Name: כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למדו טכניקת אימונוהיסטוכימיה בהרכבתם המלאה לזיהוי חלבונים בעוברים וזחלים של זברה דניו. שיטה זו מאפשרת תצפית במרחב ובזמן של ביטוי חלבונים ברקמות שלמות ללא צורך בחיתוך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון מ-NIH גרנט 8P20GM103436 14.

ההליכים לעבודה עם מבוגרים הרבייה והעוברים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מורי סטייט.
1. איסוף העובר וקיבוע
<ol><li>הכנת טנקים המכינות ידי הצבת דג זברה מבוגרים זוגות סקס או קבוצות בטנקים עם רשת שינוי או הצמד ממולא מים מערכת בלילה.</li>
	<li>באור דולק, לשנות את המים ההשכן המיכל עבור מים מערכת טריים להסיר צואה. השתמש מחזור כהה של 14 h/10 h עם אורות מתקרבים ב -9 בבוקר.</li>
	<li>, ברגע שהביצים מטילות. החזר את המבוגרים למיכלי הבית</li>
	<li>לאסוף ביצים על ידי ציור אותם באמצעות pipet העברה או לשפוך אותם לתוך מסננת רשת שינוי.</li>
	<li>להעביר את הביצים לצלחות פטרי מילא באמצע הדרך עם העובר בינוני (כגון 30% Danieau או בינוני העובר של E2 עם 0.5 mg/L מתילן blue), הגבלת מספר העוברים לצלחת ל50.</li>
	<li>הסר את כל הביציות המתות או שאינן מתחלקת. הערה: עוברים מתים יכולים להיות מזוהים בקלות כאשר הם נעשים אטומים ולעתים קרובות מופיעים "מעונן". אם מתילן כחול מתווסף למדיום העובר, העוברים המתים לקחת מראה כחול כהה.</li>
	<li>מנות מודגרות של ביצים ב-28.5 ° c עד שיגיעו לשלב הרצוי. לניסוי זה, להעלות את העוברים עד 23 hpf.</li>
	<li>אופציונלי) להעביר את העוברים ב 24 hpf כדי 200 μm 1-פניקסיל 2-thiourea (ptu) במדיום העובר כדי למנוע melanogenesis16,17. לחילופין, עוברים מלבין שלאחר הקיבעון (ראו מקטע אופציונלי 5).</li>
	<li>שינוי בינוני העובר או בינונית PTU מדי יום.</li>
	<li>העוברים מורורonate בעזרת מלקחיים אולטרה-עדינים מתחת לstereomicroscope. לחילופין, העוברים כימית באמצעות דגירה של 1 מ"ג/mL בתוך בינונית העובר במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את העוברים מהפרואז ושטפו שלוש פעמים במדיום העובר.</li>
	<li>עוברים בעלי כורייתם. נדבקים לפלסטיק לשמור אותם בזכוכית או בצלחות פטרי מצופה עם 1-2% agarose התפרקה במדיום העובר. להעביר עוברים למטה באמצעות אש מלוטש פסטר הכומר כדי למזער את הנזק.</li>
	<li>להעביר את העוברים כדי 1.5 mL צנטריפוגה צינורות באמצעות פלסטיק או אש מלוטשת pipet.</li>
	<li>להסיר מדיום העובר עם מיקרופיפטה. להשאיר מספיק נוזל רק כדי לכסות את העוברים אחרי כל שינוי נוזל.</li>
	<li>הכינו 4% פאראפורמלדהיד (כיתה) בתמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) בתוך מכסה כימי. התראה: המטה הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.</li>
	<li>לתקן את העוברים ב 4% בכיוון כיתה של 1-2 h עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לחלופין, תקנו את העוברים 4 שעות עד לילה ב -4 ° c.</li>
	<li>כביסה שלוש פעמים ב-1x PBS + 1% טריטון-X (PBTriton) עבור 5 דקות.</li>
	<li>השתמשו בעוברים באופן מיידי או היאחסנו ב -4 ° c עד שבוע אחד.</li>
	<li>עבור אחסון לטווח ארוך, המייבשים את העוברים ב 100% מתנול (MeOH) 2 h או לילה ב-20 ° c. לאחסן את העוברים ב-20 ° c ב-MeOH במשך כמה חודשים. התראה: MeOH הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.</li>
</ol>2. הכנה לעובר
<ol><li>מימה מחדש את העוברים באמצעות incubations סדרתי בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>דגירה ב 75% MeOH/25% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.</li>
