Name: מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד פרוטוקול הדבקה מושהה ליצירת זיהום כרוני בפצעים בעכברים בעלי חיסון תקין. שיטה זו מאפשרת חקר Pseudomonas aeruginosa ללא דיכוי חיסוני או שתל חומר זר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לשים-Tn5-EM7-lux-Km1 לבנות וקטור זורח היה מתנה אדיבה של J. הארדי. . השרטוטים נוצרו עם BioRender.com אנו מודים למעבדה של הג גורטנר על העצה שלהם על מודל זיהום הפצע. כמו כן, אנו מודים ל-T. דויל ממרכז סטנפורד לחדשנות ב Vivo הדמיה למומחיות הטכנית שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, ומענקים מאוניברסיטת סטנפורד ספארק, הקרן לחקר הרפואה של פלק ובסיס סיסטיק פיברוזיס (CFF) ל P.L.B. C. R. D נתמך על ידי T32AI007502. מלגת לימודים למדעים ולהנדסה באוניברסיטת לוברט סטרייר ביוגרפיה באוניברסיטת סטנפורד הנתמכת ב-J.M.S.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת סטנפורד.
1. הכנה וצמיחה של חיידקים
<ol><li>לנהל את כל העבודה עם P. aeruginosa ובעלי חיים עם אמצעי זהירות bsl-2 לכל ועדת בטיחות מוסדית של החוקר ובעלי החיים להשתמש הנחיות הוועדה. האם כל הצעדים המתוארים כאן מעורבים ב -P. aeruginosa, כולל עכבר החיסון, בארונית ביולוגית.</li>
	<li>PAO1 זורח: לוקס זן של P. aeruginosa זמין מהמעבדה שלנו על ידי בקשה. פס PAO1, המאוחסן כמו מלאי הגליצרול הקפוא, בציר ליססוגנזה (LB) אגר. עבור זורח PAO1: lux להתאמץ, LB אגר צריך להכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית (100 μg/mL carbenicillin ו 12.5 μg/mL kanamycin). גדל ב 37 ° c לילה באינקובטור חיידקי.</li>
	<li>בחר מושבה מבודדת ולצמוח לילה ב 37 ° c ב 3 מ"ל LB בינונית, pH 7.4. עבור זנים זורח, ציר צריך להכיל 100 μg/mL carbenicillin. , לגדול תחת רעידות. מצבים אירוביים</li>
</ol>2. הכנה לפרוצדורה
<ol><li>האם כל העובדים לבצע ניתוח ללבוש שמלה נקייה מעיל המעבדה, מסכת פנים, רשת שיער, וכפפות.</li>
	<li>, אוטוקלב כל כלי הניתוח. כולל מספריים ומלקחיים השתמש בטכניקה אספטי לעקר כלים בין בעלי חיים.</li>
	<li>נקו את שולחן הניתוחים באתנול והכינו שדה כירורגי נקי.</li>
</ol>3. הסרת שיער
<ol><li>שימוש בעכבר C57BL/6J בשבוע 2%-3% שבועות באמצעות 1%. החוקרים צריכים לעקוב אחר ההנחיות של המוסד שלהם וטרינרי להרדמה בעת שימוש isofלאנה.<ol>
<li>הפעל הרדמה על ידי אספקת 1% – 3% isofלפני ולהתאים את קצב זרימת החמצן ל 1.5 L/min. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה.</li>
		<li>צבוט את הבוהן של העכבר כדי להעריך את עומק ההרדמה. כאשר העכבר לא מגיב עוד לגירוי, להסיר אותו מן החדר אינדוקציה ומניחים אותו על הספסל כירורגי עם האף שלו בקונוס האף isofהלוראן.</li>
		<li>החלת חומר סיכה עינית על שתי העיניים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שקול את העכבר כדי לקבל משקל טרום ההליך הבסיסי.</li>
	<li>למקם את העכבר במצב נוטה. להזריק את העכבר תת-עורי עם מראש מחומם סטרילי 0.9% נתרן כלוריד, 250 μL בכל אגף עבור סך של 500 μL.</li>
	<li>לגלח את האזור החלק הימני של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הגילוח צריך להתרחש במקום אחר מאשר התחנה הכירורגית כדי למנוע זיהום שיער של הפצע.</li>
	<li>להחיל שכבה דקה של קרם הסרת שיער. תנו לתחליב לשבת במשך 20 עד 60. הסירו את השיער והקרם העודף עם גזה הלחלח במים חמים. בעקבות הסרת שיער, המשך אל הליך הפצועים.</li>
</ol>4. בעובי מלא ניתוח הפצע הקצר
