Name: הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למד שיטת טרנסגנזה בחולדות באמצעות וקטורים לנטיויריים להכנסת גנים לעוברי חולדות. הטכניקה כוללת הזרקות מרובות לחלל הפריוויטליני ומאפשרת יצירת קווי חולדות טרנסגניים יציבים למחקר גנטי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט ANIMOD בתוך תוכנית צוות טק ליבה מתקן פלוס של הקרן למדע הפולני, ממומן על ידי האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח האזורית למשרד שבוע.

<ol><li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li>
<li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rat+as+an+Experimental+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li>
<li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+in+rat+genetics%3A+a+community+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li>
<li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m%3A+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li>
<li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li>
<li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Rat+Genomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li>
<li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+modifications+of+the+rat+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li>
<li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+rats%3A+Technical+aspects+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li>
<li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499(2019).</li>
<li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520(2001).</li>
<li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li>
<li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+rats%3A+technical+aspects+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li>
<li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li>
<li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li>
<li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Rat+Genomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li>
</ol>

למחבר (W.K.) יש זכויות לפטנט, "שיטת ייצור בעלי חיים טרנסגניים", מתוך משרד הפטנטים של הרפובליקה הפולנית (no. P 355353; 21.03.2008).

ההתקדמות בטכנולוגיות הטרנסגניים הפכו דגמי מכרסמים כלי רב-ערך במחקר ביו-רפואי. הם מספקים את ההזדמנות ללמוד גנוטיפ-פנוטיפ יחסים ב vivo. כאן, אנו מציגים חלופה זמינה נרחב עבור הטרנסגנזה קונבנציונאלי על ידי באמצעות זריקות ברורות. השימוש של התמרה גנים לנטינגיזציה עוקפת את הצורך לדרוש הזרקות מיקרו משום וקטורים נגיפי ניתן להזריק תחת הסונה pelלוצ. גישה זו אינה משפיעה על שלמות העובר, אשר מבטיח ביסודו של 100% שיעור ההישרדות עבור הזיטים מוזרק. הטרנסגנים המשולבים בעזרת וקטורים משולבים באופן משולב בגנום הפונדקאי, ומאפשר ביטוי לטווח אר...

