פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

מודלים המחלה הנוכחית עבור אובדן תאים אנדותל הקרנית להתמקד בהרס של אנדותל וסביר יותר לייצג את השלבים הסופיים של המחלה כאשר השתלת הקרנית היא בלתי נמנעת. טיפולים חדשים באמצעות תאי גזע או ריפוי גנטי, עם זאת, זמינים כעת כי יכול להיות שימושי יותר עבור השלבים המוקדמים של המחלה, המודלים שעבורם חסרים. ניתוח תוך עיני פולשני לא פולשני על ידי פוטודירופציה באמצעות לייזר Nd:YAG הפך הליך שגרתי עבור רופאי עיניים.

לאחר קבלת עיני פורצ'ין טריות מבית המטבחיים המקומי, מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מדיום מלא. השתמש במספריים כדי להסיר את הרקמות החוץ תאיות ולהשרות את העיניים בתספוס עיניים יוד 5%povidone במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות המחטאות ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.

באמצעות התקן טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות תחום ספקטרלי, לסנן את העיניים עבור פתולוגיות קטע מרכזיות לפנים כגון צלקות הקרנית, בצקת, ואטימות אחרות. לאחר ההקרנה, מקם את העיניים מול יחידת מנורת החלקה המצוידת בלייזר Nd:YAG עם אורך גל של 1, 064 ננומטר וקוטר נקודת מוקד של 10 מיקרומטר באוויר. בחרו בהגדלה של פי 12 והסיטו את התאורה כדי לדמיין את שכבות הקרנית הבודדות.

לאחר הגדרת אנרגיית הדופק ונקודת המיקוד לפרמטרים המתאימים לאבלציה הסלקטיבית של תאי ה אנדותל הקרנית, החל מספר יריות לייזר על הרקמה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ ניתוח, מניחים מצנח קרנית ברור קרוב ללימבוס ומזריקים ויסקולסטי כדי לייצב את התא הקדמי. לאחר מכן השתמשו בטרפין באורך שמונה מילימטרים כדי למלמל את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר ולהמקם את הקרנית המבודדת לתוך באר אחת של צד אנדותל צלחת 12 היטב למעלה.

לאחר איסוף כל הקרניות, הוסיפו שלושה מילימטרים של מדיום מלא לכל דגימה היטב והדגירה את הדגימות עד שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, החליפו את המדיום בכל באר ב-4% פרפורמלדהיד ללא מתנול במאגר של סורנסן עבור דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הדגימות הקבועות ב 20% סוכרוז ב PBS במשך כשעה עד הקרניות לשקוע.

מעבירים את הדגימות ל-30% סוכרוז ב-PBS בן לילה לפני הטמע את הרקמות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש קריוסטט להגדיר מינוס 27 מעלות צלזיוס כדי להשיג 10 חלקים עבים מיקרומטר של רקמות קפואות איסוף כל קטע על שקופית מיקרוסקופ בתוך דקה אחת של זה נרכש. לאחר מכן לאחסן את השקופיות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הכתם.

עבור כתמי המטוקסילין ואאוסין, האוויר מייבש את החלקים הקפואים במשך מספר דקות כדי להסיר לחות לפני הכתמה עם המטוקסילין מסונן של מאייר במשך 10 דקות בצינור 50 מיליליטר. בסוף הדגירה, שוטפים את המגלשות במים מזוקקים כפולים במשך חמש דקות בקובט. לאחר מכן, טובלים את המגלשות ב-0.5% אאוסין 10 פעמים, ואחריהן טובלים במים מזוקקים כפולים עד שהאוסין מפסיק לפסים.

טובלים את השקופיות שטוף 10 פעמים ב 50% אתנול ו 10 פעמים 70% אתנול. לאחר מטבל האתנול האחרון של 70%, יש לצייד את החלקים ב-95% אתנול למשך 30 שניות, ואחריו 60 שניות ב-100% אתנול לפני מספר מטבלים בקסילן. לאחר מכן הר את הדגימות עם כיסוי לפני קבלת תמונות על מיקרוסקופ אור.

יש להעריך באופן עצמאי שתי תמונות מיקרוסקופיה של פוטון ואור ללא נזק, נזק רב מדי או כמות נכונה של נזק. בהתבסס על הערכות אלה, מפת חום לאחר מכן ניתן לחשב כדי לבחור את הקונסטלציה הנכונה של פרמטרי לייזר עבור אבלציה סלקטיבית של תאי אנדותל הקרנית עם נזק מינימלי לרקמה שמסביב. ניתוח קודם קבע כי המוקד של הלייזר חייב להיות לפחות 0.15 מילימטרים מאחורי אנדותל הקרנית עבור אנרגיית הדופק הנמוכה ביותר שנבדקה.

עבור אנרגיות דופק גבוהות מ-2.9 מילי-ג'אול, מרחק המוקד הארוך ביותר שנבדק עדיין קרוב מדי לא אנדותל. סוכנים ציטופרוטקטיביים שונים יכולים להיבדק בזמן שהדגימות הנפלטות נמצאות בתרבות. אם הוכח מוצלח, הם יכולים להתווסף לפתרון ההשקיה לטיפול.