יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית

שיטה זו מאפשרת להאיר את האקולוגיה וההתנהגות המיקרוסקפלית של מיקרואורגניזמים המנווטים מעברי צבע כימיים דינמיים ולחשוף את העסקאות החבויות שלהם, קינטיקה מזינה ודינמיקת אוכלוסייה במיקרו-וירוסים רלוונטיים מבחינה אקולוגית. על ידי שילוב של טכנולוגיה מיקרופלואידית עם פוטוליזה, אנו מייצרים פולסים כימיים מבוקרים, שבהם כימואטרטנט מקומי הופך פתאום זמין במיקרו-קנה מידה, כדי למדוד את התגובה הכימותרפית של אוכלוסיות מיקרוביאליות שנחשפו לראשונה לשיפוע כימי לא יציב. עצב את הערוץ באמצעות תוכנת CAD והדפס אותו על סרט שקיפות כדי ליצור את מסכת הצילום.

לפברק את המאסטר על ידי ליטוגרפיה רכה בחדר נקי, על פי כתב היד. הכן תערובת PDMS על ידי שילוב האלסטומר עם סוכן הריפוי שלו ביחס של 10 ל-1 במזווה של 40 מיליליטר. עם סכין פלסטיק, מערבבים במרץ עד שהנוזל הומוגני.

מיד degas את תערובת PDMS בתא ואקום במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לזרז את התהליך, שחרר מעת לעת את הוואקום כדי לפוצץ את הבועות שנוצרות בממשק. הסר אבק מפני השטח של המאסטר עם מנקה בלחץ.

ואז לשפוך את תערובת PDMS degassed על המאסטר, ואופים אותו בתנור ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. חותכים את PDMS עם להב סביב microstructures במרחק של כחמישה מילימטרים, ולאחר מכן בזהירות לקלף את PDMS מן המאסטר. חורי ניקוב שישמשו כמכלאה ושקע של המיקרו-ערוצים.

לאטום את microchannel עם סרט דבק כדי למנוע הצטברות של אבק. תכנן את הצורה תלת-ממד באמצעות תוכנת עיצוב תלת-ממד והדפס את תבנית המאסטר לתבנית PDMS באמצעות מדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה. לאחר הכנת ו degassing את תערובת PDMS כפי שנעשה בעבר, לנקות את פני השטח של המאסטר על ידי dabbing עם סרט דבק.

שים את המאסטר על סולם. לאחר מכן, תוך הימנעות מהאזור המרכזי של המאסטר, יוצקים 23.4 גרם של תערובת PDMS לא מאובטחת על מנת להשיג את הגובה הרצוי של PDMS על ידי התאמת הגובה של המאסטר ב 0.5 מילימטרים. הסר את כל הבועות הנותרות בעזרת אוויר דחוס.

מניחים את יצוקה PDMS על המאסטר בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לאפות לפחות 12 שעות. לאחר מכן, לקלף בעדינות את שכבת PDMS מוקשה, אגרוף פנימה חורים שקע להזרקה של ההשעיה חיידקי. הפעל הן את פני השטח של צלחת פטרי ואת עובש PDMS עם פלזמת חמצן במשך שתי דקות.

מלגים את תבנית PDMS על צלחת פטרי על ידי לחיצה עדין על התבנית לצלחת פטרי. הימנע מלחיצה על המיקום של התכונות. מניחים את צלחת פטרי מלוכדים לתבנית PDMS 3D בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לפחות 12 שעות כדי לחזק את הקשר הכימי.

לאחר מכן, הפעל את קרום הפוליקרבונט הננו-קרום בתא פלזמה חמצן למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. תחת מכסה המנוע הכימי, לדלל פתרון מסחרי של 3-aminopropyltriethoxysilane במים deionized ל 1% על ידי נפח באמצעות צינור פוליפרופילן. מעבירים את תווי ה-3 אמינו-אמינו-פרופילטריתוקסילין המדוללים בצלחת פטרי, ומטבולים את הממברנה הפעילה בתווית 3-aminopropyltriethoxysilane למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הסירו את הממברנה מתווי 3-aminopropyltriethoxysilane עם פינצטה, וה מניחים אותה על מגבון חדר נקי לייבוש. לייצור הערוצים המיקרופלואידיים PDMS שישקרו על הממברנה ויאפשרו שטיפת זירת החיידקים, חזרו על ייצור המכשיר המיקרופלואידי לניסוי הדופק הכימי היחיד כפי שנעשה בעבר. כדי לקשר את ערוצי הכביסה PDMS לממברנה הפונקציונלית, הפעל תחילה הן את ערוץ הכביסה PDMS והן את קרום הפוליקרבונט עם תא פלזמה חמצן במשך שתי דקות.

מיד לאחר הטיפול בפלזמה, להביא את הממברנה פונקציונלית ואת ערוץ הכביסה PDMS למגע על ידי לחיצה בעדינות על ערוץ כביסה PDMS על הממברנה. חשוב ללחוץ בעדינות יחד על ה- PDMS והממברנה, או שהקרום עשוי להיות מלוכד באופן בלתי הפיך לתקרה של מיקרו-ערוצי PDMS בגובה 200 מיקרומטר. לאחר מכן, הפעל הן את קרום הפוליקרבונט של ערוץ הכביסה מלוכד PDMS והן את תבנית ה- PDMS תלת-מימדית שהוקשרה בעבר לצלחת פטרי על-ידי הכנסתם לתא פלזמה של חמצן למשך שתי דקות.

