Name: שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: חקור ניתוח מחזור תאים ברמת תא בודד באמצעות ציטומטריית מסה וסימון IdU ישיר. השיטה מאפשרת לחקור תאי סרטן נדירים ולהבין קורלציה בין מצב מחזור התא לתוצאות קליניות בחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למאמציהם של פאלאק סכרי, חוסאם אלח'לאיילה, הסיאוצ'י צ'אנג וג'סטין לייברגר על תמיכתם הניסיונית. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מלגות פלוטוניה (Pelotonia Fellowship Program). כל הדעות, הממצאים והמסקנות המובעים בחומר זה הם של המחבר(ים) ואינם משקפים בהכרח את אלה של תוכנית מלגות פלוטוניה".

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

ד"ר Behbehani מקבל תמיכה נסיעות מ Fluidigm. Fluidigm רכשה גם ריאגנטים וחומרים לשימוש במעבדה.

הדוגמאות המובאות כאן מדגימות כיצד להשתמש בפלטפורמת MCM כדי לנתח את התפלגות מחזור התא. כמו כן, הוכח כי ניתוח מחזור התא רגיש לתנאי ניסוי כגון זמן וטמפרטורה, וזהו שיקול חשוב שחוקרים חייבים לקחת כאשר הם שוקלים MCM עבור ניתוח מחזור התא שלהם14. דגימות שהושארו באחסון לפרק זמן קצר, לא יותר משעה, יהיו בעלות שילוב IdU דומה למצבן הרגיל. דגימות במערכת סגורה לפרקי זמן ארוכים, כשעתיים, יפחיתו את שילוב IDU, אולם השברים המחזוריים והלא מחזוריים היחסיים לא ישתנו ויאפשרו ניתוח מחזור תאים גס. אחסון קריוגני והפשרה לאח...

ציטומטריית מסה מאפשרת זיהוי של כ-40 פרמטרים תוך ניצול הרזולוציה הגבוהה והאופי הכמותי של ספקטרוסקופיית מסות. נוגדנים המסומנים במתכת משמשים במקום נוגדנים מצומדים פלואורופורים המאפשרים מספר גבוה יותר של ערוצים ומייצרים זליגה מינימלית 1,2. ל-MCM יתרונות וחסרונות ביחס לניתוח מחזור התא בהשוואה לציטומטריית זרימה. אחד היתרונות העיקריים של MCM הוא שמספר הפרמטרים הגדול מאפשר מדידה סימולטנית של מצב מחזור התא על פני מספר רב של סוגי תאי T אימונופנוטיפיים שונים בדגימות הטרוגניות מאוד. MCM שימש בהצלחה למדידת מצב מחזור התא במהלך המטופויזיס נורמלי במח עצםאנושי 3 ומודלים מורינים טרנסגניים של מחסור בטלומראז4. ניתוח מצב מחזור התא בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הראה כי מחזור התא מתואם עם תגובות ידועות לטיפולים קליניים, ומספק תובנה in vivo לגבי מאפיינים תפקודיים שיכולים לסייע בבחירת טיפול5. יתרון שני של ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה הוא היכולת למדוד מספר רב של סמנים פונקציונליים אחרים שעשויים להיות מתואמים עם מצב מחזור התא. עבודות אחרונות הצליחו לקשר בין סינתזת חלבונים ורנ"א לבין מצב מחזור התא באמצעות שימוש בנוגדנים מתויגים ב-IdU ובמתכת ל-BRU ול-rRNA6. סוג זה של ניתוח פרמטרי ביותר המודד את מצב מחזור התא על פני אוכלוסיות רבות ברצף של התמיינות יהיה כמעט בלתי אפשרי עם טכנולוגיית ציטומטריית הזרימה הנוכחית. החיסרון העיקרי של MCM הוא היעדר כתמי DNA או RNA דומים לאלה המשמשים בציטומטריית זרימה פלואורסצנטית (למשל, DAPI, Hoechst, Pyronin Y וכו '). צבעים פלואורסצנטיים יכולים לתת מדידות מדויקות יחסית של תכולת הדנ"א והרנ"א, אך דיוק זה אפשרי רק בשל השינויים בתכונות הפלואורסצנטיות של צבעים אלה המתרחשים באינטרקלציה בין בסיסי נוקלאוטידים. לפיכך, ניתוח MCM אינו מסוגל למדוד את תכולת הדנ"א או הרנ"א בדיוק דומה. במקום זאת, ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה מסתמך על מדידות של חלבונים הקשורים למצב מחזור התא כגון ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb), והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3) בשילוב עם מדידה ישירה של אטום היוד משילוב IdU בתאים בשלב S. שתי גישות מדידה אלה מניבות תוצאות דומות מאוד במהלך התרבות תאית רגילה, אך עלולות להיות צורמות כאשר התקדמות מחזור התא משתבשת.
מדידת מספר התאים בכל שלב במחזור התא חשובה להבנת התפתחות תקינה של מחזור התא, כמו גם הפרעה במחזור התא, אשר נצפתה בדרך כלל בסרטן ובמחלות אימונולוגיות. MCM מספק מדידה אמינה של גורמים חוץ-תאיים ותוך-תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים מתכתית; עם זאת, מדידת פאזת S הייתה מוגבלת מכיוון שאינטרקלטור הדנ"א המבוסס על אירידיום לא היה מסוגל להבדיל בין דנ"א 2N לדנ"א 4N. על מנת להגדיר את שלבי מחזור התא, פיתח בהבהאני שיטה המשתמשת ב-IdU בעל מסה של 127, הנמצאת בטווח של ציטומטר המסה ומאפשרת מדידה ישירה של תאים בשלב S3. מדידה ישירה זו עוקפת את הצורך בנוגדנים משניים או בשימוש בחומרים דנטורינג DNA כגון חומצה או DNase. בשילוב עם סמני מחזור תוך תאיים, הוא מאפשר רזולוציה גבוהה של התפלגות מחזור התא במודלים ניסיוניים.
פרוטוקול זה מתאים מדידות מחזור תא מפרוטוקולי ציטומטריית זרימה נפוצים עבור MCM. השיטות שלנו מספקות דרך נוחה ופשוטה לכלול פרמטרים של מחזור התא. שילוב IdU של דגימות חוץ גופיות דורש רק 10 עד 15 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, שהוא קצר יותר מרוב פרוטוקולי צביעת BrdU הממליצים על זמני דגירה של מספר שעות 3,7. ניתן לתקן דגימות משולבות של IdU ו- BrdU באמצעות מייצב פרוטאומי ולאחר מכן לאחסן אותן למשך זמן מה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. הדבר מאפשר לאחסן מספר גדול של דגימות מוכתמות ב-IdU לצורך ניתוח אצווה ללא ירידה באיכות הדגימה.

<table><tbody><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>רכיב של</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> CSM <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>צנטריפוגה לדוגמא</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>זיהוי תאים אפופטוטיים</td></tr><tr><td>ציקלין B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 רזולוציה</td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא</td><td>D2650</td><td>Cryopreservative</td></tr><tr><td>EQ ארבעה אלמנטים חרוזי כיול</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>תקן מתכת פנימי לביצועי CyTOF</td></tr><tr><td>צינור FACS עם מסננת רשת</td><td>קורנינג</td><td>08-771-23</td><td>מסננת תאים להסרת גושים/פסולת לפני הפעלת CyTOF</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>תוסף צמיחת תרבית תאים</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF מערכת/פלטפורמה</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>תוסף צביעה למניעת צביעה לא ספציפית</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2&-prime;-deoxyuridine)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>משלב ב-S-phase</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>אישור של G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>ערכת תיוג מתכת, מחברת מתכות לנוגדנים</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>ערבוב דגימות במהלך צביעת</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>זיהוי תאים במהלך רכישת CyTOF</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td> <td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>איתור נזק ל-DNA</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M-phase</td></tr><tr><td>רזולוציה פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>תמיסת שטיפה לתרבית תאים ורכיב של תמיסת קיבוע</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 רזולוציה</td></tr><tr><td>מייצב פרוטאומי</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>מדגם קיבוע</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>מדיום גידול תרבית תאים</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>רכיב של מאגר CSM/נוגדנים, ביוציד</td></tr></tbody></table>

שימוש באנלוגי פירימידין, 5-iodo-2′-deoxyuridine (idu) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

ויסות שלב מחזור התא הוא היבט חשוב של התפשטות התא והומאוסטזיס. שיבוש מנגנוני הבקרה השולטים במחזור התא הוא מאפיין של מספר מחלות, כולל סרטן. חקר מחזור התא מחייב את היכולת להגדיר את מספר התאים בכל חלק של התקדמות מחזור התא, כמו גם לתחום בבירור בין כל שלב במחזור התא. הופעתה של ציטומטריית מסה (MCM) מספקת פוטנציאל עצום לאנליזה של תא בודד בתפוקה גבוהה באמצעות מדידות ישירות של איזוטופים יסודיים, ופיתוח שיטה למדידת מצב מחזור התא על ידי MCM מרחיב עוד יותר את התועלת של MCM. כאן אנו מתארים שיטה המודדת ישירות 5-יודו-2′-דאוקסיורידין (IdU), בדומה ל-5-ברומו-2'-דאוקסיורידין (BrdU), במערכת MCM. השימוש ב-MCM מבוסס IdU זה מספק מספר יתרונות. ראשית, IdU משולב במהירות בדנ"א במהלך הסינתזה שלו, ומאפשר מדידה אמינה של תאים בשלב S עם דגירות קצרות של 10-15 דקות. שנית, IdU נמדד ללא צורך בנוגדנים משניים או צורך בפירוק DNA. שלישית, ניתן לשלב צביעת IdU בקלות עם מדידה של ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb) והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3), אשר ביחד מספקים תיחום ברור של חמשת שלבי מחזור התא. שילוב של סמני מחזור תאים אלה עם מספר הפרמטרים הגבוה האפשרי עם MCM מאפשר שילוב עם מדדים רבים אחרים.

באמצעות שימוש בתאי HL-60 ובשאיפת מח עצם אנושית ניתן להראות כיצד תנאי ניסוי יכולים להשפיע על התפלגות מחזור התא וניתוחו. ראשית, יש לבסס את אסטרטגיית ה-gating כדי להדגים כיצד נגזרים שלבי מחזור התא. באיור 1 אנו מראים את הקמתו של שער סינגלט, שהוא חשוב בהפרדת פסולת תאית וכפילים, ויוצר אוכלוסיית תא יחיד. עבור קווי תאים, שער סינגלט הוא כל מה שצריך כדי לעבור לניתוח מחזור התא (איור 2a). עבור דגימות אנושיות, אוכלוסיות אימונופנוטיפיות בדרך כלל צריכות להיקבע לפני ניתוח מחזור...

פרוטוקול זה מתאים את מדידות מחזור התא לשימוש בפלטפורמת ציטומטריית מסה. עם היכולות מרובות הפרמטרים של ציטומטריית מסה, מדידה ישירה של שילוב יוד מאפשרת זיהוי תאים בפאזה S בעוד סמני מחזור תוך תאיים מאפשרים אפיון של כל מצב מחזור תא במגוון תנאי ניסוי.

שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון את מחזור התא ברמת התא הבודד באמצעות ציטומטר המסה, וזה מאפשר לבצע מספר מחקרים ומחקרים קליניים חדשניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה. IdU מתווסף ישירות לתאים ואין צורך בטיפול נוסף או נוגדנים.השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור את מצב מחזור התא בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה בתוך תאי הגזע ותאי האב. וזה הראה כי תכונות מחזור התא של סוגי תאים ספציפיים אלה עשויים להיות בקורלציה עם התוצאה הקלינית של חולים עם מחלות אלה. טכניקה זו יכולה להיות שימושית להבנת תכונות הצמיחה של תאים סרטניים נדירים ולהבנת ההתרבות של תת-קבוצות תאי חיסון.לפני ואחרי הוספת IdU לדגימות התא, לשמור על התאים בתנאי הגידול המעניינים. במקרה זה, אינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 כדי לסמן את התאים ב-IdU, מדלל את תמיסת מלאי ה-IdU המרוכזת מאחד עד 50 לתוך מצע הגידול של התאים. לאחר מכן העבירו את הדגימות למכסה מנוע בטיחות ביולוגית והוסיפו 10 מיקרוליטר של IdU מילימולרי אחד לכל מיליליטר אחד של תאים.החזר את התאים לאינקובטור למשך 10 עד 15 דקות לפני העברת הדגימות לצינורות חרוטיים בודדים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בצינורות חרוטי 15 מיליליטר ולהשעות מחדש את הכדורים ב 200 מיקרוליטר של PBS לכל צינור. במידת הצורך, תייגו את התאים בכתם חי/מת מתאים כדי לסמן את התאים המתים.לאחר כתם חי/מת, הרוו את התאים במדיה שנשטפה ב-CSM לפני שקיבעו את התאים ב-25 מיקרוליטר של 16% פרפורמלדהיד. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, אוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. הוסף חמישה עד 15 מיליליטר של CSM וצנטריפוגה שוב.יש להשהות מחדש את הכדוריות ב-500 מיקרוליטר של מדיום צביעת תאים בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן להעביר את התאים לתוך צינורות קטנים יותר לאחסן אותם שלילי 80 מעלות צלזיוס. כדי לנרמל את ניתוח מחזור התא שלהם, ייבא את הקבצים לתוכנה מתאימה לניתוח ציטומטריית זרימה וצור תרשים דו-צדדי של אורך האירוע לעומת 191 אירידיום.התאים יהוו אוכלוסייה גבוהה מובהקת של אירידיום בהיר. שנה את קנה המידה של אורך האירוע כדי לגרום לתאים להיראות בולטים יותר. לאחר מכן צור שער סינגלט כדי לא לכלול 50% עד 60% מהכפילים והפסולת והגדר את הפרמטרים השיוריים והמוסטים של גאוס כדי להסיר את הכפילות והפסולת שנותרו.כדי להגדיר את שער שלב S, צור תרשים דו-צדדי של IdU לעומת סמן התפשטות. התאים החיוביים של IdU בשלב S יהוו אוכלוסייה מובחנת. עבור G0/G1, ו- G2/M gating, להקים את השערים על מגרש IdU לעומת Cyclin B1.שלב G0/G1 יהיה Cyclin B1 נמוך, IdU שלילי, ושלב G2/M יהיה Cyclin B1 גבוה, IdU שלילי. כדי לשער עבור סוגי תאים ספציפיים, התווה רק את התאים בשלב S בגרף Cyclin B1 לעומת IdU כדי לסייע בביסוס ההפרדה בין תאי פאזת G0/G1 לתאי פאזת G2/M. ציירו שער סביב האוכלוסייה הגבוהה של ציקלין B1.במקרים מסוימים, זה יכול להיות קשה להבחין, אבל רמת ציקלין B1 של כ -5% העליונים של אוכלוסיית שלב S היא בדרך כלל נקודת השבירה בין שערי הפאזה G0/G1 ו- G2/M. התאים השוכנים בתוך השער הקודם יהיו אוכלוסיית הפאזה G2/M, ואילו השאר יהיו אוכלוסיית הפאזה G0/G1. כדי לבסס את אוכלוסיית שלב G0, צור חלבון רטינובלסטומה זרחני לעומת תרשים IdU.שלב G0 ייוצג על ידי חלבון רטינובלסטומה זרחני נמוך, אוכלוסייה שלילית IdU. מכיוון שאוכלוסיית האופניים הפעילה תדגים חלבון רטינובלסטומה עתיר זרחן ושילוב IdU, ניתן לשרטט את שער הפאזה G0 על גבול זה כפי שהוא מתבטא בדרך כלל בשתי אוכלוסיות נפרדות. אם שער G0 קשה להגדרה, הפוך את אוכלוסיית שלב S לאוכלוסייה הפעילה וצייר שער המשלב את 90 עד 100% העליונים של האוכלוסייה הגבוהה של חלבון רטינובלסטומה זרחני.