במשך שנים רבות, מכרסמים מעבדה, כגון חולדות ועכברים, נעשה שימוש כדי לעצב את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים האנושיים. מחקר בעלי חיים הוביל לתגליות שאינן מהשגה בכל אמצעי אחר. בתחילה, מחקרים גנטיים התמקדו ניתוח של הפרעות התרחשות ספונטנית ופנוטיפים הנחשבים הדוק לחקות את המצב האנושי1. התפתחות שיטות גנטיות הנדסה אפשרה הקדמה או מחיקה של גנים ספציפיים כדי לקבל פנוטיפ הרצוי. לכן, הדור של בעלי חיים טרנסגניים מזוהה כטכניקה יסודית במחקר המודרני המאפשר מחקרים של תפקוד גנים באורגניזמים חיים.
טכנולוגיית החיות הטרנסגנית הפכה לאפשרית באמצעות שילוב של הישגים באמבריולוגיה ניסיוני ובביולוגיה מולקולרית. בשנות ה-60, הפולני embryologist א. טרקובסקי לפרסם את העבודה הראשונה על מניפולציה העובר העכבר בשלבים המוקדמים של פיתוח2. בנוסף, ביולוגים מולקולריים פיתחו טכניקות כדי ליצור וקטורים DNA (כלומר, נושאות) עבור הקדמה בין היתר של DNA זר לתוך הגנום של בעל החיים. וקטורים אלה מאפשרים את התפשטות הגנים הנבחרים ואת השינוי המתאים להם, בהתאם לסוג המחקר שנערך. המונח "חיה טרנסגניים" הוצג על ידי גורדון ורודל3.
המינים המקובלים הראשונים ששימשו לנוירוביולוגיה, פיזיולוגיה, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, ותחומים רבים אחרים של מדעים ביולוגיים ומדעי הרפואה היו החולדה הנורבגית, ראאוס נורבקוס4. עם זאת, בגלל הקושי לתמרן עוברי חולדה, עכבר הבית Mus מוסקולוס הפך להיות מינים דומיננטי בעלי חיים במחקר גנטי5. סיבה נוספת של העליונות של העכבר במחקר כזה היה הזמינות של הטכנולוגיה תא גזע מעובריים כדי ליצור חיות מהממת עבור מין זה. הטכניקה הנפוצה ביותר של טרנסגנזה (2 – 10% מהצאצאים הטרנסגניים ביחס לכל בעלי החיים הנולדים) היא המיקרו-הזרקה של שברי הדי. אנ. איי. ב-1990, גישה זו, שהוצגה לראשונה בעכברים, הותאמה לחולדות6,7. שינוי חולדה על ידי הזרקה ברורה מאופיין ביעילות נמוכה יותר8 לעומת עכברים, אשר קשורה בקפדנות לנוכחות של פלזמה אלסטי וממברנות9. למרות ההישרדות של העוברים לאחר מניפולציה היא 40-50% נמוך יותר בעכברים, טכניקה זו נחשבת תקן בדור של חולדות מהונדסים גנטית10. גישות חלופיות שיכולות להבטיח התאגדות העברה יעילה של טרנסגנים ושיעורי הישרדות גבוהים יותר של הזיטים מוזרק נחקרו.
דטרמיננטת המפתח של ביטוי הטרנסגנים יציב ושידור צאצאים הוא השילוב שלה לתוך הגנום התא המארח. לאנטי וירוסים (LVs) יש את התכונה הייחודית של להיות מסוגל להדביק את שני התאים חלוקה ושאינם מפרידים. השימוש שלהם ככלי לשילוב של גנים הטרוולוגיים לעוברים הוכחו להיות יעילים מאוד11, ואנשים הטרנסגניים מאופיינים ביטוי יציב של מקטע ה-DNA משולב. היעילות של וקטורים לונגיליים אושרה עבור השינוי הגנטי של עכברים12,13, חולדות12,14, ומינים אחרים11. בשיטה זו, ההשעיה LV מוזרק תחת הסונה ולוצידה של העובר בשלב של שתי שיטות. טכניקה זו מבטיחה ביסודו של 100% את ההישרדות של העוברים משום שהלמת אינו מושפע. הייצור של שתלים LV באיכות גבוהה ומרוכזים יחסית הם גורמים חיוניים. עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר של השעיות LV ניתן להתגבר על ידי הזריקות חוזרות11, אשר מגדיל את כמות החלקיקים ויראלי על פני הביצה בעוד לא להשפיע על שילוב ממברנה. עוברים החשופים זריקות חוזרות לחלל perivitelline לפתח עוד, והצאצאים הטרנסגניים יכולים לשדר את הטרנסגנים דרך germline. היעילות של דור החולדה הטרנסגניים על ידי הטרנסגנזה של הנגיף יכולה להיות גבוהה כמו 80%12.
כאן, אנו מתארים את הייצור של HIV-1 נגזר רקומביננטי, וירוס שהיה פסבדו עם וירוס stomatitis vesicular (VSV) מעטפה G חלבון. השימוש של הדור השני מערכת אריזה VSV הסוג המדומה קובע את הנגועים הרחב של חלקיקים ויראלי ומאפשר ייצור של וקטורים יציבים מאוד כי ניתן להתרכז על ידי הקפאת המערכת הקריואופטית. לאחר אימות סיכוייו, הווקטורים מוכנים לשמש כרכב עבור המסירה טרנסגנטית ללבקן הזיטים חולדה וויסטאר. לאחר סדרת זריקות, העוברים יכולים להיות מתורבתים בן לילה ולהעביר בשלב שני-תאים לאמהות מאמצות. בשלב זה, ניתן לשקול אחת משתי גישות חלופיות. ההליך הסטנדרטי מנצל הנקבות pseudopregnant כנמעני העובר. עם זאת, כאשר שיעור ההריון נמוך לאחר ההזדווגות עם הזכרים עיקור העוברים יכולים להיות מושתל לתוך ההריון wistar/ספראג-דאולי (SD) נקבות כי הם הזדווג עם חולדות גברים פורה עם צבע פרווה כהה (למשל, בראון נורווגיה [BN] חולדות). הצבע של הפרווה מאפשר הבחנה של צאצאים מן ההריון הטבעי מן הצאצאים שמקורם העוברים מניפולציות הועברו.

