אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה מאפשר הן דרמטיזציה חסכונית בזמן של אנטיביוטיקה ידועה ללא שימוש בציוד מיוחד. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא התאמה אישית של תבנית. משמעות הדבר היא כי אדם יכול להתאים אילו גנים התנגדות שהם רוצים לכלול בתבנית הספרייה שלהם מבוסס על הרמה הרצויה של ספציפיות מצע רחב או צר שלהם.

לדוגמה, בטא לקטם מבטא תבנית E.coli ניתן להכין על מנת לאפשר dereplication ספציפי מאוד של בטא לקטמים וכיתות המשנה השונות שלהם. באמצעות טכניקת ספיגה, פיפטה 500 microliters של cation מותאם MHB ממאגר סטרילי לתוך כל באר של סטרילי, 96 צלחת באר עמוקה. עם לוחות זן ARP או MARP מוכנים, השתמש במקל המוליך כדי לחסן את צלחת באר עמוקה 96 בהתאם למפת ARP או MARP.

מניחים קרום איטום נושם על פני השטח של צלחת באר עמוקה להדק אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד. ודא כי אין בארות מזוהמות. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מעבירים 100 מיקרוליטרים מכל באר של צלחת הבאר העמוקה לצלחת תחתונה סטרילית של 96 בארות.

מוסיפים 100 מיקרוליטרים של 50% גליצרול סטריליים לתוך כל באר ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה. הכינו לפחות חמש צלחות ספרייה. מכסים את הצלחות עם אטמי אלומיניום סטריליים ומבטיחים שכל באר אטומה בנפרד.

מניחים את מכסה הצלחת על גבי אטם האלומיניום ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. באמצעות מקל מוליטור עץ, בעדינות לגרד נבגים מפני השטח של מושבת סטרפטומיצ'ים ולהעביר אותו לתוך מבחנה המכילה חרוז זכוכית סטרילי אחד ושלושה מיליליטר של מדיום אנטיביוטי סטרפטומיציס. סגור את המבחנה באופן רופף עם כובע כדי לאפשר aeration.

באמצעות אותו מקל המוליך מעץ, פס שליטה סטריליות על צלחת פטרי המכיל אגר של בנט. דגירה הצינור המכיל תרבות זרעים ב 30 מעלות צלזיוס עם aeration במשך שישה ימים ב 250 סל"ד ואת צלחת בקרת סטריליות ב 30 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים. לאחר מכן, על משטח מפלס, להכין צלחות dereplication.

שאפו 23 מיליליטר של אגר חם של בנט לתוך פיפטה סרולוגית ולחלק 20 מיליליטר באופן שווה על פני השטח של צלחת פטרי מלבנית, משאיר את שאר המדיום בפיפטה כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. כסו את הצלחת במכסה. מסובבים בעדינות את הצלחת עד שהמדיום מכסה את כל אזורי הצלחת ולא מפריעים לה עד שהגר מוגדר לחלוטין.

לאחר מכן, להכין יריעות קרום nitrocellulose באמצעות מכסה צלחת פטרי מלבני כתבנית מעקב, כך הסדינים להתאים את פני השטח של צלחת dereplication. חותכים את הסדינים ומקלים אותם אוטומטית בשקית סטרילית. עכשיו, לבדוק את לוחית בקרת הסטריליות כדי להבטיח כי אין מזהמים נוכחים לאחר שישה ימים של דגירה.

אם ללא זיהום, הסר את המכסה של צלחת פטרי מלבנית פיפט 200 microliters של תרבות הזרעים על פני השטח של אגר של בנט בצלחת מלבנית. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להפיץ באופן שווה את התרבות על פני השטח של הצלחת כולה. כדי למקם את קרום nitrocellulose מוכן על גבי התרבות על פני השטח של צלחת פטרי, ליישר את הקצה התחתון של הממברנה לקצה התחתון של צלחת פטרי לאט להחיל את הממברנה מהקצה התחתון לקצה העליון של הצלחת.

השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחליק את כל בועות האוויר שאולי נוצרו בין ממשק אגר קרום, להבטיח כי הממברנה הוא סומק אל אגר. הממברנה מאפשרת לאורגניזמים להתפזר על פני השטח שלה בעוד מטבוליטים משניים עשויים להיות מופרשים לתוך המדיום שמתחת. שים את המכסה בחזרה על צלחת פטרי מלבנית והניח אותו במהופך בשקית ניילון אטומה.

דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים. לאחר שישה ימים, להסיר את צלחת dereplication מן החממה. באמצעות פינצטה סטרילית, הסר בזהירות את קרום הניטרוסלולוס מפני השטח של אגר בנט.

ודא שיש רק צמיחה נבגים קלה סביב הקצוות של הצלחת כדי להקטין את הסיכויים של זיהום שכבת היתר להתווסף. ודא שמשטח העבודה הוא ברמה ולהשתמש פיפטה סרולוגית כדי לשאיף 23 מיליליטר של אגר MHB מותאם חיתוך חם. צור כיסוי על ידי חלוקת 20 מיליליטר באופן שווה על פני השטח של צלחת dereplication, משאיר את שאר אגר בפיפט כדי למנוע היווצרות בועת אוויר.

