Name: שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: חקור שחרור Dpp מדיסק כנף של Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על דינמיקת השחרור ומנגנוני פיתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוני להודות לד ר סאראלה פראדהן על עבודה על גרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול זה. אנחנו רוצים להודות NSF-IOS 1354282 למימון בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול. היינו רוצים להודות NIH-נדבך RO1DE025311 למימון המעבדה שלנו כרגע.

1. איסוף ביצים כדי ליצור הזחלים לחיתוך
<ol><li>לחצות 30-40 נקבה בתולה Dpp-GAL4/TM6 Tb הו זבובים ל 10-15 זכר Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. הערה: כל גנוסוגים המכילים Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP יכול לשמש כל עוד אזנים יש סמני זחל המאפשר מבחר של צאצאי המתאים במהלך הזחל.</li>
	<li>כדי לאסוף ביצים, להפוך את הזבובים חצה לתוך בקבוקון טרי של מזון ולאפשר להם לשכב 3 – 4 h לפני הסרתם מן הבקבוקון. כדי לעודד הנחת ביצה, כמות קטנה של ממרח שמרים עשוי מגורען מעורבב עם כמות קטנה של מים ניתן להוסיף לחלק העליון של המזון לפני הזבובים מוצגים לבקבוקון. את אותה קבוצה של זבובים מצטלבים ניתן לשמור ולהשתמש עד 7 ימים של אוספי ביצים. הערה: כל המאכלים הסטנדרטיים בארוחות הערב מגישים אוכל מקובל. משמש כאן הוא מתכון המזון המתואר על ידי Hazegh ו רייס20.</li>
	<li>שמרו את הבקבוקונים במבחנות ב-25 ° c תמורת כ-144 h עד שהזחלים נמצאים בשלב השלישי (נודד).</li>
	<li>כדי לבחור את הזחלים המתאימים לחיתוך (אלה ביטוי הן Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP) הראשון לבחור הזחלים כי הם שאינם Tb. הזחלים האלה יהיו באורך נורמלי ולא נמוך ושמן.</li>
	<li>בין הזחלים שאינם שחפת, יהיו הזחלים המבטאים את CyO-GFP וזחלים המבטא Dpp-GFP. כדי לבחור את הזחלים Dpp-GFP, להציג אותם תחת stereomicroscope פלואורסצנטית. בעוד ששניהם Dpp-GFP ו CyO-GFP ביטוי larve יהיה כמה זריחה GFP, Dpp-GFP הזחלים ביטוי יכול להיות מכובד כי GFP הוא מוגבל הדיסקים הכנף והפלואורסצנט הוא הרבה פחות בהיר מאשר CyO-GFP הבעת הזחלים. בחר את הזחלים הבהירים פחות האלה לניתוח.</li>
</ol>2. הכנת הפתרון לדימות ולחיתוך זחל
<ol><li>עבור הדמיה חיה של דיסקי כנף, להכין שונה HL3 מדיה21 (70 מ"מ, 5 מ"מ kcl, 1.5 mm cacl2 הידרוקסיד, 4 מ"מ mgcl2, 10 mm נחקו3, 5 מילימטר טרהלוז לימה, 115 mm סוכות, 5 מ"מ hepes). מדיה זו מאפשרת את הדיסק הכנף להישמר בחיים עבור הדמיה21.</li>
