בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

תאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות מושרה כדי להבדיל לתוך תאים מולדים עצביים ולאחר מכן לתוך אסטרוציטים נוירון ו oligodendrocyte. עם זאת, שיטת תרבות סוג עבור תאי גזע עובריים אנושיים וההתבוללות שלהם לתאי ניוון עצביים הם מאוד לא יעילים ופתוחים במערכת התרבות השותף vivo כאן אנו מציגים מערכת תרבות משופרת וחזקה כי הוא מדרג בקלות באמצעות צפיפות גבוהה סוג תא יחיד תרבות עם תאי גזע עובריים אנושיים. תרבות סוג תא יחיד של תאי גזע עובריים אנושיים מספקת מערכת מהירה ויעילה לחקר המנגנונים המולקולריים המווסתים את הבידול הרב-שלבי לאורך שושלת שושלת שונה ומובחנת, כולל תאי ניוון עצביים ובידולם לאחר מכן לשושלת עצבית נוספת.

התחל על ידי הכנת תא גזע עוברי אנושי מוסמך מטריצת קרום מרתף מצופה צלחות. להפשיר לאט את פתרון מטריצת קרום המרתף בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעתיים עד שלוש שעות או לילה. כאשר מופשרים, מדללים את המטריצה ב- DMEM/F-12 קר עד 2%, ומערבבים היטב כל באר של צלחת שש בארות עם מיליליטר אחד של הפתרון המדולל.

דגירה צלחות מצופות בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות או בארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי לעבור את התרבויות נטולות המאכילים של תאי גזע עובריים אנושיים מסוג H9 שגדלו על מטריצת קרום המרתף, שאפו את המדיום מה בארות ושטפו פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון Dispase לכל באר ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

הסר את Dispase בעדינות לשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של DMEM / F-12. לאחר הכביסה, להסיר את המדיום ולהוסיף שני מיליליטר של DMEM / F-12 לכל באר. ניתוק עדין של המושבות על ידי צינור למעלה ולמטה והעברתן לצינור של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה הצינור ב 370 פעמים g במשך שתי דקות. שאף את המדיום. לאחר מכן לנתק את כדורי התא לתאים בודדים על ידי הוספת שני מיליליטר של פתרון ניתוק תאים ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

חזור על הצנטריפוגה והסר את פתרון הניתוק. תן שוב את התאים במדיום ESC אנושי mTeSR-1 על-ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה. כדי להתאים את תאי הגזע העובריים האנושיים מסוג המושבה לתרבות סוג תא יחיד, צלחת כ 1.5 עד 2 מיליון תאים לתוך כל באר של מטריצת קרום המרתף מצופה צלחת בשני מיליליטר של mTeSR-1 המכיל 10 מעכבי רוק מיקרומולרי.

לאחר 24 שעות, החלף את המדיום עם mTeSR-1 טרי ללא מעכבי רוק. אפשר לתאים לגדול כסוג תא יחיד במשך שלושה ימים שינוי המדיום מדי יום. ביום הרביעי, לנתק את התאים בתסכול ניתוק מחדש צלחת אותם כפי שתואר קודם לכן.

לאחר שימוש חוזר ודגירה של התאים על פי הוראות כתב היד, מעבירים את הגופים העובריים הקטנים לצינור של 15 מיליליטר, נותנים להם להתיישב לתחתית, ומסירים בעדינות את המדיום עם פיפטה. מעבירים אותם למדיום EB ומאפשרים להם להתרחב במנות התקשרות נמוכות במשך שבעה ימים. כדי לגרום לתאי ניוון עצביים או התמדה NPC, לנתק את תאי גזע עובריים מסוג תא יחיד עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוק לדגר אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

צנטריפוגה התאים במשך שתי דקות ב 370 פעמים g. הסר את פתרון הניתוק על-טבעי. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים ב- DMEM/F-12.

צלחת התאים על מטריצת קרום מרתף מצופה צלחת שש באר בצפיפות של פעמיים 10 לתאים החמישיים לגם בשני מיליליטר של mTeSR-1 עם 10 מעכבי רוק micromolar. לאחר 24 שעות, החלף את מדיום התרבות עם מדיום אינדוקציה עצבית בתוספת מיקרומולר אחד דורסומורפין וחמישה מיקרומולרי SB431542. לשנות את המדיום כל יומיים במהלך ארבעת הימים הראשונים של אינדוקציה עצבית, ולאחר מכן כל יום עד ההתכנסות הוא הגיע ביום השביעי.

