ניתוח של מולקולות מורכבות והתגובות שלהם על משטחים באמצעות מצבר-המושרה באמצעות אשכול/אינון המסה ספקטרומטריה
1 במרץ 2020
נייטרלי SO2 אשכולות של אנרגיה קינטית נמוכה (≪ 0.8 eV/בוחרים) משמשים desorb מולקולות פני השטח מורכבים כגון פפטידים או שומנים לניתוח נוסף באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות ספקטרומטר המסה של מלכודת יונים. אין צורך בהכנה לדוגמה מיוחדת, וניתן להתבונן בזמן אמת על תגובות.
יינון Desorption המושרה על ידי אשכולות SO2 ניטרליים שאנו מכנים ב- DINeC קצר, היא שיטת יינון רכות ויעילות. אנו משתמשים בו בין היתר עבור ספקטרומטריית מסה של ביומולקולס, כגון פפטידים וחלבונים. כמו DINeC, מולקולות desorption שלם מפני השטח מדגם, שינויים כימיים עדינים במולקולות אלה מזוהים בקלות ספקטרום המסה.
התהליך מודגם בסימולציה הבאה. האשכולות הנכנסים מתנפצים דרך השפעת משטח באשכול. דיפטיד האיזוטופים של פני השטח מומס באחד ממשברי האשכול ובלתי מעובד על ידי תהליך זה.
בניסוי, הקרן של אשכולות SO2 מיוצרת באמצעות התרחבות על-קולית ממזנון פעוש. המולקולות המומסות ומיונות במהלך השפעת משטח האשכול מועברות למלכודת היונים לספקטרומטריית מסה. ספקטרום מסה טיפוסי רק להראות פסגות בערכים ערכת MO של המולקולה שלם.
הדגימו את ההליך יהיו קרולין בוהארט, ופסקל שניידר, שני דוקטורים במעבדה שלי. עבור דגימות סטנדרטיות, לחתוך את המצעים מן ופלים סיליקון עם עובי של כ 0.5 כדי מילימטר אחד חתיכות של אחד על סנטימטר מרובע אחד. לנקות את מצעי הסיליקון באמבט אולטרסאונד של אתנול ואצטון במשך 15 דקות כל אחד.
יבש את המצעים בזרם של גז חנקן יבש. לאחר מכן, שחרר יצוק חמישה עד 30 microliters של פתרון המדגם על המצע. בהתאם ללחץ האדים של הממס, תן לדגימה להתייבש בתנאי הסביבה או במייבש עד שכל הממס התאדה ונוצר סרט יבש.
שקול את ערכת ההכנה הפשוטה ביותר. כדוגמה, לחקירה של דיו עט סימון, פשוט לצייר נקודה על פני המצע. תן את הדגימות על מחזיק הדגימה עם סרט דביק או מהדקים מהודק על ידי ברגים.
בנוסף לטעון מדגם התייחסות כגון סרט מיקרומטר עבה של אנגיוטנסין II על מחזיק המדגם. לאחר מכן, הקש על נעל טעינת פתח כדי לפרוק את מערכת נעילת העומס. המתן חמש דקות, או עד שיושג לחץ אטמוספרי.
פתח את מנעול העומס וטען את מחזיק הדגימה. סגור את מנעול העומס ושאוב את תא נעילת העומס ללחץ מתחת ל-2 פעמים 10 לחמישה מילי-בר שליליים. פתח את השסתום לתא DINeC ולהעביר את מחזיק המדגם עם מוט ההעברה למניפולטור הראשי.
צרף את מחזיק הדגימה למניפולטור. חזור בו ממוט ההעברה וסגור את השסתום בין מנעול העומס לתא DINeC. פתח את השסתום בין גליל הגז לגז.
התאימו את הלחץ של תערובת דו תחמוצת הגופרית וגז הליום בקווי המתאר של מערכת ערבוב הגז ל-15 בר. הגדר את מיקום המניפולטור למיקום דגימת הייחוס. למדידת ספקטרום מסה קטיקטי, הגדר את המדגם ואת הטיית הרשת ל- plus 40 וולט, בתוספת שבעה וולט בהתאמה.
כדי להניע את הזרבובית הפעמו ואת ספקטרומטר מסת מלכודת היונים, הגדר את מחולל הפונקציות החיצוני לשני הרץ. עם מחולל העיכוב, הגדר את השהיית הזמן בין אות המלכודת הצלויה ממלכודת היונים לבין אות ההדק עבור הזרבובית הפעום לחמש אלפיות שנייה. בתוכנת הבקרה של Bruker, בדף Mode של חלון הדיאלוג הראשי, בחר רזולוציה משופרת עבור מצב סריקה.