	<li>להתאים את ה-pH ל 7.1 באמצעות hepes ולסנן עם מסנן 0.22 יקרומטר. השתמש במדיה זו הן עבור הניתוח של דיסק הכנף והן כאמצעי האחסון הגובר להדמיה חיה.</li>
</ol>3. הכנת שקופיות להרכבה בדיסק כנף
<ol><li>מניחים שתי חתיכות של קלטת כפולה ומאוזנת בתוך משטח מיקרוסקופ, ומשאירה מרווח של כ-5 מ"מ ביניהם. פיסות הסרט אמורות להיות ארוכות מספיק כדי שקצות הקלטת יהיו מיושרים עם קצות שקופית המיקרוסקופ.</li>
	<li>השתמש בקצה שטוח (כגון קצה הידית של צמד מלקחיים) כדי להקיש על הקלטת בחוזקה על השקופית כך שאף מדיה לא תוכל לחלחל מתחתיו.</li>
	<li>מקום 25 μL של שינויים HL3 מדיה בין שתי פיסות הקלטת. הדיסק הכנף יהיה מותקן בירידה זו של מדיה בין פיסות הקלטת, כך הקלטת מונעת את הכיסויים למחוץ את הדיסק (איור 1A).</li>
</ol>4. מבתר והרכבה של דיסקים להדמיה
<ol><li>הזחלים מנתחים בHL3 מוכן שונה26מדיה.</li>
	<li>קורעים בעדינות את הזחלים במחצית באמצעות שני זוגות של מלקחיים ולהשליך את החצי האחורי של הזחל.</li>
	<li>אחוז באמצע המחצית הקדמית של הזחל עם זוג אחד של מלקחיים ולהשתמש זוג אחר של מלקחיים סגורים כדי לדחוף את ווים הפה לתוך הזחל עד הזחל הוא הפוך לחלוטין.</li>
	<li>את הדיסקים הכנף ניתן למצוא בקלות רבה יותר על ידי מחפש את העיקולים חדה בשני הענפים העיקריים בצבעים כהים של הגרניים כי לדרוס את שני הצדדים של הזחלים. הדיסקים הכנף משקרים ישירות תחת כפיפות בקנה הנשימה בזחל הפוך.</li>
	<li>הסר בעדינות את דיסקי הכנף והעבר אותם ל-25 μL של HL3 media בשקופית המוכנה של המיקרוסקופ. חשוב לוודא כי אין פיסות קנה הנשימה שנותרו מחוברים הדיסקים לגזור הכנף כמו זה יכול לגרום לדיסקים לצוף, מה שהופך את ההדמיה קשה.</li>
	<li>סדר את הדיסק הכנף כך שהצד הפריפוייתי של נרתיק הכנף פונה כלפי מעלה מתוך שקופית המיקרוסקופ עם הדיסק שטוח (ראה איור 1א, ב).</li>
	<li>לכסות את הדיסק כנף וקלטת עם שמיכות ולאטום את העטיפה באמצעות לק הציפורן. ברגע שפולנית יבשה, המשך מיד לשלבי ההדמיה להלן.</li>
</ol>5. הדמיה Dpp שחרור
<ol><li>תמונה הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה עם מטרה שמן 40x ו 488 ננומטר לייזר. Dpp-GFP צריך להופיע כרצועה של הזריחה GFP במורד המרכז של דיסק כנף עם דקדטה קטן של Dpp-GFP שוחרר ממרכז זה פס של תאים.</li>
	<li>לאסוף תמונות במהירות של 2 Hz עבור 2 דקות כדי להמחיש לשחרר Dpp. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להגדיר את הלייזר בהגדרה רק חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים Dpp-משחרר כדי למנוע הלבנת מעל במהלך איסוף התמונה. התמונות ניתן לאסוף כסדרה זמן אשר ניתן לייצא כקבצי AVI (אין דחיסה, 3 מסגרות/s) כדי להשיג קבצי וידאו של המהדורה Dpp.</li>
</ol>