לאחר שבעה ימים של אינדוקציה עצבית, לנתק את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון ניתוק ודגירה אותם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים ב 370 פעמים g ולהסיר את פתרון הניתוק על טבעי. הוסף מיליליטר אחד של הרחבת NPC בינוני בעדינות pipette התאים למעלה ולמטה כדי לעשות שימוש חוזר.

ואז צלחת אחת 10 לתאים החמישיים לגם בשני מיליליטר של מדיום הרחבת NPC על מטריצת קרום המרתף מצופה שש צלחות היטב. מעבר התאים לפי הצורך כאשר תרבויות להגיע 90% confluency הוספת 10 מעכבי רוק micromolar במהלך שלושת עד ארבעה המעברים הראשונים. לשנות את המדיום כל יומיים במהלך ההתרחבות.

כדי להכין צלחות מצופות למינין של אש"ף, לדלל את פתרון המלאי של אש"ף ב- PBS או מים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, מערבבים היטב, ואז מצפים כל באר של צלחת שש באר עם מיליליטר אחד של הפתרון. הדגירה את הצלחות לפחות שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם PBS ומיד לאחר מעיל כל גם עם מיליליטר אחד של פתרון למינין מוכן על פי הוראות כתב היד.

שמור את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. כדי להבדיל NPCs לתוך נוירונים דופאמין, צלחת התאים בצלחות מצופה למינין אש"ף במדיום הרחבת NPC בצפיפות של כ 50% לאחר 24 שעות, לשנות את המדיום DA1 ולשנות את המדיום כל יומיים לאחר מכן. כדי לעבור תרבויות כאשר הם מגיעים confluency, לנתק את התאים עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוק דגירה אותם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

ואז צנטריפוגה אותם ב 370 פעמים g ולהסיר את פתרון הניתוק על טבעי. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום DA1 וצלחת אחת פעמים 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של מדיום על לוחות שש באר מצופים למינין אש"ף. כדי להבדיל את NPCs לאסטרוציטים, צלחת התאים על לוחות למינין אש"ף ובינוני הרחבת NPC בצפיפות של 50%לשנות את המדיום כדי אסטרוציטים בינוני לאחר 24 שעות, ולמעבר התאים כפי שתואר קודם לכן.

כאשר תאי גזע עובריים אנושיים מסוג המושבה הותאמו לתרבות סוג התא הבודד, נמצא כי התאים היו מסוגלים להישמר בצפיפות גבוהה, ואז בקלות וביעילות subcultured כאשר הושגה התפלה. תאים אלה שמרו על מאפייני מחזור התא האופייניים לתאי גזע עובריים אנושיים מסוג המושבה כגון שלב G1 קצר ושיעור גבוה של תאים בשלב S. ניתוח PCR כמותי גם אישר כי הם מבטאים סמני ESC ברמות דומות לאלה של תאים מסוג המושבה.

יתר על כן, הוכח כי תאי גזע עובריים אנושיים חד-תאיים הצליחו ליצור גופים עובריים המכילים תאים מכל שלוש שכבות הנבטים: אנדודרמה, מסודרמה ואקטודרמה. לאחר מכן הוכח כי תאי גזע עובריים מסוג תא יחיד הבדילו ביעילות ל- NPCs כפי שצוין על ידי אובדן מורפולוגיה אופיינית של תאי גזע עובריים אנושיים ומראה של מורפולוגיה NPC. בידול נתמך על ידי ביטוי מוגבר של סמני NPC חתימה ואושר על ידי immunostaining וניתוח FACS.

אותו ניתוח גם הראה כי יותר מ -90% מהתאים מוכתמים חיובי עבור SOX1, PAX6, וחלבונים NCAM. יתר על כן, NPCs נגזר הצליחו להבדיל לתוך נוירונים דופאמין ואסטרוציטים כפי שצוין על ידי המראה של morphologies אופייני וביטוי של סמנים ספציפיים לשושלת. בעת ניסיון הליך זה, חיוני לצלחת תאי גזע עובריים אנושיים בצפיפות גבוהה על מנת לשמור על בריא, תרבות תאי גזע עובריים אנושיים מו מויש.

פרוטוקול זה מספק פלטפורמה לייצור פשוט, חזק ומד מדרגי של עופרת ותא מובחן שיהיה מדרגי למחקר בסיסי, מסך סמים ויישום ברפואה נוירודגנרטיבית.