האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

אוטומציה של הפעלה של טיפות בודדות מאפשרת להביא רצפים מורכבים של פעולת יחידת מעבדה לשבב אחד. הפלטפורמה המיקרופלואידית הדיגיטלית שלנו מתמודדת עם זיהוי מהיר וספדי בשטח של פתוגנים של וירוסים. שיטה זו מבוססת על זיהוי כמותי של אנטיגנים ספציפיים באמצעות מיקרופלואידים דיגיטליים מבוססי EWOD בשילוב עם immunoprecipitation מגנטי.

בתרומה זו, השיטה מוערכת כנגד דגימות המכילות ריכוזים שונים של חיידקים, נבגים, וירוסים וחלבונים. תהליך זה הוא אוטומטי לחלוטין, רציף, מדרגי ורב-תכליתי. ניתן לשנות את הרצף של אמצעי האחסון ואת אמצעי האחסון הנפתח כך שיתאימו לדרישות של פרוטוקול מסוים.

פלטפורמת המיקרופלואידים הדיגיטלית, המבוססת לחלוטין על חישה מבוססת נוגדנים, יכולה להיבנות ליישום פוטנציאלי המבוסס על רגישות ביולוגית של aptamer, שבה חרוזים מגנטיים נושאים אפומרים ספציפיים ללכידה וזיהוי של רצפי נוקלאוטידים. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, חשוב לשקול את סוג של פעילי שטח וכיצד הוא אינטראקציה עם הבחירה שלך של ביוכימיה ציפוי פולימר הידרופובי. התחל על ידי הסרת המגנט מפלטפורמת microfluidics דיגיטלית או DMF ומניח אותו על הספסל.

מניחים צלחת תיעוב נקייה על הבמה המסתובבת עם הכרום הפונה כלפי מעלה, מיישרים את הצלחת עם הפינה השמאלית העליונה של השלב שקוע. הדק את לוחית התב"ע מלמעלה באמצעות הלוח עם 47 סיכות המגע, אשר יאבטחו את הצלחת למקומה ויקלו על היישור עם סיכות המגע. לאחר מכן צלחת shim 0.5 מילימטר ומפריד PMMA שני מילימטר על הבמה המסתובבת כדי לספק פער מבוקר בין כבידה לוחות כיסוי.

כדי לטעון את טיפות על רפידות הטעינה המוצעות, aliquot ארבע טיפות microliter 2.5 מן המאגר פועל על B, A, R, ו E רפידות מסומן באמצעות טיפה אחת לכל כרית. ואז aliquot 2.5 microliters של פתרון מי חמצן למי חמצן luminol על כרית E מסומן. לאחר מכן, aliquot 2.5 מיקרוליטרים של Neutravidin מצוידים לנוגדנים משניים biotinylated HRP וחיידקים על F, G, ואני ציטט רפידות בהתאמה.

לבסוף, aliquot 2.5 microliters של המדגם הלא ידוע על כרית C מסומן. מניחים את לוחית הכיסוי על פני השטח של האסדה ליד אזור ההפסקה העגולה ומחלקים אותה באופן מאוחר יותר לתוך ההפסקה ועל גבי לוחית ההתקפית. שים את המגנט הקבוע על גבי צלחת הכיסוי ולאבטח אותו על ידי הזזת שני תפסים, ולאחר מכן לסובב את הבמה על ידי 180 מעלות ולבדוק אותו חזותית כדי לוודא טיפות טעון עדיין במקום.

ודא כי מיקום הטעינה עבור כל טיפה תואם לרצף האתחול מתוכנת בתוכנה. מקם את photodetector מוקרן יכול לתוך החריץ של השלב המסתובב ולחבר את הכבל. מקם את המכסה מעל פלטפורמת DMF והתחל את רצף התוכנית באמצעות ממשק התוכנה.

מיקום Droplet נרשם באמצעות חישה קיבולית ולאחר מכן ניתן לצפות בממשק המשתמש. רצף התוכנית יבקש הודעות המופיעות בממשק כדי להודיע למפעיל כי טיפת luminol מוכן לאסוף את חרוזים מגנטיים שחולצו או טיפת הזיהוי מוכן להעביר לאתר האיתור. בשני המקרים, נדרש אישור מהמפעיל כדי להמשיך.