<ol><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li>
<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member%2C+decapentaplegic%2C+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li>
<li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li>
<li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li>
<li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks%3A+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li>
<li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li>
<li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product%3A+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li>
<li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+serine%2Fthreonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li>
<li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development%3A+from+Mad+to+Smads%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inwardly+rectifying+K%2B+channel+is+required+for+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li>
<li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li>
<li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

BMPs כגון Dpp להפוך את ההשפעה המשמעותית שלהם כאשר הם לאגד מורכבות של קולטנים מאוגדים קרום כדי לגרום מפל של איתות תאיים בתאים השכנה או מרחוק כנראה. מעבדתו של ד ר תומס קורנברג הראו כי תאים המייצרים את אות dpp בתאי מגע המקבלים את האות באמצעות אקטין מבוסס filapodia דק מבנים כמו המכונה cytonemes15,24,25. נתונים אלה מצביעים על כך שתקשורת סלולרית התפתחותית בהקשר זה עשויה להיות דומה לסינפסה העצבית26. בתקשורת סינפ...

עצם מורורגנטית חלבונים (BMPs) הם חיוניים עבור embryogenesis מוקדם והסדר של מבנים מבוגרים. BMPs מיוצרים ומופרש כדי להשפיע על תמלול של גנים היעד הדרושים הגידול התא בידול בתאים מגיבים. עריפת ראש (Dpp) היא מטוס הומוסוזוזה של BMP4 שחשוב לפיתוח מבנים עובריים ומבוגרים כמו כנף1,2,3,4. כמה קבוצות התמקדו בתפקיד של Dpp כנפיים לעוף מבוגרים בגלל 1) כנפיים מורכב משני גיליונות epithelia שקוף עם דפוס עקביות עקבית שניתן להעריך בקלות; 2) הדיסקים הכנף הם גם שטוחים באופן סביר, יכול להיות מתורבת מחוץ לזחל, והם פשוטים התמונה והבדלים לכמת בתבנית; ו 3) הפיתוח דפוס הכנף רגיש Dpp כגון רטבאליות קטן בשביל יהיה להשפיע הכנף והוא.
Dpp מופק בתאים הממוקמים בגבול הקדמי/אחורי של דיסק כנף5,6,7,8. Dpp נקשר לקומפלקס מסוג 1 ו-2 קולטני סרין/טראונין קינאז9,10. עם כריכת Dpp, הסוג 2 קולטן זרחתיים את סוג 1 הקולטן אשר לאחר מכן זרחני אמהות נגד Dpp (משוגע), Smad 1/5/8 הומויומן. מגייסים מגויסים שכונתיות נוספת (מדיאה), אשר מאפשר לו להיכנס לגרעין שבו הוא מווסת את הגנים היעד, המוביל לתופעות למטה כגוןהתפשטות אובידול 4,11.
לאחרונה, מעבדת בייטס הראתה כי שחרורו הבלתי ראוי של dpp בתוך הדיסק הכנף יכול להוביל לירידה בזירחון מטורף, הפחתה בביטוי הגנים היעד, ופגמים כנף12,13. מספר ערוצי יונים משפיעים על התפתחות אגף דרוזוהילה ומבנים משויכים14,15. ערוצי יונים אלה יכולים גם להיות מעורבים במהדורת Dpp. בקביעת המנגנון של שחרור מורפוגן, חשוב כי יש שיטה להמחיש את האירועים שחרור.
ד"ר אאורליו טלמאן וסטיבן כהן יצרו חלבון היתוך Dpp-GFP אשר מסוגל להציל אובדן של Dpp, כלומר הוא פעיל ביולוגית ושוחרר באופן ביולוגית רלוונטי16. כאן, אנו מתארים כיצד אנו מדמיינים Dpp לשחרר אירועים באמצעות זה Dpp-GFP. חלבון זה היתוך שימושי במיוחד כי GFP הוא pH רגיש כך כאשר הוא בתוך שלפוחיות חומציים, הזריחה היא17. לכן, כאשר חלבון מתויג עם GFP הוא שוחרר שלפוחית לתוך הסביבה מגלותי יותר נייטרלי, עוצמת הזריחה GFP מגדילה17. ניצלנו את הרגישות של ה-pH של GFP כדי לקבוע אם Dpp-GFP נמצא בתוך שלפוחיות חומציים. אנו התמונה דיסקים כנף המבטא Dpp-GFP לפני ואחרי תוספת של אמוניום כלוריד, אשר מנטרל תאים תאיים ושלפוחיות18. מצאנו עלייה משמעותית בקרינה הפלואורסצנטית לאחר תוספת של אמוניום כלוריד, הרומז כי Dpp-GFP מצוי לפני התוספת של אמוניום כלוריד18. אנו מסיקים כי Dpp-GFP התאיים שוכן בתאי קרום חומצי מאוגד, כגון ושלפוחיות, והוא משוקם בתוספת של אמוניום כלוריד לנטרל את ה-pH של תאי תאיים18. זה עושה הדמיה חיה של Dpp-GFP טכניקה שימושית כדי להמחיש את הדינמיקה של Dpp בדיסק כנף Drosophila ילה כפי שהוא שוחרר מתאי חומצי לתוך הסביבה מגלומת.
כאן, אנו מתארים את השיטה אנו משתמשים כדי להמחיש את Dpp לשחרר אירועים באמצעות Dpp-GFP. Dpp-GFP ניתן להתבטא בתבנית מקורית שלה בתוך מערכת הדיסקים של Drosophila ילה באמצעות המערכת UAS-GAL419. זוהי השיטה ששימש כדי לקבוע כי ערוצי Irk השפעה שחרור Dpp18. הצלחנו לאמת את השיטה. ע י הדמיה חיה בערימות אנחנו לא רואים Dpp-GFP לנוע בתוך מישור המיקוד בסדרת הזמן אם רכשנו במישור אחד של מיקוד. אנחנו גם לא רואים תנועה של Dpp-GFP דקדטתא אם אנו מתמונה במחסנית z. אנו מסיקים כי ה-Dpp-GFP שנראה באמצעות שיטה זו הם שחרור אירועים ולא תנועה של שלפוחיות intracellularly. שיטה זו של לחיות הדמיה של Dpp-GFP יכול לשמש כדי לבדוק מודיטים אחרים של המהדורה Dpp עבור השפעתם על הדינמיקה Dpp או יכול להיות שונה כדי להסתכל על הדינמיקה של ליגונים אחרים

