כל 15 עד 20 דקות. לקצור את כל העוברים באמצעות מסננת תה, או ארוג בצפיפות, רשת עדין, ולשלב אותם לתוך צלחת פטרי אחת גדולה עם חיץ E3, או מים צלולים במערכת.

מניחים את העוברים באינקובטורים שנקבעו ל-25.5 מעלות צלזיוס. אחת עד שעה וחצי לאחר מכן, להסיר ולהשליך ביצים לא מופרות, או מחולקות כראוי עם פיפטה העברת פלסטיק תחת מיקרוסקופ מנתח. מניחים את העוברים שנבחרו בכלי הטיפול, למשל בצלחות פטרי או צלחות תרבות רקמות, שכבר תויגו והתמלאו בריכוזים שונים של חומר הבדיקה.

הדגירה את העוברים ב 25.5 מעלות צלזיוס עד סוף הניסוי. רענן את פתרון הבדיקה במידת הצורך על מנת לשמור על ריכוז הטיפול. היזהר בעת שינוי פתרון הבדיקה, על מנת למנוע פגיעה בעוברים.

הכן ארבעה אחוזים מטוסלאדוז עם ms 222 מראש. מניחים את הזחלים בני חמשת הימים לתוך צלחת פטרי חמישה סנטימטרים לכל קבוצת טיפול עם פיפטה פלסטיק. הסר את פתרון הטיפול מן הזחלים עם פיפטה פלסטיק, ולאחר מכן למלא את צלחת פטרי עם שני מיליליטר של 0.02 אחוז ms 222 פתרון הרדמה.

מלאו כל ריבוע של צלחת פטרי מעוצבת במיוחד ב-10 ס"מ עם ארבעה אחוזים מתוסלאדוז ms 222. מעבירים את הזחלים הרדמה למתוסלאדוז עם מעט מים באחד משני הריבועים. מהכיכר הראשונה, מעבירים את הזחלים לכיכר השנייה.

בריבוע השני, לסובב ולכוון זחלים לצד שמאל שלהם בעדינות ללחוץ אותם למטה לתחתית עם קצה פיפטה microloader לחתוך עד שני סנטימטרים. על מנת להעריך את האות של הכתב המובע, תדמיין את העוברים באותה תצוגה והגדרות. מניחים את צלחת פטרי על הבמה של המיקרוסקופ.

התמקד בכבד של העובר, וללכוד תמונת שדה בהיר באמצעות התוכנה הקשורה. העבר את המיקרוסקופ למסנן mCherry, וצלם תמונה פלורסנטית של הכבד תחת אור פלואורסצנטי באמצעות התוכנה הקשורה. חזור על שני השלבים הקודמים עד שתפסת את כל העוברים בניסוי.

פתח את ImageJ ולאחר מכן העלה את התמונה הפלואורסצנטיה כדי לנתח אותה על-ידי גרירה ושחרור של התמונה, או לחיצה על קובץ פתוח. לחץ על תמונה, צבע, פיצול ערוצים כדי לפצל את התמונה שנעשו על ידי המסנן florescent על פי תרשים צבע RGB. עבוד עם ספקטרום התמונות של הערוץ האדום.

סגור את הערוצים האחרים. ייעוד אזור אליפטי בגודל דומה בתמונה, כך אותות מלאים אינם מפריעים להערכה. באמצעות הכלים אליפסה לצייר אליפסה מעל אזור הכבד מודגש במדויק ככל האפשר.

אם האות חלש, השתמש בתמונות מיקרוסקופיות בהירות, זוג השדות הבהירים של התמונה הפלואורסצנטית, כדי לקבוע את מיקום הכבד. לחץ על נתח, למדוד, כדי לקבוע את עוצמת האות ואת גודל האזור שהשפיע. ערך הצפיפות המשולב מחושב באופן אוטומטי על-ידי עמודת התוכנה בתרשים.