הקלד M מעל Z 50 עד 3000 לטווח, הקלד 0.1 אלפיות שניה עבור זמן הצטברות, הקלד 10 מחזורים בממוצע, ולקוטביות, בחר חיובי למדידת ספקטרום מסה קוטבי ושלילי למדידת ספקטרום אניוניק. לאחר לחץ מתחת שלוש פעמים 10 לשישה מיליבאר שלילי כבר הגיע בתא DINeC, להתחיל את המדידה. הגדר את ערך M over Z למסה המתאימה כדי לעקוב אחר אות הכרומטוגרמה התלוי בזמן.
לחץ על הפעלה בתוכנת הבקרה. התחל להקליט את המידות על-ידי לחיצה על לחצן הקלט. למדוד ספקטרום הבדיקה מדגם הפניה, כגון אנגיוטנסין II במשך כ 300 שניות.
מטב את עוצמת האות על-ידי כוונון השהיית הזמן בין אות ההשמנה הברור לבין האות המפעיל את הזרבובית הפעמה. כאשר השהיית הזמן ממוטבת, העבר את המניפולטור למיקום המדגם שיש למדוד. לחץ על כפתור הקלט כדי לרכוש ספקטרום מסה לאורך טווח הזמן של עניין.
לאחר סיום המדידה, טען את ערכת הנתונים המתאימה בתוכנית ניתוח נתונים כפי שמוצג כאן עבור מדידת הייחוס. בחר את טווח הזמן של עניין בכרומטוגרמה עם הלחצן הימני של העכבר. הספקטרום הממוצע מוצג בחלון נפרד.
לחץ על ייצוא כקובץ ASCII כדי לייצא את הספקטרום כקובץ נתונים לעיבוד נוסף בתוכנית בחירה. ספקטרום המסה DINeC מדגם אנגיוטנסין II השתנה עם הזמן כמו המדגם היה מחומם על 140 מעלות צלזיוס. ברגע שהטמפרטורה הגיעה לערך הסופי, השיא של המולקולה המותקפת ב- M over Z שווה 1047 ירד ופסגות חדשות נצפו.
התהליך מסוכם בשלושת הגרפים הללו. הפסגות הנוספים ב-M over Z בשווי 932, 1012 ו-1029 נצפו היטב. ניתוח של קינטיקה התגובה מראה כי הישות עם M מעל Z שווה 1029 הוא ביניים אשר נרקב עוד יותר לרסיסים קטנים יותר כמו האינטנסיביות הראשונה גדל ולאחר מכן ירד.
התכונות החשובות ביותר של DINeC הן האופי הרך של תהליך desorption, היעילות, ואת הרגישות משטח גבוהה. כולם באים יחד עם הדרישות הנמוכות ביחס להכנת מדגם. DINeC יכול אפוא להיות מיושם על מגוון רחב של דגימות שונות, החל מחומרי קליפה אורגניים כדי adsorbates משטח מורכבים באזור sub-monolayer.
בכל המקרים, מידע כימי מלא ניתן להשיג בזמן אמת.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטת יינון בפליטה חדשנית באמצעות אשכולות SO2 ניטרליים, המכונה DINeC, לניתוח ספקטרומטריית מסה של ביו-מולקולות. הטכניקה מאפשרת תצפית בזמן אמת על שינויים כימיים בפפטידים וחלבונים ללא הכנת דגימה מקיפה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ספקטרומטריית מסה
- ניתוח ביו-מולקולרי
- כימיה של משטחים
רקע
- DINeC היא שיטת יינון פליטה רכה.
- היא מאפשרת ניתוח של מולקולות משטח מורכבות.
- מעקב בזמן אמת אחר תגובות אפשרי.
- הכנת דגימה מינימלית נדרשת.
מטרת המחקר
- להדגים את יעילותה של DINeC לספקטרומטריית מסה.
- לנתח שינויים כימיים עדינים בביו-מולקולות.
- לספק פרוטוקול מפורט להכנת דגימות ומדידה.
שיטות ששימשו
- ייצור אשכולות SO2 באמצעות התרחבות על-קולית.
- פליטה של מולקולות באמצעות השפעת פני השטח של האשכולות.
- העברת מולקולות מיוניזציה למכשיר ספקטרומטר מסה עם מלכודת יונים.
- רכישת נתונים ואנליזה של ספקטרום מסה בזמן אמת.
תוצאות עיקריות
- ספקטרום מסה מראה פסגות מולקולריות שלמות.
- פסגות חדשות מופיעות ככל שהטמפרטורה עולה במהלך הניתוח.
- קינטיקת התגובה מגלה היווצרות מינים ביניים.
- DINeC מפגינה רגישות ויעילות גבוהה למשטח.
מסקנות
- DINeC היא שיטה מגוונת החלה על דגימות שונות.
- היא מספקת מידע כימי מקיף בזמן אמת.
- דרישות הכנת הדגימה הנמוכות של השיטה משפרות את התועלת שלה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