<table><tbody><tr><td>שמרי אופה</td><td>כוכב אדום</td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>CaCl2 dyhydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>484-457</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>סקוטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>מלאי זה יהיה זמין בקרוב במרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>מלאי זה יהיה זמין בקרוב במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה</td></tr><tr><td>פינצטה דומונט #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>מלקחיים לניתוח</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC193780010</td><td></td></tr><tr><td>סירופ תירס קל</td><td>קארו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמצית מאלט</td><td>Breiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223210010</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8400</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>RPI</td><td>S22060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>לק</td><td>אלקטרונים Micsroscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>קמח סויה</td><td>ADM מרכיבים מיוחדים</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר מדעי</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose dyhydrate</td><td>Chem-Impex אינטרנשיונל בע"מ</td><td>00766</td><td></td></tr><tr><td>קמח תירס צהוב</td><td>Quaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ להדמיה חיה</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V8 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>לנתיחות</td></tr></tbody></table>

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

שינוי מקדם הצמיחה-בטא (TGF-β) סופר משפחה חיונית עבור המבנה העובריים המוקדמים ופיתוח של מבנים מבוגרים באורגניזמים רב-תאיים. TGF-β סופר משפחה כולל TGF-β, עצם חלבון מורורגנטי (BMPs), הפעלות, צמיחה ובידול, ו Nodals. זה כבר מזמן ידוע כי כמות ליגו חשוף לתאים חשוב השפעותיו. זה היה חשוב כי מעברי הריכוז לטווח ארוך להגדיר דפוס עובריים. עם זאת, לאחרונה התברר כי עיתוי החשיפה לליפות אלה חשוב גם עבור ההשלכות שלהם במורד הזרם. Tgf-β סופרמשפחה ליגנד לא יכול להיות תוצאה התפתחותית עד שהוא שוחרר מתא שבו הוא הופק. עד לאחרונה, היה קשה לקבוע מתי הליטרים האלה שוחררו מתאים. כאן אנו מראים כיצד למדוד את שחרורו של Drosophila ילה BMP הנקרא עריפת ראש (dpp) מן התאים של הראש הזרוע הפרידיום או הכנף. ניתן לשנות שיטה זו עבור מערכות אחרות או לאותת ליגנדס.

איור 2 מראה את תוצאות ההדמיה החיה הייצוגית של פרוטוקול זה. כאשר הפרוטוקול הוא מוצלח, Dpp-GFP ניתן לראות פס במורד המרכז של דיסק כנף עם גרעינים גלויים כמו עיגולים שאינם פלורסנט בתוך אזור Dpp-GFP (איור 2). השחרור dpp-GFP גלוי כמו פלורסנט המופיעים ונעלמים. הבחנו בקרינה Dpp-GFP המופיעים ונעלמים בגופי התא ורחוקים מגופי התא. Dpp איתות תלוי במבנים מבוססי actin המבוסס על מבנים בשם cytonemes הנמתחים הרחק מגוף התא22,23</...