		<li>דגירה ב 50% MeOH/50% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.</li>
		<li>מודקון ב 25% MeOH/75% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.</li>
		<li>דגירה ב 100% PBTriton עבור 5 דקות, נדנדה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אופציונלי הכנת מעבד טרי מפרוטאינאז K פתרון עבודה (10 μg/mL ב PBTriton) על הקרח על ידי הוספת 10 μL של מלאי המופרש החדש של מניות פרוטטינואז K (10 מ"ג/mL).<ol>
<li>החדירות העוברים על ידי לעכל עד 30 דקות ב פרוטטינואז K. הערה: העיתוי המוצע הוא < 24 hpf: ללא עיכול; 24 hpf: 15 דקות העיכול; ובגיל 7 ימים: 30 דקות של עיכול.</li>
		<li>לשטוף עוברים החדירות ב PBTriton ו-לתקן מחדש ב 4% הכיור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>רוחצים את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הנוגדן העיקרי דגירה
<ol><li>בחר פתרון חסימה מסחרית או סרום התואם את המינים מארח הנוגדן המשני (ex. 10% סרום עז ב PBTriton) עם או בלי 2 מ"ג/mL סרום הפרה אלבומין (BSA).</li>
	<li>לחסום את העוברים בפתרון חסימת עבור 1-3 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° צ' בעת הנדנדה.</li>
	<li>דגירה של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום ב PBTriton לילה ב 4 ° צ' בעת נדנדה. בניסוי זה, הנוגדנים העיקריים ששימשו היו anti-NMDAR1, קולטן אנטי פאן-אמפא, ו anti-פוספהו-Histone H3, כל אחד מדולל לריכוז הסופי של 1:500 ב 1% סרום עז ב PBTriton.</li>
	<li>כביסה חמש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.</li>
</ol>4. הדגירה הנוגדן המשני
<ol><li>בחר נוגדן משני המבוסס על המינים המארחים של הנוגדן העיקרי ואת אורך הגל הרצוי.</li>
	<li>דגירה של נוגדן משני מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום עבור 2 h בטמפרטורת החדר (או לילה ב 4 ° c) בזמן נדנדה. הערה: נוגדנים משניים בפלורסנט רגישים לאור. השתמשנו 1:500 עז נגד עכבר Alexa488 מדולל ב 1% סרום עז ב PBTriton.</li>
	<li>לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום או לכסות עם תיבת חסימת אור עבור זה ואת כל הצעדים הבאים.</li>
	<li>שטוף שלוש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.</li>
	<li>העבר את העוברים לתמיסת גליצרול של 50% ב-PBS על מיטה של 2% agarose במדיום העובר והמשך לתיעוד או המשך לשלבי עיבוד נוספים להלן.</li>
</ol>שלבים אופציונליים
5. הלבנת
<ol><li>הכנת פתרון אקונומיקה בצינור 1.5 mL על ידי הוספת 810.7 μL של ddH2O, 89.3 μl של 2 M KOH, ו 100 μl של 30% H2O2.</li>
	<li>היפוך הצינור שלוש פעמים כדי לערבב.</li>
	<li>פיפטה 1 מ ל של כיוון פתרון אקונומיקה לעוברים.</li>
	<li>פתח את מכסה צינור העובר כדי לאפשר גז להימלט. הקש בעדינות על השפופרת על הספסל כדי להוציא בועות.</li>
	<li>נטר את תהליך הלבנת (להשתמש במיקרוסקופ אם יש צורך) ולהפסיק את התגובה כאשר הפיגמנט הוא הוסר מספיק (כ 5 דקות עבור 24 hpf או 10 דקות עבור 72 hpf).</li>
	<li>הסר בזהירות את הפתרון הלבנת עם מיקרופיפטה ושטוף עוברים שלוש פעמים ב 1 מ ל של PBTriton. הערה: עוברים נדבקים בשלב זה.</li>
	<li>המשך לתיעוד או להמשך עיבוד שלבים להלן.</li>
</ol>6. ניתוח העובר ודילקינג
<ol><li>כדי להסיר את החלמון, להעביר כמות קטנה (~ 200 μL או מספיק כדי לכסות לחלוטין את העובר אך מגביל מספיק כדי להגביל את המקום שבו הוא יכול לצוף) של 1x PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית פשוטה.</li>
