מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מתאר מודל לזיהום פצע כרוני Pseudomonas aeruginosa ללא צורך בהשתלת חומר זר או דיכוי חיסוני. חיסון מאוחר עם Pseudomonas aeruginosa 24 שעות לאחר עובי מלא פצע exstalls prostalls סיווג מהיר והפצה של החיידקים, הקמת זיהום שנמשך שבעה עד 10 ימים. מודל ייחודי זה יהיה כלי שימושי לחקירות של פתוגנזה חיידקית, אינטראקציות פתוגן מארח, ופיתוח של טיפולים חדשים עבור זיהומים כרוניים פצע Pseudomonas aeruginosa.

לסייע לי בהדגמה של ההליך יהיה דן ליו, סטודנט לרפואה מהמעבדה בוליקי. לפני תחילת ההליך, לשקול עכבר הרדמה בן שמונה עד 12 שבועות כדי לקבל משקל בסיסי ולמקם את העכבר במצב נוטה. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, להזריק תת עורית את העכבר עם 250 microliters של 0.9% נתרן כלורי מחומם מראש על כל אגף.

השתמש מכונת גילוח חשמלית כדי להסיר את השיער מהאזור הגבי של העכבר ולהחיל שכבה דקה של קרם depilatory על העור החשוף. לאחר 20 עד 60 שניות, להסיר את השיער קרם עודף עם גזה לחה במים חמים. עבור ניתוח פצע כריתה בעובי מלא, תחילה להשתמש במחט מד 25 להזריק תת עורית 0.6 כדי מיליגרם אחד לקילוגרם של buprenorphine שחרור מתמשך באזור אמצע הגב של העכבר ולנגב את האתר הכירורגי באופן מעגלי עם שלושה באטדין סטרילי חלופי ספוגיות אלכוהול.

מניחים וילון ניילון נצמד על האתר הכירורגי ומותוחים את העור בצורה מתוחה. כאשר העור התייבש, השתמש בניקוב ביופסיה סטרילי בקוטר שישה מילימטרים כדי לבצע חתך ראשוני דרך האפידרמיס הגבי השמאלי, ואחריו חתך שני על האפידרמיס הגבי הימני. השתמש מלקחים כדי לאוהל את העור ממרכז אזור הפצע השמאלי קווי המתאר ולהשתמש מספריים כדי excise את השכבות האפידרמיס והדרמלי.

לאחר חזרה על החתך באזור הפצע הימני המתואר כדי ליצור פצעי כריתה סימטריים, לשטוף את שני הפצעים עם 50 microliters של מלוחים סטריליים. כאשר האתר הכירורגי והעור שמסביב התייבשו, מכסים את הפצעים ואת הגב עם רוטב סרט שקוף ומ מניחים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום עם ניטור עד שליטה מלאה. 24 שעות לאחר הניתוח, לשקול את העכבר הרדמה מחדש שוב להזריק את החיה תת עורית עם 250 microliters של 0.9% נתרן כלורי מחומם מראש בשני האגפים.

לאחר מכן, לטעון 100 microliters של המתלה זן P.aeruginosa זוהר לתוך מזרק כובע בטיחות שחפת 500 מיקרוליטר מצויד מחט מד 27 ולהזריק 40 microliters של השעיית חיידקים דרך הסרט השקוף להתלבש לתוך כל פצע. ודא כי ההשעיה החיידקית מעורבת היטב כי ההלבשה השקופה היא שלמה. הקפד לנקב את ההלבשה השקופה רק פעם אחת עם הצד הלוח מחט למעלה.

לאחר מכן להחזיר את העכבר לכלוב שלה על דף חימום עם ניטור ולספק תוסף תזונה עתיר קלוריות להדביק דחוק בין כדורי מזון על הרצפה של הכלוב. צלחת inoculum הנותרים על צלחת אגר LB ולספר את המושבות כדי לאשר את מספר החיידקים שנוהלו. עבור הדמיה in vivo של הפצעים הנגועים, בצע את רמת הבטיחות הביולוגית שני פרוטוקולי בלימה להובלת העכברים אל מכשיר ההדמיה וממו ולמקם את העכבר הרדמה במצב נוטה בתוך תא ההדמיה.

בתוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה, binning, f-stop ותחום התצוגה בהתאם לניסוי. לאחר מכן, ליצור אזור של עניין באתר הפצע ולמדוד את השטף שזוהה הממוצע פוטונים לשנייה. כדי למדוד את הרקע, צור אזור מעניין על פני אזור אקראי בפלטפורמת ההדמיה והחסיר את מספר הרקע של פוטונים לשניה.

בסוף הניסוי, בארון בטיחות ביו, להשתמש מספריים סטריליים מלקחים כדי למלמל את מיטות הפצע ולמקם כל מיטה במיליליטר אחד של PBS סטרילי בצינור פוליפרופילן 1.5 מיליליטר. טחון את רקמת הפצע עם מספריים ולהדקר את חתיכות הרקמה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס ב 300 סיבובים לדקה במשך שעתיים. בסוף הדגירה, מערבולת כל צינור במשך 10 שניות לפני דילול סדרתי של הקולחים החיידקיים ב- PBS וציפוי קולחים חיידקיים מדוללים על אגר LB לכמת את הנטל החיידקי.

תמונה מייצגת זו המתקבלת באמצעות מערכת אופטית הדמיה מדגימה כי מודל זה גורם זוהר לזיהוי. בניסוי זה, הזיהום הגיע לשיאו ביום השלישי לאחר החיסון ונמשך שבעה ימים לאחר החיסון בהתבסס על ספירת הביולומינציה והמושבה. תרבות החיידקים המבודדים מהפצע מוכיחה עוד יותר כי המושבה מכומתת ויוצרת יחידות לכל פצע בקורלציה עם הנוצה שזוהתה.

למרות שיש ירידה ראשונית במשקל מהיר מיד לאחר ההזרקה, זריקות מלוחים ותזונה משלימה יכול לשחזר את העכברים למשקולות הראשוניות שלהם. מינון החיסון המחושב של אשר 50% מהפצעים יידבקו באופן משמעותי נקבע להיות כ 7.7 פעמים 10 למושבה השנייה להרכיב יחידות למיליליטר. מינונים גבוהים יותר מפעם אחת 10 למושבה הרביעית להרכיב יחידות למיליליטר לגרום שיעור זיהום 100%..

טיפולים אקטואליים מערכתיים שונים ניתן ליישם לאחר נהלי הפציעה והחיסון כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים חדשים עבור Pseudomonas aeruginosa. כל העבודה עם Pseudomonas aeruginosa ועכברים נגועים צריכה להתבצע עם אמצעי זהירות BSL-2 בהתאם להנחיות ועדת הבטיחות הביולוגית והשימוש בבעלי חיים של החוקר.