תרבות, מניפולציה, והשתלת אורתוגרטופית של שלפוחית השתן של העכבר הגידול אורגנואידים

אורגנואידים הגידול שימשו באופן נרחב כמודל לסרטן במבחנה ללמוד ביולוגיה של הגידול. הפרוטוקול שלנו מספק הליך מפורט לבידוד, תרבות ותמרון גנטי של אורגנואידים של גידולים בשלפוחית השתן המשמשים ככלי קריטי לחקר היבטים שונים בביולוגיה של הסרטן. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנחנו יכולים לתפעל גנטית את האורגנואידים גידול שלפוחית השתן להביע או לדפוק את הגן של העניין שלנו.

כמו כן, בשיטת ההשתלה האורתוטופית שלנו, אנו יכולים ליצור אורגנואידים גידול microenvironment גידול שלם. הדגמת ההליך תהיה יובין קים, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. התחל על ידי הקמת אורגנואידים גידול שלפוחית השתן מהגידול בשלפוחית השתן מורין.

הוסף מיליליטר אחד של 10 מילימולרים HEPES ב DMEM שברי הגידול טחון את הרקמה עם סכין גילוח מעוקר. כדי לנטרל את השברים לתוך ההשעיה התא, להוסיף תשעה מיליליטר של DMEM עם HEPES, קולגנס סוג אחד ושתיים, תרמוליצין לחתיכות הגידול, ולהדגר אותם במשך 1.5 עד שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני על שייקר מסלולית. לאחר הדגירה, להעביר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר.

צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושואפים את העל טבעי. תן שימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ LYSING ACK ותדמה את הצינור בטמפרטורת החדר במשך שלוש עד חמש דקות כדי lyse כל תאי הדם האדומים. בינתיים, מצפים באר בצלחת 24 באר עם 150 microliters של גורם גדילה קר קרח מופחת מטריצת קרום מרתף ולהציב את הצלחת באינקובטור במשך 30 דקות.

הוסף 20 מיליליטר של DMEM לתוך הצינור עם התאים וחזור על הצנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי והשקיעו שוב את גלולת הכדור במיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA ו-10 מיקרומולרים Y-27632 דיהידרוכלוריד. דגירה הצינור במשך חמש דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM עם 10%FBS. לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חדש 50 מיליליטר כדי להסיר פסולת מעוכל. צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושואפים את העל טבעי.

לאחר מכן תן שימוש חוזר את גלולה עם מיליליטר אחד של DMEM ו לספור את התאים עם המוציטמטר. מעבירים פי 3 עד 4 10 לארבעת תאי הגידול למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר על קרח ומעבירים אותו פי 400 למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב-500 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי לפני המלחמה ו-10 מיקרומולרים Y-27632.

מעבירים את מתלי התא למטריצת הממברנה שהוכנה בעבר מצופה היטב ומציבים את צלחת 24 הבאר בחזרה לתוך החממה. החלף את המדיום כל יומיים ב-500 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי לפני המלחמה. לפצל את האורגנואידים הגידול 12 שעות לפני ההעתקה לנטיוירוס מתווך.

למחרת, הפשיר במהירות וירוס המכיל aliquot באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף את הנגיף המופשר ל-250 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי עם 10 מיקרומולרים Y-27632 ושמונה מיקרוגרם למיליליטר של הקסאדימתרין ברומיד. החלף את המדיום האורגנואידי בצלחת 24 באר עם 500 microliters של הנגיף המכיל בינוני דגירה את הצלחת במשך 12 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

כדי להכין את האורגנואידים גידול שלפוחית השתן להשתלה אורתוטופית, להוסיף 500 microliters של קולגן להתנתק למדיום organoid בצלחת 24 היטב. פיפטה מטריצת קרום המרתף ואת המדיום למעלה ולמטה ואז להידגר את הצלחת במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לאסוף את התאים לתוך צינור 15 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטר של DMEM טרום המלחמה.

ואז צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושואפים את supernatant. תן שוב את גלולה עם מיליליטר אחד של DMEM ולהעביר את הפתרון לצלחת פטרי 90 מילימטר. תחת מיקרוסקופ, להרים 10 עד 100 אורגנואידים גידול עם פיפטה P200 ולאסוף אותם לתוך microtube על קרח.

צנטריפוגה microtube ולהסיר בזהירות את supernatant. ואז לשמור על גלולה על קרח עד העכברים מוכנים לניתוח. לפני השתלת קיר שלפוחית השתן submucosal, לשמור על המזרקים, טיפים פיפטה, מטריצת קרום מרתף על הקרח עד מוכן לשימוש.

לאחר שהעכבר עבר הרדמה, הניחו אותו בתמרורית סופית ותחזקו הרדמה על ידי שאיפת מסכה של 2% איזופלורן מאויד. החל יוד povidone עם גזה סטרילית ולנגב אותו עם 70% אתנול. הפוך חתך רוחבי קטן בעור ובקיר השרירי של הבטן הימנית התחתונה עם מספריים כירורגיים סטריליים.

חשוף את שלפוחית השתן מחלל הבטן ותמוך בה עם צמר גפן ספוג מלוחים. השתמשו מחדש את כדורי האורגנואידים ב-80 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי המכיל מטריצת קרום מרתף בריכוז גבוה ב-50%, והזריקו את ההשעיה להיבט קדמי של כיפת שלפוחית השתן באמצעות מזרק האינסולין. סגור את החתך עם תפר ניילון 4-0 ולחטא את האתר הכירורגי עם יוד povidone ו 70% אתנול.

אפשר לעכבר להתאושש תחת הקרנה אינפרא אדום במשך 10 עד 15 דקות. ואז לפקח על העכבר שוב עד שהוא חוזר להכרה. אורגנואידים גידול שלפוחית השתן של העכבר הוקמו ותרבת במשך תשעה ימים.

אם תאים סרטניים אינם יוצרים אורגנואידים סרטניים, הם נהרגו במהלך שלב הדיסוציאציה ותזמן העיכול האנזימטי עשוי להיות מותאם. אורגנואידים גידול שלפוחית השתן הפגינו אותות GFP חזקים עם זיהום lentiviral מוצלח. לאחר הריכוז, סך של 250 microliters של וירוס המכיל מדיה היה מספיק כדי להדביק 30, 000 תאים סרטניים בודדים על מטריצת קרום המרתף ולשמור על יעילות זיהום 90 עד 100%.

אלוגרפיות גידול שלפוחית השתן נקצרו שלושה שבועות לאחר השתלה אורתוטופית וההיסטולוגיה של הגידול נותחה באמצעות כתמי H&E. השתלות אורתוטופיות של אורגנואידים סרטניים יכולות לגדול כגידולים בשלפוחית השתן למשך שבועיים עד שלושה שבועות. בעקבות הליך זה, חוקרים יכולים לבצע אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים הגידול וכתוצאה מכך או לבצע RT-PCR כמותי עבור גנים של עניין.

ניסויים אלה יכולים לאפיין עוד יותר את האורגנואידים הגידוליים. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לתפעל את הגנים בתאי סרטן בקלות בהשוואה למודל העכבר תוך שמירה על מאפייני vivo של גידולים על מנת לחקור את הפונקציות הספציפיות של גנים שונים המעורבים tumorigenesis של סרטן שלפוחית השתן.