פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

ביוניקה מבוססת הידרוג'ל של GelMA הופכת לפופולרית מאוד בהדפסה ביולוגית תלת-מימדית. עם זאת, צמיגות נמוכה מגבילה את יכולת ההדפסה שלה. כאן אנו חולקים אסטרטגיות להדפסת GelMA במעבדה שלנו עם חוקרים אחרים.

בסרטון זה אנו מנצלים באופן מלא את המאפיינים המיוחדים של ביו-חומר זה ומציעים מספר שיטות הדפסה למבנים תלת-ממדיים שונים אשר יכולים לתרום ליישומים ביו-רפואיים נוספים. כדי לקחת נזק לאיברים למשל השלכות הם פוטנציאל לשמש לתוך הטיפול המתאים על ידי הזרקת הטבעה או מעקב אחר מבני GelMA מודפסים. זה לא יהיה קל לחלוטין להמיס את GelMA מיובש בהקפאה בזמן קצר.

כדי להאיץ את תהליך ההמסה ניתן להשתמש במיקסר מערבולת. כל ביו-חומר ישתמש במאפיינים מיוחדים אינטימיים של GelMA. הצעתי chemer חדש צריך כראוי לשוטט של מה הוא מיזוג קריטי בעת ההדפסה.

פרטי הפעולה קובעים את ההצלחה של הליכי הדפסה. לכן אנו בוחרים הדגמה חזותית לחלוק עם חוקרים אחרים. כדי להמציא מיקרוספרות להתחיל על ידי חיבור שני אלקטרודות טבעת מתכת עם קרקע מוטות חיוביים.

מניחים את לוחית המתכת המחוברת למתח הגבוה מתחת לאלקטרודה הטבעתית ותבשיל פטרי עם שמן סיליקון על צלחת המתכת כמקלט טיפה. הכן דיו ביולוגי על ידי המסת GelMA מיובש בהקפאה ו- LAP ו- DPBS לסנן אותו דרך מסנן מיקרומטר 0.22 עבור סטריליות ולאחר מכן לחמם אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ניתוק תאי מד"א-MB-231 עם שלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין ו-0.02 אחוז פתרון EDTA למשך שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם ב 100 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ומערבבים את התאים עם מיליליטר אחד של דיו ביולוגי מוכן על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה הקפדה על הימנעות בועות אוויר. שאף מיליליטר אחד של תערובת הדיו הביולוגית והתאים למזרק סטרילי של שלושה מיליליטר.

להאכיל את הדיו הביולוגי על ידי הכוח של אוויר דחוס ולשים את המזרק על המתקן. הפעל את מתח המתח הגבוה והגדר את המתח כאפס עד ארבעה קילו-וולט. בו זמנית להפעיל את אור אורך הגל 405 ננומטר כדי לחצות את טיפות GelMA בחמישה מיליליטר של שמן סיליקון.

Decant צלחת פטרי להיפטר רוב שמן הסיליקון ולהשתמש בכף כדי להעביר את השמן הנותרים מיקרוספרות לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. מוסיפים חמישה מיליליטר של DPBS ומנערים את התערובת צנטריפוגה הצינור ב 100 פעמים G ולהסיר את supernatant. מעבירים את המיקרוספרות לצלחת פטרי עם DMEM ומתרבים אותן ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי פחמן דו-חמצני למשך שלושה ימים.

לאחר שלושה ימים להשליך את המדיום ולשטוף את המיקרוספרות עם DPBS. לתקן אותם עם שני מיליליטר של ארבעה אחוז PFA במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז להשליך את PFA ולחזור על לשטוף. Permeabilize התאים עם שני מיליליטר של 0.5 אחוז פעילי שטח שאינם יוניים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר להשליך את פעילי השטח ולשטוף את המיקרוספרות עם DPBS.

לאחר מכן להכתים את התאים עם TRITC-פאלודין במשך 30 דקות ולאחר מכן DAPI במשך 10 דקות בחושך להשליך את הצבעים לשטוף את הכדורים עם DPBS לאחר כל כתמים. תדמיין את המיקרוספרות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקל. ממיסים אבקת נתרן אלגינט מעקרת במים מיונים ביחס משקל של שני אחוזים לנפח.

הכינו פתרון ביו-דיו סטרילי כפי שתואר קודם לכן ואז מחממים את הדיו הביולוגי ואת נתרן אלגינט באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. Trypsinize ו צנטריפוגה bMSCs על פי ההליך שתואר קודם לכן עבור תאים MDA-MB 231 ולאחר מכן להסיר את הנוזל על טבעי לשימוש חוזר את גלולת התא עם 2 מיליליטר של הדיו הביולוגי GelMA. שאפו שני מיליליטר של תערובת תאי הביו-דיו למזרק של 10 מיליליטר ושני מיליליטר של תערובת נתרן אלגינט למזרק אחר.