המשך את הניתוח על ידי חזרה על השלבים הקודמים עד שתנתח את כל תמונות הפלואורסצנטיות של כל העוברים בקבוצת הטיפול. שמור את הנתונים ולאחר מכן נתח את ערכי הצפיפות המשולבים. בניסוי טופלו עוברים רגישים לאסטרוגן של קו הזברה-דגי הסמן הביולוגי בריכוזים של 0.5 ושמונה מיקרומולים של אלפא ובטא-זארנול, או ZOL, להפריה עד גיל חמישה ימים.

חקרנו אם אותות פלורסנט מופיעים בכבד הדג עד סוף הניסוי עקב חומרים, והאם יש הבדלים באסטרוגניות של שני החומרים. התוצאות הוערכו על בסיס תמונות פלואורסצנטיות וערכי צפיפות משולבים. במקרה של אלפא-זול, בריכוז המבחן הגבוה ביותר, כל האנשים מתו.

אז במקרה הזה לא ניתן היה לבחון את אות הפלואורסצנטי. בריכוזים נמוכים יותר, אות פלואורסצנטי חזק ניתן לראות בכבד של העובר. ללא הבדל משמעותי בחוזק האות הפלואורסצנטי ובגודל האזורים המוארים.

כמו כן, לא היה הבדל משמעותי בין ערכי הצפיפות המשולבים לבין הטיפולים. לא הייתה תמותה במהלך הטיפול בבטא-זול. החומר גרם לפעילות טרנסג'נדרית בכל ריכוזי הטיפול.

העלייה בעוצמת האות הפלואורסצנטי, וגודל האזור המואר ניתן לראות בתמונות הפלואורסצנטיות ככל שהריכוז עולה. על ידי בחינת הערכים המשולבים של ביתא-ZOL, שינוי זה יכול להתגלות גם. ערך הצפיפות המשולבת הממוצע כמעט מכפיל את עצמו בין ריכוזי הטיפול הנמוכים ביותר לריכוזי הטיפול הגבוהים ביותר.

עם זאת, במקרה של בטא-זול, לא מצאנו הבדל משמעותי בין ערכי הצפיפות המשולבים של ריכוזים בודדים. על ידי בחינת ערכי הצפיפות המשולבים המתקבלים מאותם ריכוזי טיפול של שני החומרים, ניתן לומר כי אלפא-זול נתן ממוצעי צפיפות משולבת גבוהים יותר בכל מקרה ביחס לבטא-זול, אשר עולה בקנה אחד עם ההבדלים בין חוזק האות שנצפה בתמונות פלואורסצנטיות. זה הבדלים עם משמעותי בכל הריכוזים.

השימוש בביואינדיקטורים להשפעות אסטרוגן מתפשט במחקרים טוקסיקולוגיים. מספר קווים מהו מהודרים המראים אפקטים אסטרוגן הופקו גם דגי זברה, אשר vtg:1mCherry שימש במחקרים שלנו. השיטה המתוארת כאן ממחישה פרוטוקול אפשרי לבדיקת עוברים של קו זה, על מנת לאפשר זיהוי vivo של פעילות אסטרוגן במקרה של סוכנים טהורים.

חשוב לציין כי במקרה של עוברים, הביטוי של הטרנסג'ין, בדומה לייצור ויטלוגנין אנדוגני, מראה פיזור גדול, ויש לקחת בחשבון הבדלים ברגישות הפרט בעת תכנון ניסויים. היבט חשוב בקביעת ריכוזי הטיפול הוא שתאי עוברים, כולל תאי כבד, עלולים להיפגע מריכוזים גבוהים יותר של חומרים רעילים מאוד, מה שעלול להוביל לירידה בהטבת ויטלוגנין. לכן בדיקות צריך להתבצע בריכוזים מתחת L-C 10.

ניתן לשנות פרוטוקול זה בנקודות רבות בהתאם לנקודות הקצה המתוכננות של הבדיקה, ולדגימות אשר עומדות להיבדק. זה יכול להסתיים עם שיטות בדיקה אחרות, למשל שיטות מולקולריות. לכן, אנו מקווים כי השימוש בקו vtg:1mCherry יופיע כמודל של בדיקות אסטרוגניות ועשוי גם להיות מודל לשיטות בדיקה סטנדרטיות.