כריך את הממברנה בין שתי שכבות PDMS, ולחץ יחד. מניחים את צלחת פטרי מלוכדת למבנה הכריך בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לפחות 12 שעות כדי לחזק את הקשר הכימי. כדי להתחיל, לשמור על התא המיליפלואידי תחת ואקום במשך 20 דקות.

לאחר מכן, מניחים את צלחת פטרי המכילה את התא המיליפלואידי על שלב מיקרוסקופ. עם פיפטה, למלא את התא מתחת לממברנה עם ההשעיה חיידקית מדוללת של GFP-פלואורסצנטי Vibrio ordalii ב מילימולר אחד 4-methoxy-7-nitroindolinyl-כלוב-L-גלוטמט פתרון במי ים מלאכותיים. לאחר מילוי הערוץ עם ההשעיה החיידקית, למצוץ את הפתרון עודף עם מגבת נייר, ולאטום את inlet ושקע עם תקעים PDMS על ידי לחיצה בעדינות אותם לתוך החורים.

מלאו מזרק בתתווית מי ים מלאכותית של 4-methoxy-7-7-nitroindolinyl-כלוב-L-גלוטמט מלאכותי, והצמידו צינורות להיכנס ולשקע של תעלת הכביסה שמעל הממברנה. חבר את הצינורות למאגר פסולת, וודא שהצנרת שקועה לחלוטין במאגר פסולת הנוזלים כדי למנוע תנודות לחץ. הגדר את קצב הזרימה במשאבת המזרק ל-50 מיקרוליטר לדקה.

התחל את משאבת המזרק כדי להקים את הזרימה בערוץ הכביסה מעל הממברנה. הפעל את התוכנה השולטת בקרן ה- LED ובבן המיקרוסקופ, וליצור רצפים מוגדרים על-ידי המשתמש של פולסים במקומות שונים ועם עוצמות שונות. הקלט וידאו באמצעות מטרה 4x במרווחי זמן קבועים על פני תקופה של מספר שעות ועל פני מיקומים רציפים מרובים כדי לכסות משטח גדול.

במחקר זה, המכשירים microfluidic ו millifluidic שימשו לחקר תגובה chemotactic חיידקי פרופילי הצטברות בתנאים תזונתיים דינמיים. תחזיות אינטנסיביות מקסימלית מראות את המיקום החיידקי, המצוין על ידי עקבות לבנים, על פני מרווח של 0.5 שניות מיד לאחר שחרור הדופק ו -40 שניות לאחר שחרור הדופק. מסלולי החיידקים הוצגו גם בשחור 60 שניות לאחר שחרור הדופק.

האזור המוצל מייצג את הדופק הכימי ששוחרר על ידי פוטוליזה בזמן אפס שני באמצע שדה המבט, אשר לאחר מכן התהפך. ריכוז החיידקים, כמו גם הדינמיקה הזמנית של מהירות הסחף הרדיאלי בעקבות שחרור הדופק במרכז שדה המבט מוצגים כאן. ערכים שליליים של מהירות הסחף תואמים לתנועה כימוטקטית מכוונת לכיוון מרכז הדופק.

סטטיסטיקות שחייה מוצגות כאן עבור אוכלוסייה חיידקית בהיעדר שיפוע כימי. המסלולים מייצגים את התחזיות הדו-ממדיות של תנועת החיידקים התלת מימדית במיקרו-ערוצים. התפלגות ההסתברות של מהירות שחייה חיידקית נמדדת התאימה להתפלגות גמא.

ממסלולי החיידקים, התפלגות ההסתברות של הזמן בין התמצאות חוזרות רצופות הוצאה. דפוס ההתמצאות מחדש, התפלגות מהירות השחייה וסטטיסטיקות ההתמצאות מחדש של האורגניזמים שימשו כדי ליידע מודל מבוסס אינדיבידואלי. שיטה זו נבדקה על החיידקים הימיים Vibrio ordalii המבצעים צ'מוטקסיס כלפי חומצת האמינו גלוטמט, אך המתודולוגיה המוצעת ישימה באופן נרחב לשילוב שונה של מינים וכימותרפים, כמו גם לתהליכים ביולוגיים מעבר לצ'מוטקסיס, כגון דינמיקה של אוכלוסייה וקהילתית בתנאים הטרוגניים ודינמיים מרחביים.

טכניקות קלאסיות באקולוגיה מיקרוביאלית ומיקרוביולוגיה, כגון גידולים בתרביות אצווה או כימוסטטים, התעלמו במידה רבה מהמאפיינים המרחביים-זמניים של בתי גידול מיקרוביאליים. היצירה הכמעט מיידית של פולסים כימיים במיקרו-גוונים על ידי פוטוליזה שואפת לשחזר את סוג הפולסים התזונתיים שחיידקים ימיים נתקלים בטבע ממגוון מקורות, למשל, התפשטות מפוזרת של נוצות מאחורי חלקיקים אורגניים טובעים או החומרים המזינים המתפשטים מתאי פיטופלנקטון lysed. פתרון aminosilane הוא רעיל בחריפות ויש לטפל בו בזהירות רבה.

אנחנו עובדים באופן בלעדי מתחת למכסה המנוע של האדים ולובשות ציוד מגן כמו חלוק מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות. אנחנו גם דואגים לפסולת שיצרנו.