	<li>השתמש באמצעות העברת פלסטיק העברה לנוע 1 או יותר עוברים ל-droplet של PBS.</li>
	<li>השתמש מלקחיים אולטרה דק ו-100 פינים חרק לשבור את החלמון בעדינות מאוד בגרגרים החלמון של משטח המים של העובר (ראה גם צ'נג et al., 2014)18.</li>
	<li>להסיר גרגרי חלמון ולחדש את PBS לפי הצורך.</li>
	<li>חזור על הפעולה עד שעובר יהיה נקי מספיק מחלמון.</li>
</ol>7. הרכבה שטוחה בשקופיות
<ol><li>העבר עוברים להחליק על שקופית זכוכית טעונה עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה 1 mL עם קצה חתוך (כדי להפחית את הלחץ ההטיה). אוריינט כרצונך עם טיפ מיקרופיפטה ב200 μL או סיכת חרק.</li>
	<li>וויק התרחק מעודפי PBS עם מגבת של קים או נייר.</li>
	<li>הוסף 2-3 טיפות של מדיה הרכבה לשקופית ו coverslip.</li>
	<li>האוויר יבש במשך כ 5 עד 10 דקות.</li>
	<li>אטום את הזכוכית המכסה על השקופית עם לק ברור. הערה: הקצוות של זכוכית העטיפה חייבים להיות מכוסים לחלוטין בשכבה דקה ורציפה של לק ציפורניים.</li>
	<li>אפשר לייבש כ 10 דקות לפני הדמיה.</li>
</ol>8. הרכבה באגקם
<ol><li>להכין 1% agarose במדיום העובר על ידי הוספת 0.5 g של agarose כדי 50 mL של בינוני העובר בבקבוקון בטוח במיקרוגל או בגביע של לפחות 3x נפח גדול יותר מאשר הרצוי.</li>
	<li>חום במיקרוגל, מתערבל כל 30, עד שעלה התפרקה לחלוטין.</li>
	<li>לעשות 1 mL משבצינורות צנטריפוגה 1.5 mL. מאחסנים את הליטים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כיסוי שפופרת עם מנעולי כובעים לפני החימום.</li>
	<li>מניחים מנורות במחזיק צינור צף בתוך מיכל חצי מלא מים.</li>
	<li>מיקרוגל את הגביע עם צינורות צף עבור 2-3 דקות, או עד agarose הוא נמס לחלוטין.</li>
	<li>העבר עובר לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה מ200 μL עם קצה חתוך (כדי להקטין את מתח ההטיה).</li>
	<li>מיקום העובר על שמיכות מלבני באמצעות סיכות חרק ולהוסיף כ 20 μL נמס מומסת ישירות העובר.</li>
	<li>במהירות המזרח את אזור הריבית הקרובה ביותר שמיכות באמצעות 100 פינים חרק. הערה: זהו הר הפוך.</li>
	<li>החזר את הצינור האגקם אל צינור המים החמים הצף בין כל שימוש למיקרוגל לפי הצורך.</li>
	<li>תמונה באמצעות מיקרוסקופ כאשר הצמח מתקשה. שמרו על העובר הטעון הפוך לשימוש במיקרוסקופ הפוך. להעיף את הכיסויים מעל (כך agarose היא תחת coverslip) לשימוש על מיקרוסקופים ישרים.</li>
</ol>9. הרכבה על שקופיות מגושרים
<ol><li>כדי להפוך שקופיות גישור, הדבק כיסוי מרובע לשקופית זכוכית באמצעות נקודה קטנה של דבק-על. הערה: צריך להיות שוקת לפחות 5 מ"מ רוחב בין הכיסויים. שני #1 coverslips גבוהה בדרך כלל מתאים 24-48 hpf עוברים בעוד שלושה שמיכות גבוהה יכול להיות הכרחי עבור 72 hpf.</li>
	<li>העבר 1-2 להעביר עוברים לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או 200 μL מיקרופיפטה עם קצה חתוך (כדי להפחית את לחץ ההטיה).</li>
	<li>הפתיל נוזל עודף עם מגבונים קים או נייר מגבת.</li>
	<li>הוסף טיפה של ≥ 80% גליצרול ישירות לעובר.</li>
	<li>מכסים עם זכוכית עטיפה מלבנית. ה-droplet של גליצרול צריך לגעת בזכוכית המכסה.</li>
	<li>להוסיף גליצרול יותר לחלל בין זכוכית המכסה להחליק לפי הצורך כדי לכסות לחלוטין את העובר עם שוליים של גליצרול בצידי העובר.</li>
	<li>החלק את זכוכית העטיפה המלבנית בעדינות כדי לגלגל את העובר למצב הדמיה.</li>
</ol>10. מכתים כתמים
הערה: סעיף זה מתחיל לאחר שלב 4.2 לעיל ומחליף את שאר שלב 4.