<table><tbody><tr><td>7500 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerrane (isoflurane)</td> <td>בקסטר</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי צינורות שואב לפיפטות מיקרו-נימיות מכוילות</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Atipam 5 מ"ג/מ"ל</td><td>Eurovet Animal Health BV</td><td>N/A</td><td>0.5 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>Baytril 25 מ"ג/מ"ל (אנרופלוקסאצין)</td><td>באייר</td><td>N/A</td><td>5-10 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה GC100TF-15</td><td>מכשיר הרווארד מוגבל</td><td>30-0039</td><td>נימי הזרקה</td></tr><tr><td>Bupivacaine 25 מ"ג/מ"ל</td><td>Advanz Pharma</td><td>N/A</td><td>0.25% in&nbsp; 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Butomidor 10 מ"ג/מ"ל (butorphanol&nbsp; טרטרט)</td><td>Orion Pharma</td><td>N/A</td><td>1 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאי רקמה CELLSTAR 35 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאי רקמה CELLSTAR 60 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>שמן CellTram</td><td>אפנדורף</td><td>5176 000.025</td><td></td></tr><tr><td>Cepetor (Medetomidine) 1 מ"ג/מ"ל</td><td>cp-pharma</td><td>N/A</td><td>0.5 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>כורולון, גונדוטרופין כוריוני אנושי&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>150 יחב"ל/מ"ל 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>DMEM דל גלוקוז</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6048</td><td></td></tr><tr><td>DNase, ללא RNase</td><td>A& ביוטכנולוגיה</td><td>1009-100</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax שמן מינרלי אור מסונן</td><td>סיגמא</td><td>ES-005-C</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מעטפת מקודד פלסמיד עבור וקטורים לנטי-ויראליים (VSVg פלסמיד)&nbsp;</td><td>ADDGENE</td><td>14888</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>4i /5252 000.013</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פוליגון, סוסה בהריון' s סרום גונדוטרופין&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>125 יחב"ל/מ"ל ב-0.9% תאי NaCl</td></tr><tr><td>HEK 293T&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>היאלורונידאז מאשך בקר&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>H4272-30MG</td><td>0.5 מ"ג/מ"ל במיקרוסקופ הפוך בינוני M2</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>קטמין 100 מ"ג/מ"ל</td><td>Biowet Pulawy</td><td>N/A</td><td>50 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>פרפין נוזלי</td><td>Merck Millipore</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>M16 בינוני EmbryoMax</td><td>Sigma</td><td>MR-016-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד 1M</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>63069-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td> <td>POLPHARMA OTC</td><td>N/</td><td>A סטרילי, אמפולות 5 מ"ל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פעולה&nbsp;</td><td>Inami Ophthalmic Instruments</td><td>Deca-21</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אריזה מקודדת פלסמיד לווקטורים לנטי-ויראליים&nbsp; (פלסמיד דלתא R8.2)</td><td>ADDGENE</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>מגיב PEI (פוליאתילנימין, Mw ~ 25,000,),</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח, pH 7.4, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806552-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Puller&nbsp;</td><td>סאטר אינסטרומנט ושות'</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>קליפ רפלקס קליפ אפליקציה/קליפס רפלקס</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>500345/500346</td><td></td></tr><tr><td>Safil, חומצה פוליגליקולית, קלועה, מצופה, חוטים נספגים</td><td>B.Braun כירורגי</td><td>1048029</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>חוט תפירה כירורגי</td><td>B.Braun&nbsp;</td><td></td><td></td>C1048040</tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4334973</td><td></td></tr><tr><td>טולפדין 4% (חומצה טולפנמית)</td> <td>Vetoquinol</td><td>N/A</td><td>2 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>TransferMan NK2</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA תמיסת</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924-500ML</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה L-100 XP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VacuTip</td><td>Eppendorf</td><td>5175108.000</td><td>מחזיקי נימי</td></tr><tr><td>Vita-POS</td><td>Ursapharm</td><td>N/A</td><td>משחת עיניים</td></tr><tr><td>צלחת חימום</td><td>Semic</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים שענים</td><td>VWR</td><td>470018-868</td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