הזן את הפתרונות עם שתי משאבות מזרק ביו דיו ב 50 מיקרומטר לדקה נתרן alginate ב 350 מיקרומטר לדקה. הפעל את אור אורך הגל של 405 ננומטר כדי להקרנין את הצינור השקוף ולהצליב את סיבי GelMA. השתמש צלחת פטרי כדי לקבל את הסיבים ולאסוף אותם עם כפית.

מעבירים את הסיבים לצלחת עם DMEM/F12 ומתרבים אותם במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר culturing התאים בצע את ההוראות שתוארו בעבר להתבוננות בסיבים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ממיסים GelMA מיובש בהקפאה ו- LAP ו- DPBS ומוסיפים פיגמנט אכיל מגנטה לפתרון כדי לשפר את דיוק ההדפסה.

מסננים את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 לסטריליות ומחממים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לבנות את הדגמים 3D עם תוכנת CAD ולייבא את מסמכי הדגם לתוכנה העליונה של bioprinter DLP להחיל. הוסף עשרה מיליליטר של הדיו הביולוגי המוכן אל השוקת של bioprinter.

הגדר את פרמטרי ההדפסה בהתאם להוראות כתב היד ולאחר מכן התחל להדפיס. כאשר להשלים להסיר את המבנה המודפס מן bioprinter ולטבול אותו DPBS בצלחת פטרי. ניתוק ו גלולה MDA-MB 231 תאים כפי שתואר קודם לכן.

תן להם שני מיליליטר של DMEM והוסף את ההשעיה למבנה המודפס. תרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים ואז להכין את המבנים לתצפית עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal כפי שתואר קודם לכן. הכן משקל של 10 אחוזים לנפח GelMA ומשקל של 0.5 אחוז לפתרון LAP נפח ואז סנן אותו באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22.

יש לעקר את אבקת הג'לטין תחת אור UV למשך 30 דקות ולהוסיף אותה לפתרון GelMA LAP ביחס משקל של חמישה אחוזים לנפח. מחממים את התערובת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ממלאים את התבניות בדיו הביולוגית המוכנה ומכניסים למקרר של ארבע מעלות במשך 30 דקות.

השתמש בלהב כדי להסיר את יריעות הידרוג'ל מקושר חלקית מן התבניות. שלבו יריעות הידרוג'ל מעוצבות דו-מימדיות וקשרו אותן עם GelMA על ידי הקרנה ב-405 ננומטר למשך דקה אחת. ניתוק וכדור HUVECs לערבב את התאים עם שני מיליליטר של DMEM ולהזריק את ההשעיה לתוך microchannel עם הזרבובית והמזרק.

במשך שלוש השעות הבאות להפוך את השבב במהופך כל 15 דקות כדי להשיג ישיבה אחידה ומלאה בתא. תרבות השבבים בצלחת פטרי במשך שלושה ימים ב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני ואז להכין אותם לתצפית מורפולוגית. כאשר טיפות GelMA נפלו לתוך שמן הסיליקון המקבל הם שמרו על צורה כדורית סטנדרטית ללא זנבות.

התאים המוקפצים שחוו את כוח השדה החשמלי במתח גבוה שמרו על יכולת ההתפשטות שלהם אשר אימתה את תאימות הביולוגית של שיטת ייצור בסיוע אלקטרו. מדפסת ביו DLP נבחרה להמציא מבני GelMA עם צורות מורכבות יותר כגון אוזן האף ותא רב. HUVECs זרעים המחוברים לחומרי GelMA ומתפשטים על פני השטח של מבני GelMA המקושרים זה לזה ומוכיחים כי ליישום זה יש פוטנציאל להנדסת רקמות.

נעשה שימוש באסטרטגיית הצלבה כפולה כדי להמציא שבבים מיקרופלואידיים מבוססי GelMA. שבבים עם מיקרו-ערוצים שונים נבנו על ידי תכנון תבניות שונות לפי דרישה ו- HUVECs נזרעו בערוצים והוצמדו לקיר התעלה ויוצרים את צורת כלי השיט המקרוסקופי. מקור מתח גבוה מוחל בעת ייצור מיקרוספרות.

החוקרים חייבים לבחון מעגל לפני ולא לגעת מיליבארים חשופים הגנה על מפעילים או עושה את התאים מפני נזק על ידי קצר חשמלי. בסיס המים הקולי יכול להיות בחירה נוספת להאיץ את המהירות הראויה. בהחלט תרומה זו סיכמה את שיטות ההדפסה הביולוגית 3D של GelMA במעבדה שלנו.

החוקרים יכולים להתייחס לסרטון ולשפר או להרחיב את אסטרטגיות ההדפסה כדי לשרת דרישות ביו-רפואיות נוספות.