שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה
30 באוקטובר 2019
עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.
DPP להשפיע על גורל התא על ידי קולטני קשירה ושליחת אות תאיים כדי להשפיע על שעתוק. אם DPP מיוצר אך לא שוחרר, אין לו גישה לקולטנים ולכן אינו יכול לבצע את תפקידיו. טכניקה זו מאפשרת לדמיין שחרור DPP המאפשר לחוקרים לבחון אילו גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את דינמיקת שחרור DPP.
מסלול האיתות של BMP שמור מזבובים לבני אדם ולכן אנו מצפים כי המנגנון המכתיב שחרור DPP יהיה רלוונטי גם להתפתחות אנושית והתחדשות. התחל על ידי חציית 30 עד 40 בתולה נקבה DPP GAL4 זבובים עם 10 עד 15 זבובים זכר UAS DPP-GFP. לעודד הטלת ביצים על ידי הוספת כמות קטנה של משחת שמרים לבקבוקון טרי של מזון.
כדי לאסוף את הביצים, להפוך את הזבובים המוצלבים לתוך הבקבוקון ולאפשר להם להטיל במשך שלוש עד ארבע שעות לפני הסרתם. שמור את בקבוקוני איסוף הביצים ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ 144 שעות עד הזחלים נמצאים בשלב instar השלישי. לאחר מכן בחרו את הזחלים המתאימים לפירוק.
ראשית, לבחור זחלים שאינם שחפת אשר יהיה אורך נורמלי ולא קצר ושומן. כדי לבחור את ה- DPP-GFP המבטא זחלים, הצג אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. כל הזחלים שאינם TB יהיו קצת פלואורסצנטיות, אבל GFP מוגבל דיסקי הכנף והוא פחות בהיר על הזחלים DPP-GFP.
הכן מדיה HL3 שונה על פי הוראות כתב יד אשר ישמור על דיסקי הכנף בחיים להדמיה. התאם את ה- pH ל- 7.1 באמצעות HEPES ולאחר מכן סנן אותו באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22. מקם שתי חתיכות של רוחב סרט דו-צדדי חסר צבע לאורך שקופית מיקרוסקופ והשאיר רווח של כ-5 מילימטרים ביניהן וודא שקצוות הקלטת סמוקים עם קצות השקופית.
השתמש בקצה שטוח כדי ללחוץ היטב על הקלטת לשקופית. הוסף 25 מיקרוליטרים של מדיה HL3 שונה בין שתי חתיכות של קלטת. כאשר דיסק הכנף מותקן במדיה, פיסות הקלטת ימנעו ממנו להימחץ על ידי העטיפה.
כדי לנתח את הזחל, מקם אותו במדיה HL3 שונה בעדינות לקרוע אותו לשניים באמצעות שני זוגות של מדפים. השלך את החצי האחורי, ואז לתפוס את אמצע המחצית הראשונה עם זוג אחד של ממטרות ולהשתמש בזוג השני כדי לדחוף את ווים הפה בחזרה לתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין. חפש את העיקולים החדים בשני הענפים הראשיים בצבע כהה יותר של קנה הנשימה כי לרוץ במורד שני צידי הזחל.
דיסקי הכנף נמצאים ממש מתחת. הסר בעדינות את הדיסקים והכניס אותם למדיית HL3 בשקופית המוכנה כדי לוודא שאף פיסות קנה הנשימה עדיין מחוברות לדיסקים. מסדרים את דיסקי הכנף כך שהצד הקדמוני של כיס הכנף פונה כלפי מעלה כשהדיסק מונח שטוח.
מכסים את הכנף עם כיסוי וחותמים עם לק. לאחר הלק יבש, מיד להמשיך עם הדמיה. תמונה דיסק הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה שמן 40X לייזר 488 ננומטר.