<ol><li>מודאת העוברים בפתרון חסימה עם נוגדן משני peroxidase מעלה עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c בעת נדנדה.</li>
	<li>שטוף שלוש פעמים בPBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את העוברים לצלחת תרבות או דיכאון שקופית עם פיפטה העברה.</li>
	<li>מערבבים 50 μL של 1% בקלות (3, 3 '-diaminobenzidine) מומס2O ו 50 μl של 0.3% חמצן מימן ולהביא 1 מ ל עם PBS. התראה: הנגיעה היא חומר מסוכן. לבשו כפפות והיפטרו מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.</li>
	<li>לכסות את העוברים HRP עם הפתרון מוכן לעיל ולפקח על פיתוח צבע (בדרך כלל 1-5 דקות) תחת מיקרוסקופ.</li>
	<li>לאחר שהגיע לרמה הרצויה של פיתוח צבע, לשטוף את העוברים לזמן קצר ב-PBS.</li>
	<li>להעביר את העוברים חזרה לצינור 1.5 mL לפני קיבעון.</li>
	<li>לתקן מחדש את העוברים עבור 15-20 דקות ב 4% בכיוון הכיור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>רחץ את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות.</li>
	<li>. המשך לתיעוד</li>
</ol>11. פרוטוקול משתנה עבור כתמים רקמה מנות שנטענה בשקופיות
<ol><li>להקיף רקמות להיות מוכתם בעט פאפ.</li>
	<li>העבר את השקופיות לתא לח.</li>
	<li>. הוסף 1 מ ל של Pbs ישירות לשקופית</li>
	<li>דגירה 7 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר הטבעה בינונית.</li>
	<li>שופכים את PBS על ידי היפוך שקופית.</li>
	<li>מימה 1 דקות עד 1 מ ל של מאגר TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 מ"מ הנאל, 0.1% Tween20).</li>
	<li>חסום עד 1 מ ל של פתרון חסימה (מסחרי או 10% סרום + 2% BSA) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה לילה בנוגדן העיקרי מדולל 1% סרום או חסימת פתרון ב 4 ° c.</li>
	<li>כביסה חמש פעמים עד 1 מ ל של מאגר TNT בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה של נוגדן משני עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c. כסו את החדר בנייר כסף או השתמשו במכסה כהה.</li>
	<li>רוחצים 5 פעמים ב-TNT בטמפרטורת החדר. יוצקים את הכביסה האחרונה.</li>
	<li>הר עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית ו coverslip. בואו לשבת 5-10 דקות.</li>
	<li>לאטום את זכוכית העטיפה על השקופית באמצעות לק ברור מסמר. אפשר להתייבש לגמרי לפני ההדמיה.</li>
</ol>12. תעוד ותיעוד
<ol><li>הקלט את הפרוצדורה המלאה ואת כל הסטיות במחברת מעבדה.</li>
	<li>הקלט את הריכוז, שם, מספר קטלוג, יצרן, ומספר רב של הנוגדן העיקרי.</li>
	<li>מניחים מדגם שנטען כראוי על במת המיקרוסקופ. אתר את אזור הריבית.</li>
	<li>בחר בדוגמה בהירה יחסית. הגדר חשיפה למצלמה והרווח כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא הפחתה.</li>
	<li>השוואת עוצמת הצביעה של אותו אזור מעניין באמצעות אותן הגדרות חשיפה בעת השוואת בין עוברים ונוגדנים ניסיוניים המסומנים באמצעות נוגדן (ex. IgG) עוברים.</li>
</ol>

<ol><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li>
<li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+Hybridization%2FImmunohistochemistry+%28ISH%2FIH%29+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li>
<li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li>
<li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen%2C+cryocut+mouse+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376(2014).</li>
<li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1%2FTAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li>
<li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin%2C+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li>
<li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos%2C+but+not+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).</li>
<li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li>
<li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li>
<li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li>
<li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li>
<li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li>
<li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713(2011).</li>
</ol>

למחברים אין מידע לחשוף.

אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הביטוי הזמני-מיותר של חלבון כמעט כל עניין של אורגניזם. אימונוהיסטוכימיה משמש על מגוון רחב של רקמות ואורגניזמים מודל. פרוטוקול זה הותאם במיוחד לשימוש ב-zebrafish. אימונוהיסטוכימיה במינים שונים עשויים לדרוש קיבוע שונים וטכניקות טיפול, חסימת פתרונות בהתאם מינים ונוכחות של peroxidases אנדוגניים, וזמני דגירה בשל עובי והרכב של רקמות. Ihc ב-דג זברה כבר אינטגרלי לקידום ההבנה שלנו של סרטן24, מחלה מטבולית25, הפרעות נויר...

הדגים (danio rerio) התפתחה כמודל רב עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים מכמה סיבות כולל זמן הדור הקצר, התפתחות מהירה, ואת היכולת הגנטית לטכניקות גנטיות. כתוצאה מכך, הדגים משמשים בדרך כלל בתפוקה גבוהה של מולקולת מולקולה קטנה עבור מחקר הרעילות וגילוי הסמים. Zebrafish הם גם מודל אטרקטיבי למחקר של תהליכים התפתחותיים בהתחשב כי נקבה אחת יכולה לייצר באופן שגרתי 50-300 ביצים בכל פעם, העוברים ברורים באופן ברור לפתח באופן חיצוני המאפשר הדמיה יעילה של תהליכים התפתחותיים. עם זאת, מחקר מוקדם הסתמך בעיקר על מסכי גנטיות קדימה באמצעות N-אתיל-N-הניטרוסוראה (אנו) או אחרים מוטגנים בשל אתגרים בהקמת טכניקות גנטיות הפוכה. בערך לפני שני עשורים, שורגוולנוס. השתמשו לראשונה ב-"דג" כדי להוריד גנים ממוקדים1 מורגוולנוס הם מיעוט אנטי-היגיון קטן, העכב את התרגום של mRNA המטרה לאחר ההזרקה לעובר בשלב התפתחותי מוקדם. החולשה העיקרית של מורגוולנוס היא שהם מדולל כמו תאים הפער בדרך כלל לאבד את היעילות על ידי 72 שעות לאחר הפריה (hpf). בעוד מורגוולנוס להישאר כלי רב עוצמה עבור דג זברה גנים שיבוש, שעתוק activator כמו אפקטור נוקלאוסיס (talens), אבץ-האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), ו מקובצים באופן קבוע במרווחים קבועים palin,הגנוםהקצר (crisprs) הם יותר לאחרונה בשימוש ישירות המטרה הגנטית zebra אלה אסטרטגיות גנטיות הפוכה, בשילוב עם גנטיקה קדימה מסכי תפוקה גבוהה, הקימו את דג זברה כמודל רב עוצמה כדי ללמוד ביטוי גנים ותפקוד.
