באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

פרוטוקול זה מתאר תרבות של תאי מעיים עובריים של העכבר כי הוא מתאים ביותר כדי להשיג התבגרות לשלב למבוגרים במבחנה. גישה זו במבחנה יכולה לשמש לחקר מנגנונים מולקולריים של מעבר יונק לשעבר, כמו גם אפנונים של תהליך זה ולהשיג שימוש יעיל יותר בבעלי חיים ניסיוניים. זה חיוני עבור מודל זה במבחנה של התבגרות המעיים להשתמש בתאי מעיים ראשוניים בשלב התפתחותי מאוחר, בין יום עוברי 18 ו 20.

עם שתי מדפים קטנים, למתוח את המעי. באמצעות הקיבה והנספח כמדריכים, חותכים לגזרים את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של המעי הדק. באמצעות התוספתן כמדריך, חותכים את המעי הגס לגזרים.

כדי להפוך את המעי פתוח אורך, מניחים סכין גילוח לאורך לאורך המעי ולמשוך את המעי על ידי מטליות הזזה לאורך סכין הגילוח. לאחר מכן, חותכים את המעי שנפתח לחתיכות סנטימטר אחד. הכינו שלושה צינורות של 50 מיליליטר עם עשרה מיליליטר של PBS קר כקרח.

מעבירים את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של המעי הדק והמעי הגס בנפרד לצינורות. שמור את הצינורות על קרח תוך לנתח את המעיים של עכברים נוספים. לאסוף את כל חלקי המעיים של המלטה אחת יחד באותו צינור.

לאחר שטיפת חתיכות המעי עם PBS קר כקרח, דגירה עם שני EDTA מילימולרית במשך 30 דקות. כדי לנטרל קריפטות מן הרקמה, לשטוף חלקית את החלקים עם PBS קר כקרח עשרה אחוזים סרום עגל ולסנן דרך מסננת תא 70 מיקרון לתוך צינור חדש. חזור על שטיפת הרקמה פעמיים נוספות ולשלב את הפתרון המסונן.

צנטריפוגה הפתרון המסונן המכיל את הקריפטות ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הקריפטות כמו גלולה. מעבירים את הקריפטות לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה שוב. כדי צלחת בארות, להוסיף את הכמות הכוללת של ג'ל מטריצה חוץ תאית הדרוש לתוך הצינור ולהמיס את גלולה.

מוסיפים 20 מיקרוליטרים של הקריפטות המומסות לכל באר של צלחת חמה של 48 בארות. לאחר ציפוי הראשון, להסתכל מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הצפיפות של סביב 250 כדי 300 קריפטות לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות כדי לאפשר לג'ל המטריצה החוץ-תאי להתגבש.

לאחר מכן, הכן את אמצעי ENR. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום ENR לכל באר על הג'ל. לשנות את המדיום שלוש פעמים בשבוע ולמעבר האורגנואידים פעם בשבוע.

במשך חודש אחד, כל שלושה ימים לאחר כל קטע, לנתח את התרבות. שלושה ימים לאחר כל מעבר, לבודד RNA מ באר אחת על ידי הוספת 200 microliters של מאגר תיזה RNA בתוספת שני microliters של בטא mercaptoethanol ל באר. לאחר מכן, להעביר את המדגם מה באר לתוך צינור RNAse חינם 1.5 מיליליטר.

בניסויים במבחנה שלנו, השתמשנו dexamethosone כדוגמה של גורם חיצוני זה ידוע להאיץ התבגרות המעי ב vivo. כדי לבודד חלבון, להוסיף 250 microliters של פתרון התאוששות תאים קרים קרח לכל באר לחמש בארות של אורגנואידים ולאסוף את כולם בצינור 15 מיליליטר. דגירה לפחות 30 דקות על הקרח כדי להמיס את ג'ל מטריצה חוץ תאית.

לשטוף עם PBS קר כקרח, להוסיף 250 microliters של חיץ תן התא, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לנתח את פעילות האנזים, הכינו תחילה חיץ גברי טוחנת 0.625 ב- pH six ו- 0.05 פתרונות טוחנים של לקטוז, סוכרוז, מלטוז וטרהלאז ואחסנו אותם בקרח. הכן תקני בדיקת התקנים על ידי דילול תווי גלוקוז טוחניים 5.56 עם מים טהורים במיוחד כדי להשיג פתרונות עם 5 ריכוזים שונים.

לאחר מכן, לצלחת של 96 בארות, הוסיפו שמונה קבוצות שונות של ליט אורגנואידים עם המצעים המתאימים שלהם, כולל סטנדרטים ושליטה על פי כתב היד. דגירה במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את כמות הגלוקוז המיוצרת על ידי האנזימים הקיימים lysate organoid, להוסיף במהירות 200 microliters של פתרון צבע PGO מוכן טרי ולמדוד ספיגה על הספקטרופוטומטר ב 450 ננומטר כל חמש דקות במשך שלושים דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בפרוטוקול זה, המעי הפרוקסימלי והדיסטלי היו מבודדים מן E18 כדי E20 עוברי עכבר. עם הבידוד, תאי אפיתל נזרעו בכיפות ג'ל מטריצה חוץ תאית. לאחר כ 28 עד 30 ימים של תרבות, אורגנואידים עובריים פותחו למצב הבוגר הבוגר.

סמנים פרוקסימליים Onecut2 ו Gata4 באו לידי ביטוי בעיקר בתרבות האורגנואידים הפרוקסימלית, בעוד סמנים דיסטליים Fabp6 ו Guca2a באו לידי ביטוי בעיקר בתרבות האורגנואידים הדיסטלית. סמנים עובריים לקטאז, Ass1, Blimp-1 ו קולטן Fc יילודים ירדו בביטוי היחסי שלהם סמנים למבוגרים סוקראז isomaltase, ארגנאז 2, trehalase ו lysozyme גדל לאורך זמן הן תרבויות אורגנואידים פרוקסימליים ודיסטליים. ההשפעות של גורמים חיצוניים לא בהכרח צריך להיות גנומי.

ביטוי גנים של סמן עוברי Blimp-1 ירד ביום 12 עבור האורגנואידים שטופלו dexamethasone בהשוואה אורגנואידים שליטה. עם זאת, הן ביטוי גנים ופעילות אנזים של סמנים למבוגרים סוקראז isomaltase הוגדלו. בעת שימוש בפרוטוקול זה, חשוב להבין כי רק אורגנואידים בשלב העובר מאוחר מסוגלים לעבור אורגנואידים מבוגרים במבחנה.

ניתן להפחית עוד יותר את מספרם של שישה עד עשרה עוברים כנקודת מוצא לתרבות זו באמצעות המעי כולו כדי לחקור את ההבשלה הכוללת. הערך התרגומי של מודל זה טמון באפשרות של אפקטים קיצוניים בקבוצה גבוהה המסוגלים לווסת את התבגרות המעיים שהוא תהליך ה שמור בין יונקים יונקים.