לאסוף תמונות במהירות של שני הרץ במשך שתי דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הגדר את כוח הלייזר חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים משחררי DPP כדי למנוע הלבנת יתר. לאסוף את התמונות כסדרת זמן ולייצא אותם כקבצי AVI כדי לקבל וידאו של שחרור DPP.
כאשר הפרוטוקול מצליח, DPP-GFP מופיע כפס במרכז דיסק הכנף עם גרעינים הנראים כעיגולים שאינם פלואורסצנטיים. שחרור DPP-GFP גלוי כנקב פלואורסצנטי המופיעים ונעלמים הן פנימה והן הרחק מגופי התא. הפנצטה המובהק עשויה להיות בצייטונים או בסינאפסות ציטונס.
דיסקי הכנף מותקנים כך שההדמיה נעשית מהצד הקרדיאלי. אם דיסק הכנף הוא בתמונה מהצד ההפוך, פלואורסצנטיות DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס והרזולוציה תהיה ירודה. כאשר GFP אינו מותך DPP, אין puncta מחוץ לגופי התא נצפו.
פקד זה מדגים כי DPP-GFP מתנהג בצורה שונה מאשר GFP בלבד. יתר על כן, אין פנצטה פלואורסצנטי להופיע כאשר DPP-GFP אינו בא לידי ביטוי. במהלך הליך זה, חשוב כי דיסק הכנף נטען צד peripodial למעלה.
אם דיסק הכנף אינו מונחה כראוי, DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את שחרורו של ליגנדים איתות התפתחותי אחרים כמו wingless או קיפוד. אנו יכולים לחקור את כל הגורמים הסביבתיים והגנטיים השונים שעשויים להשפיע על שחרור DPP.
בנוסף, אנו יכולים להתאים שיטה זו כדי ללמוד שחרור BMP מסוגי תאים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את דינמיקת השחרור של חלבון Bone Morphogenetic Protein (BMP) מסוג Dpp ב-Drosophila, תוך הדגשת האופן שבו עיתוי החשיפה שלו משפיע על תוצרי ההתפתחות. הטכניקה שפותחה מאפשרת ויזואליזציה של שחרור Dpp, ובכך מספקת תובנות לגבי הגורמים הגנטיים והסביבתיים המשפיעים על תהליך זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אותיות תאיות
רקע
- Dpp משפיע על גורל התא על ידי קישור לקולטנים והפעלת אותות תוך-תאיים.
- ללא שחרור, Dpp אינו יכול להגיע לקולטנים שלו ולבצע את תפקודיו.
- מחקר זה משתמש בטכניקות דימוי כדי להמחיש ויזואלית את שחרור ה-Dpp.
- מסלול האותות של BMP נשמר מבחינה אבולוציונית, מה שמרמז על רלוונטיות לביולוגיה אנושית.
מטרת המחקר
- להדמיית השחרור של Dpp מתאי דיסק הכנף.
- לבחינת האופן שבו גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את דינמיקת השחרור של Dpp.
- להבנת ההשלכות של שחרור Dpp על התפתחות והתחדשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכלאה של זבובים מסוג DPP GAL4 עם זבובים מסוג UAS DPP-GFP.
- עידוד הטלת ביצים באמצעות משחת שמרים.
- טכניקות דימוי להדמיית שחרור Dpp.
- ניתוח של השפעות גנטיות וסביבתיות על דינמיקת השחרור.
תוצאות עיקריות
- המחקר מציג באופן ויזואלי בהצלחה את שחרור ה-Dpp מהתאים.
- מזהה גורמים מרכזיים המשפיעים על דינמיקת השחרור של Dpp.
- מדגים את השימור של מסלולי האיתות של BMP.
- מספק תובנות רלוונטיות להתפתחות ולרגנרציה בבני אדם.
מסקנות
- הבנת שחרור Dpp חיונית להשגת תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על רפואה רגנרטיבית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקות אלו כדי לחקור BMPs אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
הדמיה של דינמיקת שחרור ליגנדים נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרה (target validation) על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על הזמינות של אותות השליח, דבר החיוני להערכת חוזקה של השערה טיפולית. שיטה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי הבהרה האם ליגנד יכול להיקשר לקולטן שלו בהקשר ביולוגי רלוונטי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי באסטרטגיות של מודולציית מסלולים, במיוחד עבור רשתות סיגנלינג שמורות כגון BMP/TGF-β.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של שחרור ליגנד כתנאי מוקדם להיקשרות לקולטן ולהעברה של אותות.
- ערך תפעולי: מספק קריאה ישירה של זמינות הליגנד, ובכך מפחית עמימות בנוגע למנגנון הפעולה של המטרה.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אישור שהפרעות גנטיות או סביבתיות משפיעות על נגישות הליגנד, ולא רק על ביטויו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יוצר נקודות פלואורסצנטיות (puncta) כמותיות כמדד לאירועי שחרור, מה שמאפשר סריקה השוואית של מודולטורים גנטיים או כימיים.
- ערך תפעולי: משתמש בפרוטוקולי נתיחה והרכבה סטנדרטיים כדי להבטיח תנאי דימות הניתנים לשחזור בין ניסויים שונים.
- ערך מדעי: מספק נתונים ברזולוציית זמן שניתן לקשר למצבי הפעלה של מסלולים לצורך עידון הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: רתימה של השימור האבולוציוני של סיגנל BMP לגיבוש השערות לגבי מנגנוני שחרור ליגנדים אנושיים בהתפתחות ו برجנרציה.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה לליגנדים התפתחותיים אחרים (למשל, Wingless, Hedgehog), מה שמרחיב את התועלת על פני מחלקות שונות של מסלולים.
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של שחרור ליגנדים במערכות הרלוונטיות למחלות על ידי קישור דינמיקה תאית לתוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת תיקוף בשלב מוקדם של תפקוד הליגנד, בטרם השקעה במאמצי סריקה בשלבים מאוחרים יותר או באופטימיזציה של מועמדים מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת את ההשערה שליגנד אינו רק מבוטא, אלא גם משתחרר וזמין להיקשרה לקולטן.
- סריקה: מפיקה נתוני דימוי כמותיים בשיטת time-lapse המתאימים לניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis) של קינטיקת השחרור בתנאים משתנים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים (שכיחות, התפלגות ומשך של נקודות פלואורסצנטיות - puncta) התומכים בהשוואה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקת השחרור של הליגנד לבין פנוטיפים התפתחותיים, ובכך תומכת בהשלכה על ביולוגיה אנושית באמצעות שימור של מסלולים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוי רב-שימוש לחקר מנגנוני שחרור של ליגנדים מאותתים מרובים לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי אישור נגישות הליגנד, שלב מפתח שלעיתים קרובות מסיקים אותו במקום למדוד אותו.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הכנה סטנדרטית של הדגימות ובקרות אוריינטציה (צד הפריפודיאל כלפי מעלה).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי סינון מטרות על בסיס זמינות פונקציונלית של הליגנד, ולא רק על בסיס רמות ביטוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות שהליגנדים שלהן מפגינים שחרור מווסת ברקמות רלוונטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, דיסקציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית עם עדשת שמן 40X ולייזר 488 nm לגילוי אופטימלי של האות.
- מחייב הכנה סטנדרטית של מצע גידול (HL3 מושנה, pH 7.1, עם בופר HEPES, מסונן) כדי לשמור על חיוניות הרקמה במהלך ההדמיה.
- דורש אוריינטציה עקבית של הדגימה (דיסקת כנף כאשר הצד הפריפודיאלי פונה כלפי מעלה) כדי למנוע ארטיפקטים של מישור המיקוד ולהבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.
- מוגבל להדמיית רקמות ex vivo; אינו ישים עבור אורגניזמים שלמים או סריקה של בעלי חיים חיים בתפוקה גבוהה.