מודלים בעלי חיים טרנסגניים חשובים ביסודם למחקר ביו-רפואי מודרני. השילוב של גנים זרים לתוך העכבר מוקדם או עוברי חולדה הוא כלי רב-ערך עבור ניתוח תפקודי גנים אורגניזמים חיים. שיטת הטרנסגנזה הסטנדרטית מבוססת על מיקרוהזרקת דנ א שברי זר לתוך כמובן של מופרית. טכניקה זו משמשת רבות בעכברים אך נותרת בלתי יעילה יחסית ותובענית מבחינה טכנית במינים אחרים של בעלי חיים. הטרנסגנים ניתן גם להציג לתוך העוברים בשלב תא אחד דרך זיהום ויראלי, מתן חלופה יעילה הזריקות ברור סטנדרטי, במיוחד מינים או זנים עם מבנה העובר מאתגרת יותר. בגישה זו, השעיה המכילה וקטורים מוזרקים מוזרק לתוך החלל הפריבינאי של עובר חולדה מופרית, שהוא מבחינה טכנית פחות תובענית ויש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. וקטורים לנטינגיליים הוכחו ביעילות לשלב את הטרנסגנים לתוך הגנום כדי לקבוע את הדור של קווים טרנסגניים יציבים. למרות מספר מגבלות (לדוגמה, ביובטיחות ברמה 2 דרישות, מגבלות גודל קטע ה-DNA), הטרנסלונגילוגיה היא שיטת טרנסגנזה מהירה ויעילה. בנוסף, שימוש בעכברושים נשיים שהוזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה מוצג כחלופה להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, וקטורים לונגיביים שנשאו את Syn-tdp-43-egfp המבנה יוצרו (הפיזי LV סיכוייו = 3.4 x 108/μl) ולאחר מכן יכול לשמש עבור העובר אחד-תאים בשלב השני זריקות subzonal. רק עוברים עם שני מראות. גלויים היו חשופים להליך מספר זריקות השעיות הנגיליות נקבעו כניסויים. יעילות השרשה גבוהה ומחסור סימולטני של צאצאים טרנסגניים נחשבו לאינדיקטורים של מספר לא מספיק של חלקיקים ויראליים לצורך התמרה מוצלחת. במקרה זה, מספר הזריקות הוגדלה. המינהל היחיד של LV הביא להולדתו של 20 F0-הדור חולדות, אף אחד מהם היו טרנסג...