היכולת ללמוד את פונקציית הגנים דורשת בדרך כלל הערכה של התפלגות הזמן הזמני של גנים או ביטוי מוצר גנטי. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר כדי להמחיש דפוסי ביטוי כאלה במהלך ההתפתחות המוקדמת נמצאים היברידיזציה באתרו (ISH) ואת כל הר אימונוהיסטוכימיה (IHC). באתר היברידיזציה פותחה לראשונה בשנת 1969 ומסתמך על השימוש בבדיקות אנטי-RNA המותווית נגד היגיון כדי לזהות ביטוי mRNA באורגניזם4. לעומת זאת, נוגדנים המסומנים בתווית משמשים ב אימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את הביטוי חלבון. הרעיון של תיוג חלבונים לאיתור תאריכיםשל שנות ה -30 ו- ihc הראשון הניסוי פורסם בשנת 1941 כאשר נוגדנים fitc התווית שימשו כדי לזהות חיידקים פתוגניים ברקמות הנגועות6. ISH ו-ihc התפתחו והשתפרו באופן משמעותי במהלך העשורים הבאים וכעת הן בשימוש שגרתי במעבדת המחקר המולקולרית והאבחוני7,8,9,10,11. בעוד שתי טכניקות יש יתרונות וחסרונות, IHC מציע מספר יתרונות על ISH. למעשה, IHC הוא הרבה פחות זמן רב מאשר ISH והוא בדרך כלל פחות יקר בהתאם לעלות של הנוגדן העיקרי. בנוסף, ביטוי mRNA אינו תמיד ממדד אמין של חלבון ביטוי כפי שהוא הוכח עכברים ואנשים שרק על שליש של וריאציה שפע של חלבון ניתן להסביר על ידי mRNA שפע12. מסיבה זו, IHC היא תוספת חשובה לאישור נתוני ISH, כאשר הדבר אפשרי. לבסוף, ihc יכולים לספק נתוני התאמה לשפות משנה ולוקליזציה משותפים שאינם ניתנים לקביעה על-ידי ISH13,14,15. כאן, אנו מתארים שיטה צעד אחר צעד כדי לזהות באופן מהימן חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה בכל העוברים הר דג זברה וזחלים. המטרה של טכניקה זו היא לקבוע את הביטוי המרחבי והזמני של חלבון מעניין בעובר כולו. טכנולוגיה זו משתמשת אנטיגן העיקרי נוגדנים ומתויג באמצעות נוגדנים משניים מסומנים. הפרוטוקול הוא להתאמה בקלות לשימוש על מקטעים רקמה רכוב שקופיות לשימוש עם מצעים כרומוגניים במקום של זריחה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי פיתוח שריר השלד דג זברה מבטא קולטני גלוטמט ביונוספטרופי, בנוסף קולטני אצטילכולין. NMDA-type גלוטמט לקולטן תת יחידות לזיהוי על שריר האורך ב -23 hpf.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום, כבד</td><td>קירקלנד</td><td></td><td>ניתן להחליף כל מותג</td></tr><tr><td>נוגדן נגד NMDA</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-היסטון H3 (Ser10), שיבוט RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>קולטן אנטי-פאן-AMPA (GluR1-4)</td> <td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי [Ca(NO3)2]</td>צינורות צנטריפוגה <td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>, 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>סאלי הנסון</td><td></td><td>ניתן להחליף</td></tr> <tr><td>כל לק או מקשיחשקופית דיכאון (קעור)</td><td>אלקטרונים Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>מדיום עוברי, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES במים טהורים במיוחד.</td></tr><tr><td>מדיום עוברי, E2</td><td></td><td></td><td>7.5 מ"מ NaCl, 0.25 מ"מ KCl, 0.5 מ"מ MgSO<תת>4, 75 &mu; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td></tr><tr><td>מחזיק צינור צף</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטי</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica כיסויי זכוכית Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ x 18 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית 22 מ"מ x 60 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>תא לח עם מכסה</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן, 30%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge פאפ</td><td>עט וקטור מעבדות</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים, גודל 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>מסננת רשת</td><td>Oneida</td><td></td><td>ניתן להחליף כל מותג</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>מנעול מכסה מיקרו-צינור</td><td>מחקר מוצרים בינלאומיים</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>מערבל אגוזים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>פישר מדעי</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Permount הרכבה