עוצמת האור המיוצרת על ידי תגובה chemiluminescent נקרא על ידי photodetector ומוקלט בזמן אמת. כדי לפעול במצב חזותי למיטוב פרוטוקולים, הפעל את רצף התוכנה באמצעות ממשק התוכנה. ניתן לדמיין את תב"צ הירידה האוטומטית בשבב עבור כל אחד משלבי ההתמדה הקריטיים, כגון מיצוי מגנטי של חרוזים, שימוש חוזר וחרוזים ומיקס.

כאשר תתבקש, התקן את הפוטו-דקטקטור המוקרן יכול להיכנס לתוך חריץ השלב המסתובב. חבר את הכבל של photodetector מוקרן יכול על ידי החדרת הפינים בשקע. מניחים את המכסה מעל פלטפורמת DMF ולחדש את הראיה.

טיפות מנוטרות באמצעות חישה קיבולית ו ניתן לצפות בממשק המשתמש. כדי לנקות את הציוד, פתח את מכסה פלטפורמת DMF וסובב את הבמה ב-180 מעלות. בטל את מעטפת המגנט והסר את המגנט מהשלב המסתובב.

מוציאים את רקיק הסיליקון מהמחלקה עם זוג פינצטה ושטיפתו במים מזוקקים. ואז לייבש אותו עם אוויר דחוס ולמקם אותו בצלחת פטרי שבו רקיק ניתן לאחסן לעשות שימוש חוזר. השתמש micropipette כדי להסיר את הפסולת הנוזלית מן כרית מבלי לגעת על פני השטח ולנקות את פני השטח על ידי פתיל הנוזל מצלחת ההתקנה באמצעות נייר סופג.

כדי לחקור את השפעת מתח תב"צ, טיפה מהחוצץ הונעה במתחי תיעוב שונים והתנועה שלה נרשמה. מתאם בין Vrms לבין המהירות הממוצעת הוכח ורמת מהירות נצפתה לאחר ערך Vrms מסוים. תוחלת החיים של לוחית ההתניה הופחתה כאשר נעשה שימוש בערכים גבוהים עבור Vrms.

עבור פעולת יחידת מעבדת החילוץ, טיפה המכילה את חרוזים מושעה הובל לאתר ההפרדה באמצע אזור הערבוב. ואז המגנט הופעל באופן אוטומטי כדי להתקרב לשבב ולמקד את חרוזים. לאחר מכן, טיפת הועבר לכיוון כרית הפסולת, עוזב את חרוזים.

פעולות יחידת החילוץ והמיקס של המעבדה בשבב EWOD הקלו על עיבוד מדגם מהיר ומשוחזר מצומצם עם זיהוי רצוף של הפתוגנים תוך 6 עד 10 דקות. זמני הדגירה וריכוזי ההיחדה היו מגוונים כדי למצוא את התנאים האופטימליים להתגלות. נמצא כי זמן הדגירה של 160 שניות וריכוז תותב של שני מיקרוגרם למיליליטר השיגו את יחס האות לרעש הטוב ביותר.

ניתן להציג וריאציות בפרוטוקול כדי להשיג את רמות האוטומציה הרצויות. ELISA בן שמונה השלבים שימש לגילוי אנטיגנים שונים כגון נבגי Bacillus atrophaeus וחיידק MS2. בינתיים, הפרוטוקול בן 10 השלבים שימש לכימות אי-קולי.

חשוב לוודא כי המתחים המוחלים, ריכוזי האנליטים והריגטים אופטימליים להפעלת טיפות והפרדה מגנטית מוצלחת על השבב. כדי להשיג מדידה מדויקת, יש לקחת בחשבון את יכולת כריכת חרוזים וייתכן שיהיה צורך בדילול סדרתי של האנליטים. על ידי החלפת סוג הנוגדן, ניתן לזהות פתוגנים שונים מזה שדווח בסעיף התוצאות.

השיטה יכולה להיות מיושמת גם למשל עבור זיהוי סמן ביולוגי או אבחון נקודת טיפול. בנוסף ליישומים שכבר הוצגו, המערכת פותחה עם זיהוי בשטח של פתוגן מוטס בראש. DMF היא פלטפורמה אידיאלית עבור יישום זה מכיוון שנפח הירידה תואם לפלט של סמפלר אחר שפיתחנו לאחרונה.