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP להשפיע על גורל התא על ידי קולטני קשירה ושליחת אות תאיים כדי להשפיע על שעתוק. אם DPP מיוצר אך לא שוחרר, אין לו גישה לקולטנים ולכן אינו יכול לבצע את תפקידיו. טכניקה זו מאפשרת לדמיין שחרור DPP המאפשר לחוקרים לבחון אילו גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את דינמיקת שחרור DPP.מסלול האיתות של BMP שמור מזבובים לבני אדם ולכן אנו מצפים כי המנגנון המכתיב שחרור DPP יהיה רלוונטי גם להתפתחות אנושית והתחדשות. התחל על ידי חציית 30 עד 40 בתולה נקבה DPP GAL4 זבובים עם 10 עד 15 זבובים זכר UAS DPP-GFP. לעודד הטלת ביצים על ידי הוספת כמות קטנה של משחת שמרים לבקבוקון טרי של מזון.כדי לאסוף את הביצים, להפוך את הזבובים המוצלבים לתוך הבקבוקון ולאפשר להם להטיל במשך שלוש עד ארבע שעות לפני הסרתם. שמור את בקבוקוני איסוף הביצים ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ 144 שעות עד הזחלים נמצאים בשלב instar השלישי. לאחר מכן בחרו את הזחלים המתאימים לפירוק.ראשית, לבחור זחלים שאינם שחפת אשר יהיה אורך נורמלי ולא קצר ושומן. כדי לבחור את ה- DPP-GFP המבטא זחלים, הצג אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. כל הזחלים שאינם TB יהיו קצת פלואורסצנטיות, אבל GFP מוגבל דיסקי הכנף והוא פחות בהיר על הזחלים DPP-GFP.הכן מדיה HL3 שונה על פי הוראות כתב יד אשר ישמור על דיסקי הכנף בחיים להדמיה. התאם את ה- pH ל- 7.1 באמצעות HEPES ולאחר מכן סנן אותו באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22. מקם שתי חתיכות של רוחב סרט דו-צדדי חסר צבע לאורך שקופית מיקרוסקופ והשאיר רווח של כ-5 מילימטרים ביניהן וודא שקצוות הקלטת סמוקים עם קצות השקופית.השתמש בקצה שטוח כדי ללחוץ היטב על הקלטת לשקופית. הוסף 25 מיקרוליטרים של מדיה HL3 שונה בין שתי חתיכות של קלטת. כאשר דיסק הכנף מותקן במדיה, פיסות הקלטת ימנעו ממנו להימחץ על ידי העטיפה.כדי לנתח את הזחל, מקם אותו במדיה HL3 שונה בעדינות לקרוע אותו לשניים באמצעות שני זוגות של מדפים. השלך את החצי האחורי, ואז לתפוס את אמצע המחצית הראשונה עם זוג אחד של ממטרות ולהשתמש בזוג השני כדי לדחוף את ווים הפה בחזרה לתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין. חפש את העיקולים החדים בשני הענפים הראשיים בצבע כהה יותר של קנה הנשימה כי לרוץ במורד שני צידי הזחל.דיסקי הכנף נמצאים ממש מתחת. הסר בעדינות את הדיסקים והכניס אותם למדיית HL3 בשקופית המוכנה כדי לוודא שאף פיסות קנה הנשימה עדיין מחוברות לדיסקים. מסדרים את דיסקי הכנף כך שהצד הקדמוני של כיס הכנף פונה כלפי מעלה כשהדיסק מונח שטוח.מכסים את הכנף עם כיסוי וחותמים עם לק. לאחר הלק יבש, מיד להמשיך עם הדמיה. תמונה דיסק הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה שמן 40X לייזר 488 ננומטר.לאסוף תמונות במהירות של שני הרץ במשך שתי דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הגדר את כוח הלייזר חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים משחררי DPP כדי למנוע הלבנת יתר. לאסוף את התמונות כסדרת זמן ולייצא אותם כקבצי AVI כדי לקבל וידאו של שחרור DPP.כאשר הפרוטוקול מצליח, DPP-GFP מופיע כפס במרכז דיסק הכנף עם גרעינים הנראים כעיגולים שאינם פלואורסצנטיים. שחרור DPP-GFP גלוי כנקב פלואורסצנטי המופיעים ונעלמים הן פנימה והן הרחק מגופי התא. הפנצטה המובהק עשויה להיות בצייטונים או בסינאפסות ציטונס.דיסקי הכנף מותקנים כך שההדמיה נעשית מהצד הקרדיאלי. אם דיסק הכנף הוא בתמונה מהצד ההפוך, פלואורסצנטיות DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס והרזולוציה תהיה ירודה. כאשר GFP אינו מותך DPP, אין puncta מחוץ לגופי התא נצפו.פקד זה מדגים כי DPP-GFP מתנהג בצורה שונה מאשר GFP בלבד. יתר על כן, אין פנצטה פלואורסצנטי להופיע כאשר DPP-GFP אינו בא לידי ביטוי. במהלך הליך זה, חשוב כי דיסק הכנף נטען צד peripodial למעלה.אם דיסק הכנף אינו מונחה כראוי, DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את שחרורו של ליגנדים איתות התפתחותי אחרים כמו wingless או קיפוד. אנו יכולים לחקור את כל הגורמים הסביבתיים והגנטיים השונים שעשויים להשפיע על שחרור DPP.בנוסף, אנו יכולים להתאים שיטה זו כדי ללמוד שחרור BMP מסוגי תאים אחרים.

imaging-dpp-release-from-a-drosophila-wing-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד...

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

חקור שחרור Dpp מדיסק כנף של Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על דינמיקת השחרור ומנגנוני פיתוח.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים