Name: מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: חקור מודל מבחנה לאנגיוגנזה כלילית באמצעות תרביות אקספלנט מסינוס ונוזוס ואנדוקרדיום מעכברים. המודל חוקר תגובות תאיות ל-VEGF-A ומחקה תנאים פיזיולוגיים לחקר מנגנוני פיתוח ותיקון הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברי מעבדת שארמה על מתן סביבת מחקר תומכת. אנו אוהבים להאריך תודה מיוחדת לדיאן (די) ר. הופמן ששומר ודואג למושבת העכברים שלנו. אנחנו גם רוצים להודות לג פיליפ הSmaldino וקרולין ואן על הגהה יסודית של כתב היד והענקת הערות מועילות. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרנות מהמשרד הראשי של האוניברסיטה הממלכתית ומחלקת הביולוגיה של B. S, אינדיאנה האקדמיה למדעים מחקר בכיר מענקים כספים ל-B. S, ו-NIH (RO1-HL128503) ואת הקרן ניו יורק גזע תא קרנות כדי K.R.

<ol><li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
<li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li>
<li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li>
<li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li>
<li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Development%3A+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li>
<li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li>
<li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li>
<li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li>
<li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li>
<li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%2C+a+specific+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

חלק מהצעדים הקריטיים ביותר לגידול בהצלחה באוניות כלילית מתוך הרקמות SV ו-אנדו הם: 1) זיהוי נכון ובידוד רקמת SV עבור תרבות SV; 2) שימוש בחללי החדרים מעוברים בין הגילאים e11-11.5 לתרבות אנדו מדויקת; 3) שמירה על תנאים סטריליים לאורך תקופת הניתוח ושמירה על הרקמות קרות בכל עת; ו 4) שמירה על explants מחוברים קרום ECM מצופה כדי למנוע רקמות צף במדיום.
ראשית, בידוד של רקמת SV יכול להיות מאתגר. חשוב להבין כי SV שוכנת בצד השני של הלב בין שמאל וימין אטריה חבוי בתוך lobules הריאה. לכן, קשה להפריד ולבודד. ב...

כלי הדם של הלב נקראים בדרך כלל כלי דם כליליים. כלי הדם מורכבים מעורקים, עורקים ונימים. במהלך פיתוח, נימים מאוד מסוקנים מבוססים על הראשון, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך עורקים וורידים כליליים1,2,3,4,5. הנימים הראשוניים האלה בנויים מתאי מחולל שורש שנמצאו בתוך הפרואפידיום, הסינוס venosus (SV), ו אנדוקרדיום (אנדו) רקמות1,6,7,8. SV הוא האיבר הנכנס של הלב העובריים ואנדו הוא הציפוי הפנימי של הלב לומן. תאי מחולל שורש שנמצאו ב-SV ו-אנדו בונים את רוב העורקים הכליליים, ואילו הפרואפידיום תורמת לחלק קטן יחסית ממנו2. התהליך בו הרשת הקפילר של כלי הדם הכליליים גדלים בלב התאים הקודמיים הקיימים נקראת אנגיוגנזה כלילי. מחלת עורק כלילית היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, ובכל זאת, טיפול יעיל למחלה זו חסר. הבנת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המפורטים באנגיוגנזה כלילית יכולים להועיל בעיצוב הטיפולים החדשניים והיעילים לתיקון ולחידוש העורקים הכליליים שנפגעו.
לאחרונה, גל ההבנה שלנו כיצד מתפתחים כלי קיבול כליליים הושג באופן חלקי באמצעות פיתוח כלים וטכנולוגיות חדשים. בפרט, בשנת vivo התוויות היוחסין וטכנולוגיות הדמיה מתקדמות שימושי מאוד לחשוף את המקור הסלולר בידול מסלולים של כלי כלילית9,10,11,12. למרות היתרונות של אלה בכלים vivo, קיימות מגבלות במונחים של מהירות, גמישות ונגישות. לכן, מערכות מודל מבחנה חזקות יכולות להשלים במערכות vivo כדי להבהיר את המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה.
כאן, אנו מתארים מודל מתורבת של אנגיוגנזה כלילית. פיתחנו מערכת תרבות התפתחות מחוץ גופית כדי לגדל כלי קיבול כלילית משני רקמות קדמון, SV ו אנדו. עם המודל הזה, אנו מראים כי ברקמות הרקמה מחוץ למוח החוקר לגדול ניצנים כלילית כאשר מגורה על ידי מדיום הצמיחה. בנוסף, תרבויות ההסבר גדלות במהירות בהשוואה לשליטה בזמן הגירוי על ידי גורם הגדילה של כלי הדם A ("וואפ-א"), חלבון אנגיוגנטי חזק במיוחד. יתרה מזאת, גילינו כי נבטי האנגיוגנטית מתרבות ה-SV עוברים הבחנה ורידים (אובדן הבעת ההפיכה-TFII), מנגנון הדומה לאנגיוגנזה של SV ב-vivo1. נתונים אלה מצביעים על כך שמערכת התרבות התרבותית של החברה ממריצה בנאמנות אירועים של אנגיוגנטי המתרחשים בvivo. באופן קולקטיבי, במודלים של האנגיוגנזה המתוארים כאן, הם אידיאליים לבדיקה של מנגנונים סלולאריים ומולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה ונגישה.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 מ"מ צלחת תרבית רקמות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>877222</td><td>המכונה בפרוטוקול צלחת פטרי</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8.0 uM תרבית ממברנה PET מוסיפה</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey אנטי ארנב 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Alexa פלואור חמור נגד חולדה 488</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A21206</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>בדיקת מתכת זוויתית</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10088-15</td><td>זווית 45 מעלות, המשמש לאיתור פקקים עמוקים</td></tr><tr><td>אנטי ERG 1/2/3 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>אנטי-VE-Cadherin נוגדן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BDB550548</td><td>נוגדן ראשוני, יצרן BD BioSciences</td></tr><tr><td>CO2 מיכל גז</td><td>ספקים שונים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>עבור 37 &deg; C, 5% CO2 דגירה</td></tr><tr><td>דיסקציה סטריאומיקרוסופ</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i סטריאומיקרוסקופ</td></tr><tr><td>EBM-2 מדיה בסיסית</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>גידול תאי אנדותל מדיה בסיסית</td></tr><tr><td>פתרון ECM</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>הידוע מסחרית בשם Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>ערכת תוסף תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים; זה מעורבב לתוך ה-EBM-2 כדי להפוך את ה-EGM-2 למדיה מלאה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>תוכנת עיבוד תמונה (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11412-11</td><td>משמש לעובר דיסקציה</td></tr><tr><td>פישרברנד מספריים הפעלה עם להב ישר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone פוספט מאגר מלח (1X)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע תרבית רקמות זרימה למינרית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>דגמים שונים זמינים</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה</td><td>מעבדות וקטור</td> בינוני <td>H-1200</td><td>Vectashield עם DAPI</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים/פישר</td><td>50-980-494</td><td>זה זמין ב-32%; צריך לדלל ל-4%</td></tr> <tr><td>כף מחוררת</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10370-18</td><td>שימושי בהסרת עובר/רקמות מתמיסה</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים, Dumont #5</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>תא עכבר/חולדה Sure-Seal</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>תא המתת חסד</td></tr></tbody></table>

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

כאן, אנו מתארים בתוך שיטת תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית. כלי דם כליליים מזינים את שריר הלב והינם בעלי חשיבות קלינית. פגמים בכלי זה מייצגים סיכונים בריאותיים חמורים כגון טרשת עורקים, אשר יכול להוביל שריר הלב infarctions וכישלונות לב בחולים. כתוצאה מכך, מחלת עורק כלילית היא אחת הסיבות המובילות בעולם למוות. למרות החשיבות הקלינית שלה, התקדמות קטנה יחסית נעשתה על איך לחדש את העורקים הכליליים פגום. אף על פי כן, ההתקדמות האחרונה נעשתה בהבנת המקור הסלולר ומסלולי הבידול של פיתוח כלי קיבול כלילית. הופעתו של כלים וטכנולוגיות המאפשרים לחוקרים לתייג באופן מרשים בתאי קדמון, לעקוב אחר גורלם, ולהמחיש progenies בvivo היתה אינסטרומנטלית בהבנת התפתחות כלי הקיבול כלילית. במחקרים vivo הם יקרי ערך, אך יש להם מגבלות מבחינת מהירות, נגישות וגמישות בתכנון ניסיוני. לחילופין, מדויק במודלים מחוץ לגוף של אנגיוגנזה כלילית יכול לעקוף מגבלות אלה ולאפשר לחוקרים לחקור שאלות ביולוגיות חשובות במהירות ובגמישות. חוסר ההתאמה במערכות מודל החוץ-גופית עלול להיות מפריע להתקדמות בהבנת המנגנון הסלולר והמולקולרי של צמיחת כלי קיבול כלילית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות מבחנה לגדל כלי כלילית מן venosus סינוס (SV) ו אנדוקרדיום (אנדו), שתי רקמות הקדמון שממנו רבים של כלי כלילית להתעורר. כמו כן, אנו מאשרים כי התרבויות באופן מדויק לכידה של חלק הידוע במנגנונים vivo. למשל, אנו מראים כי נבטי האנגיוגנטי בתרבות מ-SV הפחתת הפיכה-TFII הביטוי דומה למה שנצפה ב vivo. בנוסף, אנו מראים כי מרכיב ה-אנגיוf-A, גורם מוכר היטב בvivo, מעורר את האנגיוגנזה הן מתרבויות הSV והן מתרביות האנדו. באופן קולקטיבי, המציאו מודל מדויק של תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית.

אחת התכונות הבולט ביותר של אנגיוגנזה של SV ב vivo היא שהיא עוקבת אחר מסלול מסוים וכרוכה בביטול התא ובידול אירועים המתרחשים בזמנים ומיקומים1. כמו תאים SV הראשונית לגדול על חדר הלב, הם מפסיקים לייצר סמנים ורידים כגון הפיכה-TFII (איור 7). לאחר מכן, נבטי כלילית לקחת שני נתיבי הגירה, על פני השטח של הלב או עמוק בתוך שריר הלב. ספינות פני השטח בסופו של דבר להפוך ורידים בעוד הפולש כלי להפוך עורקים נימים1,<sup ...

במודלים של בעלי מבחנה של אנגיוגנזה כלילית ניתן לעשות שימוש לגילוי המנגנון הסלולר והמולקולרי של אנגיוגנזה כלילית. באופן מתורבת תרבויות של הסינוס venosus ורקמות אנדוקרדיום להראות צמיחה חזקה בתגובה ל-ולהציג דפוס דומה של הביטוי הפיכה-TFII כמו ב vivo.

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה מאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון המולקולרי של אנגיוגנזה כלילת מחוץ לאורגניזם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מודלים במדויק את התהליך של אנגיוגנזה כליילי בתוך אורגניזם, להקל על המחקר של המנגנונים של אנגיוגנזה כליילית. התחל על ידי ריסוס עכבר בהריון נושא עוברי יום 11.5 עוברים עם 70% אתנול.מרים את העור על הבטן עם ממטרים, להשתמש במספריים כדי להפוך את עור הבטן חתך צנית באופן כללי ו anteriorly עד הסרעפת כדי לחשוף את קרן הרחם. אוחז ברחם, חותך את הרקמה בחופשיות ושולף את קרן הרחם. מניחים את מחרוזת העוברים לתוך PBS סטרילי קר כקרח תחת מיקרוסקופ סטריאו, לקלף את שריר הרחם, שקי חלמון, וכיסוי amnion מכל עובר.כאשר כל עובר מבודד, השתמש בכף מחוררת כדי להעביר את הרקמות לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה PBS סטרילי על קרח. כדי לקצור את רקמת הלב העוברית, להעביר את העובר הראשון להיות ניתחו לתוך צלחת פטרי חדשה מתחת למיקרוסקופ, ולמקום את העובר בצד הגחוני למעלה. השתמש מדפים עדינים לעשות חתך קטן בחזה, מעט מעל הסרעפת, ולהכניס את המדפים סגורים לתוך החתך כדי להגדיל את החתך.באמצעות המקלעות להחזיק את קיר החזה פתוח כדי לחשוף את הלב והריאות, להשתמש בזוג השני של ממטרים כדי להזיז בעדינות את הלב לפני 90 מעלות כדי לחשוף את כאב הלב הגבי ואת וריד. לאחר מכן, תופסים את כלי הדם האלה בבסיס הלב, מושכים בזהירות את הלב והריאות בזהירות ושטיפת הרקמות עם PBS קר. כאשר כל רקמת הלב נקצרה, מניחים את דגימות הלב מתחת למיקרוסקופ ומסירים את האונות הריאה מכל לב.לכוון את הלב הראשון על הצד הגבי שלה, והחזקת הלב בבסיסו, להשתמש מטלפים עדין כדי לגרד את האטריה שמאלה ויימין ברקמה הסמוכה המקיפה את SV מהלב. כדי לבודד את SV, לכוון את הצד הגבי הלב למעלה. בזהירות להסיר את SV מהלב ולהשתמש פיפטה העברה סטרילית למקם את הרקמה המבודדת לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטר חדש המכיל קרח קר סטרילי PBS על קרח.כדי לבודד את כל החדרים, להסיר את דרכי הזרימה ולהשתמש פיפטה העברה סטרילית חדשה למקם את החדרים לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטרים נפרדים המכיל PBS סטרילי קר קרח על קרח. כדי להקים SV ותרבויות חדר שלם, ראשית לצפות את הממברנות של אחד שמונה מיקרומטר נקבובית תרבות PET להוסיף לגם של צלחת תרבות 24 באר, עם 100 microliters של מטריצה חוץ תאית מדולל טרי לכל תרבות לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר המטריצה התגבשה, השתמש בפיפיט העברה כדי להעביר הסבר אחד לכל הכנס, והזז את הלוחית מתחת למיקרוסקופ.באמצעות מדפים נקיים, למקם את explants במרכז כל הכנס כדי להבטיח כי הם אינם מחוברים לקירות הצדדיים, בזהירות להסיר כל PBS נוסף. לאחר מכן, להעביר את הצלחת עם המכסה סגור תחת מכסה המנוע תרבות רקמת זרימה למינארית, ולהוסיף 100 microliters של מדיום מלא מחומם מראש לכל הכנס, ו 200 microliters לבאר מתחת לכל הכנס. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של PBS לבירות שאינן שימוש, והמקמים את הצלחת בחמה לתרבות התאים למשך חמישה ימים.לטיפול VEGF-A ביום השני של התרבות, הסר את המדיום משני התאים של כל תרבות והוסף 100 מיקרוליטרים של PBS לכל הכנסה, ו -200 מיקרוליטרים של PBS לכל באר. לאחר מערבולת הצלחת כמה פעמים, להחליף את PBS עם 300 microliters של מדיום בסיס בתוספת 1% סרום בקר עוברי להתחיל את התרבויות, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור. ביום השלישי לאחר רעב, להוסיף 300 microliters של מדיום בסיס טרי בתוספת סרום לבירות הבקרה ואת המדיום הבסיסי בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר של VEGF-A לבירות הטיפול, ולהחזיר את הצלחת לחממת תרבות התא.ביום השישי של התרבות, לשטוף את התאים עם PBS כפי שהוכח, ולתקן את התרבויות עם 200 microliters של 4% paraformaldehyde בכל באר, ו 100 microliters של קיבוע בכל הכנס. לאחר 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה, לשטוף את התרבויות עם 300 microliters של PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף עם נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני ל הבארות ומכניסים לתרבות לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה.למחרת בבוקר, לשטוף את התרבויות 10 פעמים פעילי שטח שאינם יוניים ב PBS עם נדנדה, שינוי פתרון לשטוף כל 10 דקות לפני תיוג התרבויות עם 300 microliters של נוגדן משני פלואורופור מתאים גדוש בארבע מעלות צלזיוס לילה עם נדנדה. למחרת, לשטוף את התרבויות 10 פעמים PBS טרי עם פעילי שטח שאינם יוניים כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש במקלפים עדין כדי לקלף בזהירות את הממברנה מכל הכנס ולהציב את הממברנות על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית בודדות, צד explant למעלה.מכסים את הדגימות עם אמצעי הרכבה בתוספת DAPI בפתק כיסוי, וחותמים את הקצוות של מחליקי הכיסוי עם לק ציפורניים ברור. כאשר לק הציפורן התייבש, תמונה השקופיות על ידי מיקרוסקופיה confocal. כאשר תאי SV ראשוניים גדלים על החדר הלב, הם מפסיקים לייצר סמנים הווריה כגון Coup-TF2.לאחר חמישה ימים של תרבות, תאי אנדותל SV לנבוט לנדוד על הממברנה. כמו בלב העוברי, ביטוי Coup-TF2 מצטמצם ככל שהספינות נודדות הרחק מה-SV. תרבויות מגורה עם VEGF-A התערוכה צמיחה מוגברת של נבטים אנגיוגניים הן בצפיפות והן באורך. תרבויות SV נוספות מגורה על ידי VEGF-A להפגין עלייה כמעט פי שלושה אורך נבטים לעומת פקדים, מה שמרמז כי נבטים אנדותל מ SV ו אנדוקרדיום להגיב VEGF-A.חשוב לא לאבד את רקמת ה-SV תוך משיכת הלב והריאות, הסרת האטריה וניקוי הרקמה הסמוכה המקיפה את ה-SV. ניתן לבצע ניסויי הדמיה חיה כדי לדמיין אנגיוגנזה כלימית וללכוד את הפרטים של הדינמיקה התאית והמולקולרית במהלך התהליך. טכניקה זו שימושית ביותר להערכת מנגנונים מולקולריים פוטנציאליים של אנגיוגנזה כלילת וכמערכת מודל לחקר אנגיוגנזה באופן כללי.

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת חרוזים מיקרו-נשאים המשלבת פריציטים לחקר הנבטת אנדותל בשלבים המוקדמים של אנגיוגנזה. הבדיקה מספקת מודל ניסויי במבחנה להבנת מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה ואת ההשפעה של טיפולים אנטי-אנגיוגנטיים.

בדיקת הנבטת חרוזים להערכת אנגיוגנזה בשלב מוקדם: מודל מבוסס חרוזים במבחנה לחקר הנבטת אנדותל בנוכחות פריציטים

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

אנו מתארים גישה מיקרו עבור הדור של בלופ arteriovenous (AV) כמודל לניתוח כלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיין. מודל זה הוא לא רק שימושי עבור חקירת אנגיוגנזה, אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור הנדסה vascularized axially ורקמות להשתלה.

Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג'ין MSC.

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

הנבטת אנגיוגנזה, הבסיסית להתפתחות ומחלות, כרוכה בתהליכים מולקולריים ומכניים מורכבים. אנו מציגים מודל 2.5D ex vivo רב-תכליתי המנתח נביטה תאית מעורקי הצוואר החזיריים, וחושף אנגיוגנזה תלוית קשיחות ומכניקת תאים מובילה-עוקב מובהקת. מודל זה מסייע בקידום אסטרטגיות הנדסת רקמות וגישות לטיפול בסרטן.

מודל 2.5D לאפיון מכני ex vivo של אנגיוגנזה מונבטת ברקמה חיה

חקור מודל מבחנה לאנגיוגנזה כלילית באמצעות תרביות אקספלנט מסינוס ונוזוס ואנדוקרדיום מעכברים. המודל חוקר תגובות תאיות ל-VEGF-A ומחקה תנאים פיזיולוגיים לחקר מנגנוני פיתוח ותיקון הלב.

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

גלה סרטונים נוספים