מניחים את המכסה על הצלחת. מסובבים בעדינות את הצלחת עד שהמדיום מכסה את כל האזורים ולא מפריעים לו עד שהגר מוגדר לחלוטין. לאחר מקורר ומצק, להחזיר את צלחת dereplication לשקית ניילון אטום ולאחסן אותו במהופך בארבע מעלות צלזיוס לילה, המאפשר דיפוזיה של מטבוליטים משניים לתוך כיסוי MHB אגר.

באותו יום, לחסן תבנית ARP או MARP טרי על ידי צינור הראשון צינור 100 microliters של MHB מותאם הקטיון לתוך כל באר של צלחת 96 באר. מוציאים את צלחת ספריית ARP או MARP במלאי הקפוא מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הסר את חותם האלומיניום לפני עיבוי מתחיל להיווצר על החלק התחתון שלה.

בעזרת כלי הצמדה סטריליים של 96 בארות, יש להצמיד בזהירות מהמלאי הקפוא ARP או מצלחת ספריית MARP ולחסן את ה-MHB הטרי המכיל צלחות של 96 בארות. כדי למזער את הזיהום במהלך dereplication, להכין כמו לוחות ספריית ARP או MARP רבים הדרושים רק dereplicate שניים עד שלושה לוחות dereplication לכל צלחת הספרייה. לאחר השלמת, לשים חותם אלומיניום סטרילי חדש על התבנית הקפואה ולהחזיר אותו למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

מניחים את הצלחות מחוסנות 96 באר בתוך שקית ניילון אטום באופן רופף דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד במשך 18 שעות. הסר את התבנית ARP או MARP מהאינקובטור וודא שלא קיימים מזהמים על-ידי השוואת הלוח למפת התבנית ARP או MARP. מוציאים את צלחות הדרפילציה מארבע מעלות ומאפשרים לצייד לטמפרטורת החדר.

אם יש עיבוי, לפתוח את המכסים ולאפשר להתייבש בסביבה סטרילית. בעזרת כלי הצמדה סטריליים, הצמד מצלחת ספריית ARP או MARP אל פני השטח של שכבת-על של MHB agar של לוחות הדרפילציה. תיזהר לא לנקב את אגר.

אפשר לתבנית להתייבש למשך שלוש עד חמש דקות. מניחים את צלחות הדרפילציה מחוסנות במהופך בשקית ניילון אטומה ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לנתח את תוצאות dereplication על ידי השוואת הצמיחה על צלחת dereplication ל בארות התואמות את מפת ARP או MARP.

בזרימת עבודה זו של ARP או MARP dereplication, הושגה תוצאת dereplication חיובית. איפה התמצית מוכנה עבור המתח WAC 8921 זוהה כמפיק כלוראמפניקול. חוסר הצמיחה ARP מציין את נוכחותו של אנטיביוטיקה לא ידועה או אנטיביוטיקה פחות נפוץ כי לא היה בחשבון בצלחת ספריית ARP או MARP.

דפוס צמיחה ייחודי MARP נוצרה בגלל ניצול של סוג פראי E.coli BW25113 ו מוטציה היפר חדירה ו- e-flux לקוי E.coli BW25113 bamB tolC. תוצאה זו מרמזת על נוכחות של תרכובת עם פעילות מיקרוביאלית שלא הצליחה לעלות על קרום החיצוני שלם. דפוסי צמיחה E.coli זה מרמז על עיקור לא תקין של כלי הצמדה, וכתוצאה מכך העברת זנים E.coli לא ידוע על פני שכבת-על.

ודוגמה של זיהום צלחת ספריית מלאי קפוא ARP או MARP מוצג כאן עם שלוש מושבות E.coli ברורות גדל על משטח צלחת פטרי מלבני. תוצאה זו מצביעה על כך שכבת-על אגר נוקב במהלך dereplication. זיהום הקשורים שכבת MHB יכול להתרחש גם במהלך תהליך dereplication, מראה דפוס צמיחה לא סדיר על פני השטח של שכבת-על.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא להשתמש עיקור נאות וטכניקות aseptic על מנת להבטיח כי אתה לא מוחזק בכל שלב עקב זיהום. זה כולל הכנת קרום nitrocellulose כך שיתאים לפני השטח של צלחת אגר של בנט קרוב ככל האפשר על מנת למזער את התפשטות הנבגים בעת שפיכת כיסוי MHB. בנוסף, חשוב מאוד להשתמש בציוד הצמדה מעוקר כראוי בעת חיטוי לוחות הספרייה ו dereplicating על מנת לייצר את התוצאה הנקייה ביותר.

בנוסף dereplicating אנטיביוטיקה ידועה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי מתודולוגיות אשר ניתן להשתמש בהם בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימת כדי להציל את פעילותם. למרות dereplication אנטיביוטי הוא לא טכניקה חדשה, זה ידוע לשמצה להיות משאבים אינטנסיבי זמן רב. פלטפורמת ARP ו MARP לעזור לשפוך אור על איך dereplication אנטיביוטי לא צריך להיות ייצור גדול, אלא ניתן להשלים על פני תקופה של שבועיים באמצעות ציוד מינימלי.