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

בעלי חיים מהונדסים הם בסיסיים למחקר ביו-רפואי מודרני מכיוון שהם מאפשרים מחקרים על תפקוד גנים באורגניזמים חיים. שיטות שונות של שינויים גנטיים יישמו במחקרים בבעלי חיים. כאן, אנו מציגים טכניקה נגישה ויעילה נרחבת המשתמשת בווקטורים lentiviral ככלי לשילוב טרנסג'נדרים בגנום של עובר עכברוש.לאחר ניהול גונדוטרופין כוריוני אנושי, בן חמישה שבועות Wistar נקבה חולדות אחד לאחד עם פורה מינית שלושה עד 10 חודשים זכרים Wistar. בשעה 8 עד 10 בבוקר.m בבוקר שלמחרת, בדקו את הנקבות לנוכחות תקע וגינאלי וקצרו את האוביץ' מהנקבות עם תקע הזדווגות לא יאוחר מ-10 .m.לתוך צלחת איסוף המכילה מדיום M2 מחומם מראש. כאשר כל oviducts נאספו, להעביר את הרקמות לתוך צלחת 35 מילימטר המכיל בינוני M2 מחומם מראש בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר של hyaluronidase מן האשכים bovine ולמקום את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש מדפים עדין כדי לפתוח את הקירות של oviduct ולחץ על אמפולה עד העוברים משוחררים.כדי להקל על שחרור העוברים מתאים cumulus, להשתמש פיפטה העברת זכוכית מחובר צינור שאופה המופעל על ידי הפה בעדינות pipette העוברים למעלה ולמטה. כאשר כל העוברים שוחררו, לשטוף את התאים כמה פעמים במדיום M2 טרי כדי להסיר את hyaluronidase ופסולת הסלולר. מעבירים את העוברים ל-50 טיפות מיקרוליטר בודדות של מדיום M16 שקוויטר מראש מכוסה בשמן מינרלי בצלחת של 60 מילימטר.לאחר מכן מניחים את המנה לתוך חממה לחה 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספרה 5%פחמן דו חמצני עד הזריקה שלהם. עבור microinjection וקטור lentiviral תחת zona pellucida של עוברי שלב תא אחד, להשתמש מושך פיפטה להכין microinjection בורוזיליקט נימי זכוכית עם נימים. לאחר כל פעם נימי משתנה או נימי זכוכית חדש משמש, להפעיל בדיקת רמפה כדי להגדיר את הפרמטרים האופטימליים.לאחר מכן, השתמש בקצה microloader כדי לטעון כשני microliters של פתרון lentiviral מופשר טרי לכל פיפטה microinjection תחת מכסה המנוע זרימה למינארי biosafety. מוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר של מדיום M2 למרכז המכסה מצלחת פטרי 60 מ"מ. מכסים את המדיום בשמן מינרלי והר את פיפטה מחזיק ואת הנגיף טעון נימי microinjection על מיקרומניפולטור.מניחים את צלחת microinjection תחת מיקרוסקופ הפוך ולהעביר 15 עד 20 עוברי שלב תא אחד לתוך טיפת M2 בצלחת microinjection. ללכוד עובר אחד עם פיפטה מחזיק ולהשתמש הגדלה 400 פעמים נימי זכוכית להזריק את הפתרון lentiviral תחת zona pellucida לתוך החלל perivitelline מחזיק את נימי מתחת pellucida לרגע לאחר הנגיף נמסר. כאשר כל העוברים הוזרקו, השתמש פיפטה בסדר להחזיר את התאים מוזרק לצלחת התרבות ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא עד ההשתלה שלהם.כדי להכין את האמהות המאמצות להעברת העובר, חבר לנקבות ספראג-דוולי בוגרות מינית עם זכרים vasectomized ולבדוק את הנקבות למחרת בבוקר לתקע הנרתיק. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה אצל נקבות הרדמה עם תקע קיימא, להחיל משחה על העיניים של החיה לגלח את הפרווה מהגב של כל חיה. מניחים את החולדה הראשונה במצב נוטה על משטח נקי על כרית חימום תחת מיקרוסקופ כירורגי.מכסים את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן לחתוך מעל הגב התחתון ולעשות חתך בעור כשני סנטימטרים במקביל לעמוד החוליות המותני. השתמש מספריים חדים כדי להפוך חתך בקיר הבטן ולהשתמש מטליות לתפוס כרית שומן השחלות. מוציאים את השחלה ואת ה-oviduct מתוך חלל הבטן אל חתיכת גזה ספוגה נתרן כלורי 0.9%.לטעון M2 בינוני, שלוש בועות אוויר, ואת העוברים לתוך נימי העברה. השתמש microscissors לעשות חתך קטן לתוך oviduct בין infundibulum ו ampulla ולהכניס את קצה פיפטה העברה לתוך החתך. לגרש בעדינות את העוברים ואת בועות האוויר לתוך oviduct, ולאחר מכן להשתמש מדפים קהה למקם את מערכת הרבייה בחזרה לתוך חלל הבטן.תפרו את דופן הבטן עם תפרים סופגים חומצה פוליגליקולית וסגרו את חתך העור עם פצעים והניחו את החיה בכלוב נקי על צלחת חימום עם ניטור עד לפציעה מלאה. כדי vasectomize בני זוג פוטנציאליים, לאחר הכנת החולדה הגברית לניתוח כפי שהוכח, להשתמש 70%אתנול קרצוף כירורגי כדי לחטא את העור על האשכים. בעדינות ללחוץ על הבטן כדי לחשוף את האשכים בעצם האשכים ולכסות את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן מעל האתר הכירורגי ולהשתמש מספריים האשכים לעשות חתך 0.5 ס"מ באמצע הסק.בזהירות לדחוף את האשכים שמאלה ולאתר את vas deferens בין האשכים ואת קו האמצע כמו צינור לבן עם כלי דם אחד. השתמש במטליות של השען כדי למשוך בעדינות את האגרטלים ממק הדם ולהחזיק את הכלי במטליות, השתמש במספריים עדין כדי להסיר שבר של סנטימטר אחד מהצינור. חזור על ההליך עבור האשכים השני כפי שהוכח רק ולסגור את העור עם תפרים ספיגה חומצה פוליגליקולית.ואז למקם את החולדה לתוך כלוב נקי על צלחת התחממות עם ניטור עד חקירה מלאה. בניסוי מייצג זה, שבו הוזרקו עוברים בודדים מספר פעמים, שמונה חולדות נולדו עוברים שהוזרקו פעמיים, שלושה מהם אושרו לשאת את הטרנסג'ין. אחד המייסדים לא העביר את הטרנסג'ין וצאצאים ושלוש נקבות אומנה שימשו לכל מערך ניסיוני.הגישה שנבחרה אפשרה את הדור של קווי חולדה מהופנטים יציבים שהביעו את חלבון ההיתוך TDP-43-eGFP תחת שליטת הסינפסה העצבית במקדם אחד בכל מערכת העצבים המרכזית. טרנסג'נסיס מבוססת Lentivirus הביאה להכנסת עותק יחיד של הטרנסג'ין כפי שהוכח על ידי PCR כמותי. כאשר שיטה זו שימשה עבור וקטורים lentiviral אחרים, שיעור ההישרדות כ 90% נצפתה.אחוז העוברים ששרדו את זריקות הפרונוקלאר היה נמוך משמעותית. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי חולדות נקבה בהריון יכול לשמש אמהות אומנה עם יעילות דומה. יש לציין כי הנתונים המספריים שנותחו עבור סבבים בודדים של microinjection הצביעו על כך שהיעילות של ההשתלה תלויה ישירות במספר הזריקות לעובר אחד ותוך עקיפה בעומס הנגיפי.השימוש בווקטורים lentiviral מבטיח את האינטגרציה הגנומית והעברת הטרנסג'ין ומאפשר שיעור הישרדות גבוה של העוברים micromanipulated גם כאשר זריקות תת עוריות מרובות מבוצעות. הליך זה עשוי להיות מיושם ביעילות על מינים אחרים והוא יכול להיחשב חלופה transgenesis קונבנציונאלי.