האוכלוסייה הנמוכה של חלבון רטינובלסטומה זרחני מחוץ לשער היא בדרך כלל אוכלוסיית G0, בעוד שתאי G0/G1 עם רמות pRb הנופלים בשער זה הם תאי G1. עבור גידור שלב M, צור IdU לעומת היסטון H3 פוספורילציה על ידי חלקה צירית. שלב M ייצפה כחלק קטן מאוד של תאים באוכלוסיית היסטון H3 זרחני.התאים באוכלוסיית G2/M עם רמות נמוכות יותר של pHH3 הם תאי G2. אם שילוב IdU נכשל או לא היה אפשרי, הגדירו את שברי התאים המחזוריים ולא המחזוריים באמצעות Ki67 וחלבון רטינובלסטומה זרחני. האוכלוסייה החיובית הכפולה תייצג את אוכלוסיית האופניים הפעילה בקורלציה בין שלבי G1, S, G2 ו-M.האוכלוסייה הנמוכה הכפולה תייצג את אוכלוסיית הלא רוכבים על אופניים התואמת לשלב G0. לאחר הקמת כל השערים, יצא את הערכים המספריים מהשערים. ניתן להשיג את האחוזים בכל מחזור על ידי חיסור האוכלוסיות הבודדות מהאוכלוסיות המשולבות כדי ליצור ערכים מספריים עבור כל שלב מחזור תא בודד לצורך גרפים וניתוח סטטיסטי עוקבים.הקמת שער הסינגלט חשובה להפרדת הפסולת התאית והכפילים כדי לאפשר בידוד של אוכלוסיית התאים הבודדים. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח מחזור תאים של התאים הבודדים. תיוג IdU ולכן ניתוח מחזור התא במורד הזרם יכול להיות מושפע באופן משמעותי על ידי זמן וטמפרטורה.לדוגמה, תאים שנשארים זמן רב מדי בכלי סגור או בהובלה בין מיקומים יהיו בעלי שברים מופחתים בפאזה S וזה לא יהיה מדויק עבור ניתוח מחזור התא. דגימות תאים המוחזקות לפרקי זמן קצרים של שעה או פחות עדיין מדגימות התפלגות נורמלית של מחזור התא, מה שמצביע על כך שהובלה מהירה עשויה שלא להשפיע לרעה על הניתוח. תאים שמורים בהקפאה עשויים לדרוש תקופת שיווי משקל ארוכה לפני שהתאים יחזרו למחזור תאים פעיל, אשר עדיין עשוי שלא לשקף את מצב מחזור התא שלפני ההקפאה.סוגי תאים שונים עשויים גם להיות מושפעים באופן דיפרנציאלי מתנאי תחזוקה. לדוגמה, בדגימת מח עצם אנושית זו, תאי T הדגימו ירידה במספר התאים בהשוואה למונובלסטים מאותה דגימה. יתרון נוסף של ציטומטריית מסה הוא היכולת להבחין בין תאים במעצר מחזור התא או שיש להם התפלגות מחזור תאים חריגה.יתרון גדול של טכניקה זו הוא שהיא מתאימה בקלות למדידות ציטומטריית מסה אחרות כגון פנוטיפ פני השטח, מבנה הכרומטין, גירוי ציטוקינים תוך תאי, אשר יכול להיות מתואם עם מצב מחזור התא. השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור תשישות תאי מערכת החיסון, הזדקנות, ולהראות כי התגובה לכימותרפיה בחולים עם לוקמיה חריפה עשויה להיות בקורלציה עם תכונות מחזור התא של תאי לוקמיה.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לצביעת BrdU immunofluorescence. הטכניקה מאפשרת זיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדנים מאפשרת ניתוח מפורט של גורל תאי שלב S בזמנים מאוחרים יותר.

BrdU Immunofluorescence Staining: טכניקה לזיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא

הסרטון מדגים גישה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות עקה שכפול בתאים סרטניים. תאים שטופלו בהידרוקסיוראה מייצרים DNA חד-גדילי, המזוהה באמצעות אימונופלואורסנציה. ספירת מוקדי הפלואורסצנטיות הירוקים מצביעה על רמת לחץ השכפול בתאים סרטניים.

שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות עקה שכפול בתאים סרטניים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

חקור ניתוח מחזור תאים ברמת תא בודד באמצעות ציטומטריית מסה וסימון IdU ישיר. השיטה מאפשרת לחקור תאי סרטן נדירים ולהבין קורלציה בין מצב מחזור התא לתוצאות קליניות בחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה.

שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים