Name: תא תא פיוזן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: חקור שיטת פיוז'ן תאים ליצירת תאים היברידיים לניתוח מבנה ותפקוד תאי באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אברונים ולימוד תגובות תאיות להפרעות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי ברוכים העקב חומרי גלם באמון מחבר הנרי ברוכים המספרים (https://wellcome.ac.uk/grant מספר 100090/12/Z). לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אנו מודים לאשוק ולפול פרנץ ' לייעוץ ביקורתי ולהדרכה על הפרויקט. אנו מודים לקיארה וגבריאלה Grondys-Kotarba במכון קיימברידג ' לזרימת המחקר הרפואי מתקן Cy, לתמיכה מעולה. , אנו מודים לליאם קסידיי, תומס מילר. וג'אנמרקו קונארו על הגהה של כתב היד

1. תא פלורסנט משלים התיוג
<ol><li>התיוג הגנטי עם Cas9<ol>
<li>השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי. הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור עריכת הגנום מכוסים במקום אחר24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תוויות צבע פלורסנט<ol>
<li>לגדול Cal51 תאים סרטניים אנושיים במדיום שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עוברי (FBS), L-גלוטמין, ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' ו 5% CO2 באינקובטור מחולל. הערה: חשוב לוודא כי התאים נבדקים באופן קבוע להעדר זיהום mycoplasma, ולזהות קו התא. אין להשתמש בתאים שעברו בהרחבה בתרבות (> 15 מעברים). התאים חייבים להיות בריאים וגדלים באופן אקספוננציאלי. הימנע בשטף או בשטף.</li>
		<li>זרע כל סוג תא (וורטלטין-מגלוקס, שורטלטין-משני-אני והורי Cal51 תאים) כגון ~ 6 x 106 תאים נמצאים למחרת עבור כל דגימה, בשטף של 70 ל-90%. הערה: זה כ 1 T75 התרבות רקמה בקבוקון או 1 10 ס"מ צלחת לכל סוג תא. התאים הלא מתויגים של ההורים נדרשים כפקד שלילי בהמשך הפרוטוקול. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של ~ 20,000 תאים התמזגו, אבל מספר זה יכול להיות מוגבר באמצעות שינוי גודל הפרוטוקול עם מספר גדל של אצוות.</li>
		<li>למחרת היום, DMEM לחמם את הבית, טריפסין ו-1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) על ידי הצבת אותם באמבט מים ב 37 ° c.</li>
		<li>שטוף שורטלטין-מגלוקס ושורטלטין-מני תאים 2x בערוץ הpbs על ידי שפיכת או לשטוף את המדיום והחלפת עם 10 מ ל של PBS.</li>
		<li>תווית Cal51 ורטלטין-מגלוב תאים על ידי הוספת 500 ננומטר לצבוע תא (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>התווית Cal51 ורטלטין-משני תאי-I על-ידי הוספת 200 ננומטר לצביעת תא אדום רחוק (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בשעה RT. הערה: לשמור דגימות מוגן מפני אור בכל מקום שניתן לאחר כתמים פלורסנט, כדי למנוע הלבנה של זריחה.</li>
		<li>להפסיק את התגובות תוויות הצבע על ידי הוספת 10 מ ל DMEM עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר תאים Cal51 הורים ללא תווית מהאינקובטור (משלב 1.2.2). הערה: תאים אלה ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים שאינם מסומנים בתווית (step 3.3.2).</li>
		<li>לשטוף את כל התאים פעם אחת על ידי שפיכת הצמיחה בינונית והחלפה עם 10 מ ל של PBS.</li>
		<li>יוצקים את PBS ו-דגירה עבור 5 דקות בתנאי התרבות עם 1 מ ל של מחומם טרום טריפסין 1x.</li>
		<li>העברת תאים ל 15 מ"ל שפופרת פלסטיק חרוטי ו צנטריפוגה ב 1000 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>בזהירות להסיר ולמחוק טריפסין מתוך הגלולה תא עם פיפטה.</li>
		<li>השהה מחדש בעדינות את כדורי התאים הסגולים המוצגים באדום ובמרחק של 1 מ ל של PBS.</li>
		<li>השהה מחדש בעדינות את הגלולה של תא הורים (לא פלורסנט) ב-1 מ ל של DMEM וחזור לחממה. הערה: מדגם זה לא יעבור היתוך תא התא אך יהיה בשימוש מאוחר יותר במהלך הזרימה cy, לנסות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תא תאים פיוז'ן
<ol><li>מערבבים 3 x 106 תאים סגול מתויג עם 3 x 106 תאים אדומים הרבה מתויג בצינור 15 מ ל על ידי ליטוף בעדינות ביחד 0.5 mL של כל סוג תא באמצעות פיפטה 1 mL.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים הנותרים שלא התערבבו משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות, ואז לשפוך את PBS, להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של dmem ולחזור לחממה. הערה: הדגימות הנותרות שאינן מעורבות בתווית אחת ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים ופיצוי בסעיף 3 של הפרוטוקול.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים המעורבים משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות ובזהירות לאכול PBS באמצעות פיפטה 1 mL.</li>
	<li>הוסף 0.7 mL של 50% 1450 הפתרון יתד בצורה dropwise אל הגלולה תא (שלב 2.3) באמצעות פיפטה 1 mL על פני תקופה של 30 s.</li>
	<li>השאירו 3.5 דקות בשעה RT. הערה: דגירה זמן עם פג עשוי להיות ממוטב בהתאם לסוג התא, למרות הערה כי זמן הדגירה ארוך יותר מגביר רעילות התאים.</li>
	<li>הוסף 10 מ ל של הסרום-free DMEM dropwise עבור 30 s ולעזוב בחממה עבור 10 דקות.</li>
	<li>ספין למטה ב 1,000 x g עבור 5 דקות, למחוק supernatant, ולהשעות בעדינות 1 מ ל של בינוני מלא (dmem המכיל fbs). הערה: . המשך ישירות לאגף 3 יש רעילות הקשורים לחשיפה יתד ואחריו הזרמת cy, הדמיה, כך לשמור על תאים בתנאי התרבות ככל האפשר על ידי הליך במהירות בין שלבים.</li>
</ol>3. מיון תאים פלואורסצנטית-מופעל (FACS) כדי להעשיר את התאים התמזגו
<ol><li>הכינו את כל התאים להזרמת cy, בעדינות על ידי ליטוף כל מדגם בנפרד באמצעות מסנן 70 יקרומטר לתוך צינור facs. הערה: ארבע דגימות נדרשות: תאים מוהתמזגו, תאים אדומים הרחק מסומנים בודדים, תאים סגולים שסומנו בלבד, תאים הורים ללא תווית. לאחר שהוסר ממכסה המנוע של הרקמה הסטרילית, לתאים יש את היכולת להידבק, ולכן מזער את זמן החשיפה של דגימות לסביבה לא סטרילית מכאן ואילך. תאים ממוינים במדיום DMEM מלאה.</li>
	<li>השתמש cytometer מסוגל מיון תא יחיד.<ol>
<li>הגדר את סדרן התא עבור מיון אספטי. בצע את בקרת איכות המכשיר לפי המלצת היצרן.</li>
		<li>ציירו מגרש של פיזור לפנים לעומת פיזור בצד והעלילה האפליה מספק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליצור שערים כדי לזהות תאים התמזגו.<ol>
<li>לרגש את צבעי פלורסנט באורכי גל של 405 ננומטר ו 635 ננומטר. זיהוי ב 450 ננומטר ו 660 nm (סגול ואורכי גל אדום, בהתאמה). מתווה אדום הרבה לעומת אורכי גל סגול.</li>
		<li>הפעל תאים הורים ללא תווית דרך cytometer ולהקליט את עוצמת הקרינה. הערה: ערכים מעל תוכנית בסיסית זו מגדירים חיוביות לצביעת צבע.</li>
		<li>הפעל בודד שמסומנת בתאים סגולים דרך הציטומטר. ודא כי אין לשפוך-מעל של סגול לתוך הערוץ האדום הרחוק.</li>
		<li>הפעל בודד מתויג תאים אדומים רחוק דרך cytometer וודא כי אין לשפוך-מעל של הרבה אדום לתוך הערוץ הסגול. הערה: עבור נתוני המייצג המוצג, תאים ממוינים ב 20 psi על סדרן מצויד זרבובית יקרומטר 100.</li>
		<li>הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לוודא שהתאים התמזגו גלויים עם השערים שנוצרו בשלב 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישר את זרם המיון במיקום מרכזי לתוך צלחת הדמיה של 8 היטב.</li>
	<li>FACS מיון תאים התמזגו, הנוכחי כפול חיובי סגול ותאים המסומנת באדום הרבה ישירות לתוך הצלחת 8-להדמיה המכיל 100 μL של גידול בינוני. הערה: מספר התאים המקסימלי המומלץ הוא ~ 50,000 לכל מאכל 8-והכל. ודא שתקינות התא במהלך המיון. שטף התא יכול להשפיע על בריאות התא כך לשמור על תאים בין 20 ל 90% השטף לאחר מיון על ידי מיון מספר מתאים של תאים לצלחת ההדמיה. כל droplet ממוין מכיל כ-3 nL של נוזל נדן. ודא כי נוזל מעטפת אינו מדלל באופן משמעותי את מדיום הצמיחה במהלך מיון.</li>
	<li>ישירות לאחר מיון, לקחת תאים בחזרה לחממה ולעזוב > 2 h או לילה. הערה: תאים חסיד יהיה מחדש בהדרגה לדבוק שמיכות במהלך תקופה זו, מיון ואילך, ומכאן המבנה שלהם ישתנה לאורך זמן אם נלקח ישירות למיקרוסקופ.</li>
</ol>4. מכשירי כתמים והדמיה של תא-תא Fusions
הערה: תאים התמזגו יכול להיות התמונה חי או לאחר קיבעון וכתמים פלורסנט נוסף (או שניהם), בהתאם לניסויים ומדידות הנדרשים.
<ol><li>הדמיית תאים בשידור חי<ol>
<li>החלף בינונית צמיחה עם מדיום הדמיה ללא פנול אדום (לוח חומרים) ולהמשיך ישירות להדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קיבוע וצביעת<ol>
<li>הכן טרי 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) ב-PBS.</li>
		<li>תקן את התאים על-ידי דגירה אותם ב-100 μL של 4% כלפי מע עבור 15 דקות ב-RT. הוצא את הכדורגלן לאחר 15 דקות. זהירות: הקליולית היא רעילה כאשר היא שאפה כך ששלב זה צריך להתבצע בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי מתאים. הערה: לאחר הקיבעון, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש במקרה הצורך. אחסן את המדגם ב -4 ° צ' מוגן מפני אור במידת הצורך.</li>
		<li>לשטוף את התאים 3x ב 200 μL של PBS ב RT.</li>
		<li>תאים הניתנים לחדירות עבור 10 דקות ב-RT ב 200 μL של 0.1% nonionic (טבלת חומרים) ו 0.1% nonionic אבקת (טבלת חומרים) מדולל ב-PBS.</li>
		<li>לחסום ב 200 μL של 3% בסרום שור הערוץ ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.</li>
		<li>דגירה עם נוגדנים ב-150 μL של PBS המכיל 3% בסרום בקר אלבומין ו 0.1% nonionic סורסטנט ו 0.05% nonionic ניקוי עבור 1 h ב RT. הערה: הנוגדנים העיקריים המשמשים כדי לייצר את התוצאות הנציגים הם fluorescently מעלה מעלה אנטי GFP ננוגוף (משמש ב 1:400 דילול), ו fluorescently מעלה מעלה אנטי mScarlet-I ננוגוף (משמש ב 1:500 דילול). אלה לשפר את האות של חלבונים כבר פלורסנט.</li>
		<li>לשטוף 2x עבור 5 דקות ב 300 μL של PBS ולאחר מכן לעזוב ב 200 μL של PBS. הערה: דגימות מתמונות מתמונות ב-PBS. ניתן לאחסן דגימות ב -4 ° c מוגן מפני אור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רכישת תמונה<ol>
<li>לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ המתאים לקרינה פלואורסצנטית מסוגל הדמיה ארבעה צבעים (למשל, confocal וקד, שטח, תאורה מובנית).</li>
		<li>לרגש meGFP ו mScarlet-I עם 488 ננומטר ו 561 לייזרים באורך גל ננומטר, בהתאמה. הגדר גלאים כדי לזהות ב ~ 505-550 ננומטר ו ~ 590-650 ננומטר. לרגש סגול וצבע אדום הרחוק עם 405 ננומטר ו 633 לייזרים nm, בהתאמה. הגדר גלאים לזיהוי ב-~ 430-500 ננומטר ו-~ 660-750 ננומטר.</li>
		<li>באופן אמפירי לקבוע עוצמת לייזר כגון photobleaching לבנה משמעותית לא מתרחשת, כי תאים נשארים בריאים (אם לחיות הדמיה תא).</li>
		<li>האופן האמפירי קובע את הרווח כך שהאות מתקבל ללא שיקוף או באופן מלאכותי מסיכה ערכי פיקסלים.</li>