generation-of-transgenic-rats-using-a-lentiviral-vector-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

סרטון זה מתאר הזרקה פרו-גרעינית של וקטורים לנטי-ויראליים לתוך החלל הפריביטלי של עובר עכבר מופרה. וירוס הלנטיוירוס מכיל את הטרנסגן, אשר משולב בגנום של העובר המופרי, ובסופו של דבר מוליד עכברים טרנסגניים.

הזרקת פריביטלין מבוססת וקטור לנטיויראלי: שיטה להמרת הגן המעניין לביציות עכבר חד-תאיות מופרות

מקור: Keefe, K. M., et al. הזרקה ישירה של וקטור לנטי-ויראלי מדגישה מסלולים מוטוריים מרובים בחוט השדרה של החולדה. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את הזרקת וקטור ויראלי יעיל ביותר להובלה לאחור (HiRet) לחוט השדרה של החולדה כדי לעקוב אחר מסלולים עצביים. לנגיף יש גליקופרוטאינים לכניסה סינפטית וגן מקודד חלבון פלואורסצנטי. המחט מוחדרת לחוט השדרה, ותרחיף הנגיף ניתן בקצב מבוקר. המחט נשלפת לבסוף לאחר מתן מספיק זמן לדיפוזיה ויראלית.

הזרקת וקטור ויראלי לחוט השדרה של החולדה למעקב עצבי לאחור

ניתן להשפיע על גנים בזמן ההתפתחות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס של החולדות באמצעות electroporation ברחם (IUE) בE16, כדי לאפשר שינויים מהירים וממוקד בקישוריות עצבית למחקרים מאוחרים יותר של התנהגות או neuropathology בבעלי חיים מבוגרים. אחרי לידה בתחום ההדמיה vivo על שליטה בהצלחת IUE מתבצעת על ידי פליטת אור של הפעלת לוציפראז transfected השותף.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

כתב יד זה מתאר כיצד העברת גנים מקומיים בתיווך וקטור ויראלי מספקת דרך אטרקטיבית לבטא טרנסגנים במערכת העצבים המרכזית.  הפרוטוקול מתאר את כל השלבים החיוניים לביצוע הזרקת וקטור ויראלי בחומר השחור של החולדה כדי לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

שיטות משלוח הגן רחב היקף מערכת העצבים המרכזית בחולדה מכוסים. בדוגמה זו, המטרה היא לחקות מחלה המשפיעה על חוט השדרה כולו. התמרה חושית רחבה יכול לשמש כדי לספק חלבון טיפולית מערכת העצבים מהמינהל, היקפי חד פעמי.

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לביטוי טרנסגני בלבבות חולדות ועכברים על ידי הזרקה ישירה של הנגיף בהנחיית אקוקרדיוגרפיה. שיטות להערכת הרגישות של לבבות להפרעות קצב חדריות על ידי גירוי חשמלי מתוכנת של לבבות מבודדים, Langendorff-perfused מוסברים גם כאן.

ביטוי טרנסגני נגיפי בלבבות מכרסמים והערכת הסיכון להפרעות קצב לב

פרוטוקול זה מציג גישה אופטימלית לייצור מודלים של חולדות מהונדסות-גנטית. וירוס הקשור לאדנו (AAV) משמש להעברת תבנית תיקון DNA, ואלקטרופורציה משמשת להעברת ריאגנטים CRISPR-Cas9 כדי להשלים את תהליך עריכת הגנום בעובר בן 2 תאים.

עריכת גנום CRISPR-Cas9 של עוברי חולדות באמצעות Adeno-Associated Virus (AAV) ואלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים

למד שיטת טרנסגנזה בחולדות באמצעות וקטורים לנטיויריים להכנסת גנים לעוברי חולדות. הטכניקה כוללת הזרקות מרובות לחלל הפריוויטליני ומאפשרת יצירת קווי חולדות טרנסגניים יציבים למחקר גנטי מתקדם.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

גלה סרטונים נוספים