קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים

האתרים השכיחים ביותר עבור גרורות הם בלוטות הלימפה המקוריות. Somatids ניתן להשתמש כדי לזהות את הזיקה דבק בין תאים סרטניים'לימפה קטעים במבחנה. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא כי קטעי בלוטות לימפה טריים מספקים מורכבות טבעית של הרקמה המקורית, אשר לא ניתן יהיה לשחזר באמצעות חלבונים מטוהרים.

שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור מחקרים אונקולוגיים מולקולריים המבקשים לזהות גנים או טיפולים המפריעים להית הידבקות של תאים סרטניים באיברים יעד גרורתי, כמו בלוטות הלימפה. כדי לקצור את בלוטות הלימפה בתוך שלושים דקות של הקרבה, מניחים את חולדת Wistar הבוגרת בהפוגה הגבית על לוח ניתוח נקי בטמפרטורת החדר ומרססים את הפרווה ב-70% אלכוהול isopropyl. באמצעות מכשירים מעקרים, להרים את עור הבטן ולעשות חתך עור מתווך לחשוף את הקרביים הבטן.

לחלץ את המעי עד בלוטות הלימפה בבית החזה והבטן להיות גלוי. באמצעות מספריים קהה קצה, בזהירות excise בלוטות הלימפה מבלי לפגוע העורק mesenteric מעולה הבסיסית, ולמקם את בלוטות הלימפה לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS סטרילי. כאשר כל בלוטות הלימפה נקצרו, מניחים צומת לימפה אחד לכל cryomold עם הפנים כלפי מטה על הבסיס של כל עובש ולהוסיף בדיוק מספיק טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית כדי לכסות את הרקמות.

לאחר הקפאה הצמד, להשתמש cryostat לרכוש 5 עד 8 חלקים עבים מיקרומטר ב 22 מעלות צלזיוס ולאסוף את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. קריוסקציות באיכות טובה מפרוסות רצופות של אותו צומת לימפה הן קריטיות למזעור ההבדלים בין פרוסות, והקלה על שיעורי הידבקות עקביים בתאים. עבור תיוג תאים סרטניים, לקצור את התאים של עניין מתרבות התא מבוים כראוי מחדש להשעות את התאים ב 1 x 10 ל 6 תאים לכל ריכוז mL ובינוני ללא סרום.

להעביר 1 מ"ל של תאים לתוך צינור חרוט 15 מ"ל חדש ולתייג את התאים עם 2 מיקרוגרם לכל ML DiI (C18) במשך עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה בחמש דקות כדי למנוע מים בתאים. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים המסומן פעמיים עם 10 מ"ל של מדיום טרי ללא סרום כדי להסיר כל צבע עודף. לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את התאים ב 1 x 10 כדי 6 תאים לכל mL של מדיום ללא סרום, בתוספת 0.1% ריכוז אלבומין בסרום bovine.

המשך של תאים סרטניים שכותרתו על החלקים רקמת בלוטות הלימפה שנקטפו, בעדינות לשטוף את החלקים פעמיים PBS, ואחריו לחות מחדש PBS טרי במשך רבע שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם אלבומין סרום 2.5% bovine במשך שלושים דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני השימוש ספוגית כותנה לייבש את המגלשות. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מחסום סביב כל קטע ולהוסיף 100 microliters של תאים מסומנים על כל צומת לימפה מוקף.

לאחר שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח, הסר את כל התאים שאינם דבקים בארבעה שטיפות עדינות ב- PBS ותקן את תאי הפלואורסצנטיות הדבקים הנותרים עם 3.7% פורמלדהיד ב- PBS במשך רבע שעה בטמפרטורת החדר. לכימות מדד דבק, השתמש במטרה 10x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבל תמונות TIFF בודדות של כל קטע בשדות פלואורסצנט בהירים ואדומים. לאחר מכן, תן שם ושמור את התמונות באופן שיטתי לפני פתיחת התמונות בפיג'י.

לאחר הגדרת קנה המידה, השתמש בכלי מצולע כדי לבחור את אזור העניין שיש לכמת. בחר כדי לכמת את אזור בלוטות הלימפה. הנתונים יבואו לידי ביטוי במילימטרים רבועים.

לאחר מכן, בחר תוספים, נתח, מונה תאים ולחץ על התמונה לכמת. לחץ על אתחל ובחר סוג מונה. לאחר מכן, לחץ על התאים בתמונה.

מדד הידבקות בלוטות הלימפה יבוא לידי ביטוי כמספר תאי הגידול חסידים לכל אזור מכוסה בלוטות הלימפה. כדי לאתחל את התמונה הבאה, פתח את התמונה הבאה וחזור על הכימות כפי שהוכח. כפי שנצפה, המורפולוגיה של התאים חסיד מעוגל בצורה, ואת התאים מפוזרים הטרוגנית לאורך כל צומת הלימפה של עניין.

מדד הידבקות בלוטות הלימפה הוא פי שניים עד שלושה גבוה יותר בקווי תאים שליליים של סרטן השד NDRG4, בהשוואה לזה שנמדד עבור תאים חיוביים תואמים NDRG4. הליך זה יכול להיות מותאם כדי לסייע שיעורי הידבקות ברקמות יעד גרורתיות אחרות, כמו המוח או הריאות, כדי להעריך את האתרים המועדפים משנית של הידבקות עבור תאים סרטניים ממורנים. זכור כי הן רקמות טריות וקפואות צריך להיחשב biohazardous ויש לטפל באמצעות אמצעי זהירות ביו-בטיחות מתאימים.