		<li>איסוף נתוני מחסנית Z, כגון תמונות הן תלת-ממדיות, כיסוי טווח של 20 עד 60 יקרומטר עם גודל השלב ~ 500 יקרומטר. הערה: התמונות המוצגות בנתונים מייצגים נרכשו על ידי קונפוקלית וקד (איור 2B), airyscan (איור 2ג) או מיקרוסקופ תאורה מובנית (איור 2ד). כל תא הוא הטרואוארייון בתום ובכן אם הוא מכיל הן סגול והן צבעים אדומים הרבה חופפים בציטופלסמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+meaning+of+life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).</li>
<li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li>
<li>Köhler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Cell+Fusion%3A+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li>
<li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse%2C+Chinese+hamster%2C+and+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li>
<li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li>
<li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li>
<li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li>
<li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li>
<li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li>
<li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li>
<li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li>
<li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li>
<li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+glycol%29+%28PEG%29-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers%3A+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li>
<li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li>
<li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich%27s+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li>
<li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li>
<li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Trapping+and+Optical+Micromanipulation+XIII%22%5BJournal%5D)">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).</li>
<li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li>
<li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li>
<li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+centrosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).</li>
<li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li>
<li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+%28PEG%29-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+%28CAScT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li>
<li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).</li>
<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אנו מדגימים נתיישב ופרוטוקול חסכוני עבור תאים פיוזינג ומדמיין את הארכיטקטורה הבאה של תאים היברידיות עם מיקרוסקופ, לוקח בערך יומיים מתחילתו ועד סופו. חלקים קריטיים של פרוטוקול זה הם העשרת התאים המוחלקים על-ידי מיון התאים (מקטע פרוטוקול 3) ואימות קפדני של תאים מוחלקים באמצעות מיקרוסקופ (פרוטוקול סעיף 4). סעיפים אלה להבטיח כי תאים התמזגו מתקבלים בקלות והם בתום heterokaryons. יש לדבקה בריכוזים ובזמני דגירה. לדוגמה, כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר או בזמני דגירה ארוכים יותר, צבעי תאים יכולים להיות בהירים מדי ולהרוות את ה...

הומסטטי תחזוקה של מבנה הסלולר הוא קריטי לחיים. לתאים יש מורפולוגיות אופייניות, מספרי משנה-תאית וקומפוזיציה ביוכימית פנימית. הבנת האופן שבו מאפיינים בסיסיים אלה נוצרים וכיצד הם משתבש במהלך המחלה מחייב כלי מעבדה כדי לperturb אותם.
Fusion תא הוא המיזוג בין שני תאים נפרדים או יותר. היתוך תא אולי היה קריטי הופעתה של חיים איקריוטית1. בגוף האדם, פיוז'ן התא הוא נדיר יחסית, המתרחשים בנסיבות התפתחותיות מוגבלות סוגי רקמות, כגון במהלך הפריה או היווצרות של שריר, עצם השליה2. פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של היתוך תא התא בקווי תרבות של רקמה עם שורות מפורטות בצורה מסודרת, ככלי להבנת המנגנונים השולטים במבנה התאים ובתפקוד.
בהשפעת מחוץ לגוף היתוך תא התא הוא מרכזי לייצור נוגדנים חד שבטיים3, כלי חשוב עבור מחקר ביולוגי וטיפול במחלות. הפיוז תא גם שימש כדי לשאול שאלות רבות שונות ביולוגית תא ביולוגי על מחזור התא הדומיננטיות4, אנאפלואידיה5,6, הסלולר מחדש7,8, תיקון של נוירונים פגומים9, ויראלי התפשטות10, אפופטוזיס11, tuמוריגנזה12, ציטושלד דינמיקה13, ו ממברנה פיוז'ן14,15. מעבדה מבוסס שיטות כדי לגרום היתוך תא תא16,17,18,19 לגרום לשומנים הממברנה ממברנה דרך המיזוג הפיזי של שני bilayers לתוך אחד. היתוך תא יכול להיגרם על ידי חשמל18, שיטות ויראלי מבוסס17, חימום תרמוטרמונית20, הביטוי הטרנסגנטי19, וכימיקלים כולל פוליאתילן גליקול (יתד)16,21,22.
הסנטזומים הם מרכזי ארגון השולטים בצורה התאית, בתנועתיות, בקיטוב ובחטיבה23. השורשים הסנטורזומוניים הם מבנים סיבי הארכת מ סנטרוזומים המכילים את החלבון שורטלטין24 (מקודד על ידי הגנים crocc). השתמשנו לאחרונה היתוך תא התא כדי להבין כיצד centrosome מיקום ומספר משתנה בתוך heterokaryons יחסית לתאי הורים24. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו היא לעקוב אחר התא של המקור של שורשים בתוך הטרולויון לאחר היתוך של מתויג באופן שולי בתאי הורים מסומנים, ובכך היתוך אורגונל התמונה ביקוע. הפלואור מתויג בעזרת חלבונים שרוסטין-ממגה או שורטלטין-mScarlet-I נוצר על ידי עריכת הגנום בקווים נפרדים תאים אשר התמזגו אז על ידי היתוך תא יתד בתיווך. אנו מתארים את השימוש בצבעי תאים (טבלה של חומרים) כדי לזהות תאים התמזגו על ידי זרימה cy, ולאחר מכן זיהוי המיקרוסקופיה של מיקרוסקופ של תא של מקור ומורפולוגיה (איור 1). גישה זו היא שיטה איתנה וייחודית ללמוד כיצד השינויים העיקריים במצב הסלולר, כולל מספר ארגונית המגלגל על הומאוסטזיס התאים.

