זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

חיידקים תאיים מפרישים חלבונים משפיעים לתוך המארח שיכולים לתפעל מסלולים ביולוגיים כדי לקדם הישרדות פתוגן. חשיפת מטרות מארח של משפיעים חיונית להבנת פתוגנים תאיים כמו כלמידיה טרכומטיס. רעלת שמרים ומסכי מדכא יכולים לספק תובנה מרכזית לגבי היעד הביולוגי הטבעי של חלבונים משפיע חיידקי יכול להיות שימושי במיוחד כאשר שותף מחייב אינו ידוע.

אנו מדגימים את רעילות השמרים ואת בדיקות מדכא כאן להקרנה עבור חלבונים אפקטים Trachomatis כלמידיה, אבל טכניקה זו שימשה גם לאפיון לגיונלה pneumophila ו Coxiella burnetii אפקטים. התחל על ידי חינוך חמישה מיליליטר של מרק נשירה יחיד עם מושבה אחת של שמרים טרנספורמציה עם חלבון אפקט המכיל פלסמיד. השתמש שמרים טרנספורמציה עם הווקטור לבד כמו שליטה שלילית דגירה inoculum לילה ב 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.

למחרת, להוסיף 180 microliters של מים סטריליים A2 עד A6 בארות של צלחת 96 באר. Vortex תרבות הלילה ולהוסיף 180 microliters של שמרים גם A1. ואז באופן סדרתי לדלל את השמרים בארות עם מים. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לזהות חמישה microliters של כל דילול על גלוקוז נשירה יחיד נשירה אחת נשירה צלחות אגר דגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.

לאחר הדגירה, חזותית להעריך רעילות על ידי השוואת הצמיחה של שמרים המבטאים את החלבון משפיע גדל על מדיה המכילה גלקטוז לצמיחה של שמרים המבטאים את הווקטור לבד. לחסן 100 מיליליטר של מרק נשירה יחיד עם מיליליטר אחד של מלאי שמרים שהוכן בעבר דגירה זה במשך 16 עד 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 150 סל"ד. ביום שלמחרת, מוסיפים את כל 100 המיליליטרים של תרבות הלילה ל-900 מיליליטר של מרק נשירה יחיד מחומם מראש ומחרידים את הבקבוק במשך ארבע עד חמש שעות ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.

לאחר הדגירה, גלולה את התרבות ב 6, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור ב-250 מיליליטר של מים סטריליים. חזור על הצנטריפוגה והשליך את העל-טבעי.

ואז לבזבז את גלולה ב 250 מיליליטר של אצטט ליתיום מילימולר אחד. גלולה את התרבות על ידי צנטריפוגה, להסיר את אצטט ליתיום, ו resuspend גלולה ב 9.6 מיליליטר של 50%PEG 3350. לאחר מכן הוסיפו רייגנטים לשינוי כמתואר בכתב היד והתאיימו את עוצמת הקול ל-15 מיליליטר עם מים סטריליים המהירים בעדינות כדי לערבב.

דגירה את התערובת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן מוסיפים 750 מיקרוליטרים של DMSO ו דגירה באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. הוספת DMSO לפני הלם חום היא חיונית כדי להשיג יעילות טרנספורמציה גבוהה.

לאחר הדגירה, גלולה את השמרים על ידי צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולשטוף את גלולה עם 10 מיליליטר של מים סטריליים ואז לחזור על הצנטריפוגה כדי גלולה את השמרים. תן את גלולת בשמונה מיליליטר של מים.

לקבוע את יעילות הטרנספורמציה על ידי דילול המדגם אחד עד 10 וציפוי 100 microliters של כל דילול על אגר נשירה כפולה. לאחר מכן צלחת 200 microliters של המדגם על צלחות אגר גלקטוז נשירה כפולה דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 עד 96 שעות או עד מושבות להופיע. לאחר שהופיעו מושבות, תתקן אותן על אגר גלקטוז נשירה כפולה ותדגר אותן לעוד 24 עד 48 שעות.

השתמש בחלק מהטלאי כדי לחסן חמישה מיליליטר של מרק נשירה כפולה ולהדקר את inoculum לילה ב 26 מעלות צלזיוס עם רועד ב 150 סל"ד. למחרת, להוסיף 180 microliters של מים סטריליים לחמש בארות של צלחת 96 באר החל A2 היטב. וורטקס תערובת תרבות הלילה. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של שמרים כדי גם A1 ולדלל אותו באופן סדרתי באמצעות המים בארות A2 עד A6. ספוט חמישה microliters של כל דילול על גלוקוז נשירה אחת וצלחות אגר גלקטוז נשירה אחת הקפדה לכלול את המחולל הרעיל לבד כפקד.

הדגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ואז להשוות את הצמיחה של השמרים עם אפקט רעיל לבד לצמיחה של שמרים עם מדכא פוטנציאלי. כדי לאשר מדכאים שהפגינו רעילות מופחתת בהשוואה למחולל הרעיל בלבד, לבודד את הפלסמיד על פי הוראות כתב היד ולהפוך אותו מחדש לשמרים הרעילים. לחסן מרק גלוקוז נשירה כפול עם מושבה מצלחת השינוי.

להדגיר אותו לילה ולמקום על גלוקוז נשירה כפולה אגר גלקטוז כדי לאשר דיכוי של רעילות. לפני ביצוע מסך מדכא השמרים, חלבונים משפיעים של עניין נבדקו רעילות שמרים. חלבון העניין בא לידי ביטוי בשמרים תחת שליטתו של מקדם גלקטוז בלתי ניתן לאכילה והצמיחה בגלקטוז הושוותה לצמיחה על גלוקוז.

כאשר CT229 נבדק רעילות, מושבות קטנות יותר ודיכוי צמיחה נצפו. באופן אידיאלי, יש לראות ירידה של שניים עד שלושה יומנים כדי להמשיך עם מסכי מדכא שמרים. מסך המדכא נערך על ידי הפיכת הזן הרעיל עם הספרייה הגנומית שמרים pYAP 13 וציפוי הטרנספורמנטים על אגר גלקטוז.

שיבוטי המדכא שהושגו נצפו על אגר גלקטוז נשירה כפול כדי לאשר דיכוי של רעילות. מדכאי pSup1 ו- pSup2 דיכאו את הרעילות של חלבון האפקטים ואילו pSup3 לא. הליכים אלה דורשים תשומת לב זהירה לפרטים בנוסף לעבודות הכנה קריטיות כולל כמויות גדולות של מדיה וצלחות מוכנות לפני ביצוע הניסוי.

לאחר זיהוי מדכאים, ניסויים יכולים להתבצע כדי לאמת אינטראקציות עם המחולל של עניין כולל משיכת כלפי מטה, קולוקליזציה immunofluorescence, נוקאאוט אפקט או הפלה של גורמים מארחים שזוהו במסכים. פיתוח טכניקה זו עבור משפיעי כלמידיה אפשרה אפיון ראשוני מזורז של חלבונים משפיעים ועזרה למקד את מאמצינו בהבהרת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המתווים אינטראקציות פתוגן מארחות.