בינונית</td><td>פישר כימיקל</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (זכוכית)</td><td>פיירקס</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (פלסטיק)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-פניל 2-תיאוריאה</td><td>אקרוס אורגני</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 10x, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x עשוי ממלאי 10x מדולל ב-dH2O</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH<תת>2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>מיכל השרצה עם מכסה והכנסה</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל דבק סופר</td><td>3M סקוטש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 מ"מ טריס, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl; 0.1% טווין20; תוצרת dH2O</td></tr><tr><td>העברת</td><td>פיפטה פישר</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים אולטרה-דקים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>מים, אולטרה-טהורים/מזוקקים כפולים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לחקור ביטוי חלבונים ולוקליזציה במהלך מצבי התפתחות נורמלית ומחלות. למרות שפרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה רבים הוטלו לצורך מקטעי רקמות ורקמות, פרוטוקולים אלה דורשים לעתים קרובות שינוי ואופטימיזציה עבור אורגניזמים מודל שאינם יונקים. מערכת זברפיש משמשת יותר ויותר כמערכת מודל במחקר בסיסי, ביולוגי וטרנסלזמי לחקירת מנגנוני ההתפתחות המולקולריים, הגנטיים והסלולאריים של התהליכים ההתפתחותיים. Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמערכת מודל, אבל גם דורשים טכניקות שונות עבור זיהוי חלבון אופטימלי. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לגבי. פרוטוקול זה מתאר בנוסף כמה אסטרטגיות הרכבה שונות שניתן ליישם וסקירה של היתרונות והחסרונות שכל האסטרטגיה מספקת. כמו כן, אנו מתארים שינויים בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי של מצעים כרומוגניים ברקמות הר שלמות וזיהוי של קרינה ברקמת זחל מנות. פרוטוקול זה חל באופן כללי על חקר שלבים ומבנים עובריים רבים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה משתמש בנוגדנים כדי לזהות את התבנית המרחבית של ביטוי החלבון בבעל החיים שלמים. זרימת העבודה הבסיסית של אימונוהיסטוכימיה (מתוארת באיור 1) כרוכה הרבייה דגים, העלאת והכנת העוברים, חסימת אנטיגנים שאינם ספציפיים, באמצעות נוגדנים העיקרי אנטיגן מסוים כדי למקד את החלבון של עניין, מזהה את הנוגדן העיקרי עם נוגדן משני מתויג, הרכבה הדגימה, ותיעוד הביטוי.
כל הר אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב ער...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

אימונוהיסטוכימיה שלמה היא טכניקה מהירה ופשוטה יחסית המאפשרת התבוננות מרחבית וזמן של חלבונים ישירות ברקמה או באורגניזם באמצעות נוגדנים מסומנים. התועלת של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הכתמה של רקמה שלמה או אורגניזם מבלי לאורך החלק הראשון שלה מיקרוסקופ קונפוקל יכול לשמש כדי ליצור ייצוג תלת מימדי של דפוס ביטוי החלבון. אימונוהיסטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי להבין את האטיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המחלה.זהו גם כלי אבחון רב ערך לזיהוי גידולים בדגימות פתולוגיות. כדי להתחיל, להכין מיכלי השרצת מלא מי מערכת עם רשת או אניה מחוררת במקום. מניחים זוגות סקס מעורבים של דגי זברה בוגרים בקבוצות בטנקים בן לילה.השתמש במחזור אור/כהה של 14 שעות/10 שעות עם אורות דולקים בשעה 9 בבוקר.m. למחרת בבוקר, עם האורות דולקים, לשנות את מי מיכל השרץ עם מים במערכת טרייה כדי להסיר צואה. ברגע שהביצים מונחות, החזירו את המבוגרים למיכלים ביתיים.לאסוף את הביצים על ידי ציור אותם באמצעות פיפטה העברה. מעבירים 50 ביצים לכל צלחת פטרי המלאה באמצע הדרך במדיום העובר. הסר את כל הביצים אטומות ומעונן כי הם מתים או לא הצליחו לחלק.דגירה צלחת של ביצים ב 28.5 מעלות צלזיוס עד 23 שעות לאחר ההפריה. אם העוברים מבוגרים מ -24 שעות לאחר ההפריה, עם פיפטה להעביר את העוברים ל 200 PTU מיקרומולרי במדיום העובר כדי למנוע מלנוגנזה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, dechorionate העוברים unhatched באמצעות מדחפי קצה דקים במיוחד.