<table><tbody><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 סריקת לייזר קונפוקלי Airyscan מיקרוסקופ</td><td>קרל זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 בארות הדמיה צלחות</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP אלפקה GFP מאיץ ננו-גוף</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Influx ממיין תאים</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים (70 &mu; m)</td><td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I ננו-גוף אלפקה</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-AT565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 מדיום הדמיה עצמאי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום ללא DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2HPO4, dH2O עד 1</td></tr><tr><td>ליטר פוליאתילן גליקול Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td> חומר <td>פעילי שטח לא יוני</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>חומר ניקוי לא יוני</td></tr></tbody></table>

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

החיים מחולק למחיצות בתוך קרום השומנים כדי לאפשר היווצרות מבודדת של מצבים מולקולריים ברורים בתוך תאים ואורגלים. Fusion תא הוא מיזוג של שני תאים או יותר כדי ליצור תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול למיזוג תאים של שני סוגי תאים שונים. תאים היברידית התמזגו מועשרים על ידי מיון cy, מבוססי הזרמת הזרם, ואחריו מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מבנה תאים היברידית ותפקוד. פלואור שתייגת חלבונים שנוצרו על ידי עריכת הגנום הם התמונה בתוך תאים התמזגו, המאפשר מבנים סלולריים להיות מזוהה מבוסס על פליטת הזריחה והפניה בחזרה לסוג התא של המקור. השיטה האיתנה והכללית יכולה להיות מוחלת על סוגי תאים שונים או על-ידי אורגלים של עניין, להבין את המבנה התאי והתפקוד על-פני מגוון של שאלות ביולוגיות בסיסיות.

תאים מסומנים כראוי גלויים במהלך הזרימה cy, לנסות על ידי אות פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר בתאי בקרה בלתי מסומן (איור 2א). גייטס מוגדר למיון תאים חיוביים כפולים, העשרת האוכלוסייה הזאת ישירות לתוך מנות הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. תאים התמזגו הם לזיהוי ברורים כפול פלואורוסקופים תאים חיוביים ומהווים כ-~ 1% מהאוכלוסייה.
פיוז'ן גורם לסידור מחדש של האדריכלות התאית באמצעות ערבוב של שני תאים...

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

שיטה זו מאפשרת לטרטר מבנה ותפקוד תאיים באמצעות היתוך של שני סוגי תאים שונים כדי לענות על שאלות כגון כיצד תאים מגיבים לשינויים במספר organelle. על ידי הדמיה פלואורסצנטי מתויג חלבונים בתוך תאים מותכים, מבנים הסלולר ניתן להפנות בחזרה לסוג התא שלהם של מקור ללמוד את המנגנונים של הונוסטזיס organelle ותפקוד. עבור תיוג צבע פלואורסצנטי, ראה את אוכלוסיות התאים הסרטניים האנושיים של עניין כך שכל תרבות תתרחב לפחות שש פעמים 10 לתאים השישיים ב 70 עד 90% confluency עד למחרת בבוקר.ביום התיוג, לשטוף את השורש eGFP ותאי rootletin-mScarlet פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לדלל צבע תא סגול ל 500 nanomolar ב PBS וצבע תא אדום רחוק ל 200 nanomolar ב PBS. סמן את תאי השורש eGFP בצבע התא הסגול המדולל ותאי השורש-mScarlet עם צבע התא האדום הרחוק המדולל למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לעצור את התגובות עם 10 מיליליטר של DMEM במשך חמש דקות. לשטוף הן תרבות תאים שכותרתו ותרבות תאים הורית אחת ללא תווית עם 10 מיליליטר של PBS טרי לפני הדגירה כל התרבויות עם מיליליטר אחד של טריפסין טרום המלחמה. בסוף הדגירה, להעביר את פתרונות התא מנותק צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה בעדינות resuspend כדורי צבע שכותרתו במיליליטר אחד של PBS ואת התאים ללא תווית במיליליטר אחד של DMEM.ואז להחזיר את כל דגימות התאים לאינקובטור תרבות התא. לניסוי היתוך תאים, מערבבים 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע ויולט עם 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע אדום רחוק בצינור חדש של 15 מיליליטר ומשמידים את התאים הנותרים שאינם מתויגים על ידי צנטריפוגה. תן שוב את הכדורים במיליליטר אחד של DMEM טרי והחזר את התאים לאנקובטור.