שימוש בפיפטות פסטר מלוטשות באש כדי למזער את הנזק, מעבירים אותן לצלחות פטרי מזכוכית או מפלסטיק מצופות 1-2% אגוזה מומסת במדיום העובר. לאחר מכן להעביר את העוברים 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות פלסטיק או פיפטה מלוטש אש. הסר מדיום עובר עם מיקרופיגט.השאירו רק מספיק נוזלים רק כדי לכסות את העוברים. תקן את העוברים ב 4% PFA במשך שעה עד שעתיים עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב 1X PBS ו 1% PBTriton במשך חמש דקות.יש להשתמש בעוברים באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחסון ארוך טווח, התייבשו ואחסנו את העוברים ב-100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי rehydrate העוברים, לבצע דגירה סדרתית חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר עם כמויות יורדות של מתנול PBS ו PBTriton לשטוף הסופי.המשך עם הכנת העובר על פי כתב היד. בחר פתרון חסימה התואם את המין המארח של הנוגדנים המשניים, לדוגמה 10% סרום עיזים ב- PBTriton עם או בלי שני מיליגרם למיליליטר של BSA. מוסיפים 0.5 מיליליטר של פתרון החסימה בצינור המכיל את העובר ומ מניחים את הצינור על נדנדה במשך שעה עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר.ואז להדק את העובר בנוגדן העיקרי מדולל בתתבר חסימה PBTriton לילה בארבע מעלות צלזיוס תוך נדנדה. בבוקר, לשטוף את העובר חמש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר תוך נדנדה. לאחר מכן בחרו נוגדן משני המבוסס על המין המארח של הנוגדן העיקרי ואורך הגל הרצוי ב-488 ננומטר.מוסיפים את הנוגדן המשני מדולל בתסימת חסימה לתוך הצינור המכיל את העובר. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום ודגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנדה. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בעוד מכוסה רדיד אלומיניום ונדנדה.עם פיפטה, מעבירים את העוברים לתסכולת 50%גליצרול ב- PBS מעל מיטה של 2% agarose במדיום העובר. כדי להסיר את החלמון, להעביר 200 microliters של 1X PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית רגילה. השתמש פיפטה העברת פלסטיק להעביר עובר אחד או יותר טיפת PBS.השתמש מלקחיים דקים במיוחד כפול אפס סיכות חרקים כדי לשבור את החלמון בעדינות רבה לגרד גרגירי חלמון מפני השטח הגחוני של העובר. הסר את גרגירי החלמון וחדש עם PBS לפי הצורך. לאחר ההרכבה, מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ.אתר את אזור העניין על-ידי בחירת דוגמה בהירה יחסית. כוונן את החשיפה למצלמה והשיג כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא רוויה. כאשר משווים בין העוברים הניסיוניים המסווים בנוגדנים לבין עוברי נוגדני בקרה, השתמש באותן הגדרות חשיפה.פרוטוקול זה של אימונוהיסטוכימיה של הר שלם הוא כלי רב ערך לחקר ביטוי חלבון מרחבי וזקתי באמצעות פיתוח זברה-דג. תת-אחת GluN1 של קולטן גלוטמט מסוג NMDA חשפה ביטוי של תת-יוניטים קולטן גלוטמט לאורך פיתוח שרירי הזברה ב 23 שעות לאחר ההפריה. חלקים קפואים של עוברי הפריה 72 שעות לאחר ההפריה הורכבו על מגלשות ו immunostained עבור פוספו-H3, סמן של תאים מתרבים.מספר תאים הביעו פוספו-H3 והביטוי היה הבולט ביותר באזורי החדר. נוגדן בקרת IgG של עכברים והדרת נוגדנים ראשוניים חשפו רמה נמוכה של ביטוי לא ספציפי. חשוב לבחור פתרונות חסימה מתאימים ונוגדנים משניים המבוססים על הנוגדנים העיקריים המארחים מינים כדי להבטיח זיהוי ולמזער כתמים לא ספציפיים.יש לאמת את האימונוהיסטוכימיה כדי להבטיח שהאות שנצפה הוא למעשה החלבון המעניין. ניסויי מעקב כרוכים בדרך כלל בשימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית או סביבתית. אימונוהיסטוכימיה מעניקה לחוקרים את היכולת להתבונן בחלבונים במקום, ומאיצה מאוד את הבנתנו במערכות רבות בביולוגיה בסיסית ויישמת במיוחד במהלך התפתחות העוברים.מתנול ופורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם בזהירות. יש לאסוף פסולת ולהיפטר מהן בהתאם לנהלים המוסדיים.

whole-mount-immunohistochemistry-in-zebrafish-embryos-and-larvae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

למדו טכניקת אימונוהיסטוכימיה בהרכבתם המלאה לזיהוי חלבונים בעוברים וזחלים של זברה דניו. שיטה זו מאפשרת תצפית במרחב ובזמן של ביטוי חלבונים ברקמות שלמות ללא צורך בחיתוך.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

גלה סרטונים נוספים