לאסוף את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 700 microliters של 50%1450 PEG באופן טיפה חכם לכדור על פני תקופה של 30 שניות. לאחר 3.5 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM נטול סרום לאורך תקופה של 30 שניות והמקמו את הצינורות באינקובטור למשך 10 דקות. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ומערבבים בעדינות את גלולת במיליליטר אחד של מדיום שלם.כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים התמזגו על ידי FACS, בעדינות לסנן את כל התאים לתוך צינורות FACS בודדים דרך מסננת 70 מיקרומטר וליצור פיזור קדימה לעומת פיזור צד להכפיל חלקות אפליה בתוכנת ציטומטר. הפעל את התאים ללא תריס כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם וליצור שערים כדי לזהות את התאים התמזגו. לאחר מכן, הפעל את הצבע ויולט חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין זליגה של אות ויולט לתוך הערוץ האדום הרחוק ואת צבע אדום רחוק חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין אות אדום רחוק בערוץ ויולט.לאחר מכן הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לאשר כי התאים התמזגו גלויים עם שערים אלה. כאשר פרמטרי המיון נקבעו, יש ליישר את זרם המיון באופן מרכזי לתוך צלחת הדמיה בת שמונה בארות המכילה 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה ומיין את התאים המותכים החיוביים הכפולים ישירות לתוך המנה. כאשר כל התאים כבר ממוינים, מיד למקם את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך שעתיים עד 16 שעות.עבור כתמים immunofluorescent, תחילה להחליף את תרבות התא על טבעי עם 200 microliters של 4% paraformaldehyde עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף לפני permeabilizing התאים ב 200 microliters של 0.1% פעילי שטח לא יוני במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חסום את הכריכה הלא ספציפית עם 200 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 3%bovine ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו תיוג עם נוגדנים בעלי עניין ב-150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים.לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים 300 microliters של PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את הכביסה עם 200 microliters של PBS טרי. כדי לרכוש תמונות של התאים המותכים, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים המסוגל לבצע הדמיה של ארבעה צבעים ולאסוף תמונות תלת מימדיות.תאים המסומן כראוי גלויים במהלך ציטומטריית זרימה על ידי אות פלואורסצנטי ברמה גבוהה יותר מאשר תאי בקרה ללא תווית. ניתן להגדיר את השערים למיון כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים החיוביים הכפולים ישירות לתוך כלי הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. היתוך גורם לסידור מחדש גדול של הארכיטקטורה התאית באמצעות ערבוב של שני תאים לאחד.הטרוקריונים מזוהים כתאים המכילים את שני אותות הצבע הפלואורסצנטיים המעורבים בתוך תא אחד מבלי להתערב במברנות פלזמה. בנוסף, שני גרעינים עשויים להיות גלויים גם בתאים מותכים על ידי הדמיה ברייטפילד. מבנה התא ותפקודו עשויים להיחקר עוד יותר באמצעות מיזוג של תאים המכילים meGFP וחלבונים מתויגים mScarlet.היתוך גורם להכפלה של מספר centrosome בתוך הטרוקריונים גלוי לפחות ארבעה foci חומר קרום המוח כאשר המרכיב pericentriolar centrosome NEDD1 מתויג באופן פלואורסצנטי. היתוך של תאים עם שורש מתויג אנדוגני פלואורסצנטי מאפשר לתא המקור של כל centrosome להיות מזוהה בהטרוקריון. פרוטוקול זה מדגים כיצד להתיך קווי תאים המסווים באופן דיפרנציאלי וכיצד לדמיין את האיברונים שלהם כדי להבין את המבנה והתפקוד שלהם.פרוטוקול חזק זה הוא גם קל יחסית וזול יחסית לביצוע בהשוואה לשיטות דומות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשאול מגוון של שאלות כגון איך היתוך organelle מוסדר וכיצד התאים מגיבים לשינויים במספר organelle subcellular.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

חקור שיטת פיוז'ן תאים ליצירת תאים היברידיים לניתוח מבנה ותפקוד תאי באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אברונים ולימוד תגובות תאיות להפרעות.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

גלה סרטונים נוספים