<ol><li>הכנסת שחרור מתמשך בופרנורפין 0.6 – 1 מ"ג/ק"ג תת-עורי באמצעות מחט של 25 גרם באזור באמצע העכבר. בופרינורטין שחרור איטי מספק הקלה על הכאב מעל 48 – 72 h.</li>
	<li>. חטא את האתר הכירורגי נגב את המשטח הפנימי. עם דגימה סטרילית בבטאדין לנגב את העודף בבטאדין. עם ספוגית אלכוהול סטרילי זה צריך להתבצע 3 פעמים (לסירוגין בין הבטאדין לבין אלכוהול), שאיפה באמצעות הזזת מהמרכז בצורה מעגלית לקצה. הניחו לאזור להתייבש באוויר.</li>
	<li>צור העטוף סביב האתר כירורגי באמצעות גזה סטרילי או לעטוף פלסטיק הנצמד.</li>
	<li>מתיחה עור מתוח הזנה. שימוש סטרילי בקוטר 6-mm העור ביופסיה לעשות חתך הראשונית דרך האפידרמיס השמאלית הימנית. חזרו על האפידרמיס הימני.</li>
	<li>השתמש מלקחיים לאוהל את העור מהמרכז של אזור הפצע השמאלי המתואר. בלו את הרבדים העוריות והעורי באמצעות מספריים. חזור על האזור הימני המוקף הפצע כדי ליצור פצעים סימטריים.</li>
	<li>שטוף פצעים עם 50 μL של תמיסת מלח סטרילית. הניחו לאתר הכירורגי ולעור שמסביב להתייבש באוויר. לאחר מכן, כסו את הפצעים והדורסום בעזרת הקרנת סרטים שקופה.</li>
	<li>מניחים את העכבר חזרה בכלוב נקי. . בבית 1 חיה לכל כלוב</li>
	<li>הניחו את הכלוב על כרית החימום והצג עד שהעכבר יתעורר.</li>
	<li>בעת ביצוע הניתוח לעיל על בעלי חיים מרובים, להשתמש בעיקור חרוז חם כדי לנקות את כל כלי הניתוח בין בעלי חיים.</li>
	<li>אפשר 24 שעות על העכברים להתאושש מהליך כירורגי ולהקמת מטריצת הפצע הזמני על הפצעים לפני שתמשיך לחיסון נגד חיידקים.</li>
</ol>5. חיסונים עם פ. אירוגסק
<ol><li>לדלל לילה PAO1: לוקס התרבות כדי OD600 = 0.05 ב 75 mL של מדיה LB המכיל 100/mL carbenicillin ולגדול את החיידקים עד התרבות היא בשלב מעריכי מוקדם (OD600 ≈ 0.3). הדבר אמור להימשך כ-2-3 שעות.</li>
	<li>לדלל PAO1: lux ב PBS לריכוז של (7.5 ± 2.5) x 102 cfu/mL. הקפידו להכין את העודפים כדי להבטיח נפח מספיק ולאפשר ציפוי לאחר הניסוי. אם מעבירים בין מתקנים (כלומר מהמעבדה לוייונום), השתמשו בבלימה כפולה בתיבת הוכחה שמסומנת באופן ברור בהסגר.</li>
	<li>בצע את כל העבודה עם P. aeruginosa ועכברים באמצעות ציוד מגן אישי מאושר ברמת בטיחות ביולוגית 2 (בדרך-2) מאושר ארון בטיחות ביולוגי (תואר ראשון). ציוד הניתן לשימוש חוזר כגון סולם המשקל צריך להיות מכוסה עם להיאחז לעטוף כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>שימוש ב-3% isofלמטה כמתואר לעיל. שוקלים עכבר ולהקליט את המשקל. להזריק את העכבר תת-עורי עם מראש מחומם סטרילי 0.9% נתרן כלוריד, 250 μL בכל אגף עבור סך של 500 μL.</li>
	<li>אם ההלבשה של הסרט השקוף של העכבר הגיע לילה, להסיר את כל המפר כתוצאה בזהירות ולשים על ההלבשה החדשה.</li>
	<li>השתמש 500 μL טוברקולב 27 מזרק כובע בטיחות כדי להזריק 40 μL של PAO1: lux ההשעיה דרך הסרט השקוף ההלבשה לתוך כל פצע. עכברים שונים צריכים לשמש עבור שאינם מחוסן/הפצע הערוץ כדי למנוע זיהום צולב של הצד הקונאלצידי.</li>
	<li>מניחים את העכבר חזרה בכלוב שלו על משטח חימום לפקח עד שהוא מתעורר. כל העכברים צריכים להיות מאוחסן בנפרד בכלובים נפרדים כדי למנוע זיהום צולב.</li>
	<li>מספקים תוספי תזונה גבוהים קלוריות להדביק בין כדורי מזון על רצפת הכלוב.</li>
	<li>השתמש ביתר הצורך לרצף לוחית של LB אגר. מושבות לספור כדי לאשר את מספר החיידקים מנוהל.</li>
</ol>6. בvivo הדמיה של פצעים נגועים
<ol><li>עקבו אחר פרוטוקולי BSL-2 להובלת עכברים אל ומכלי הדימות, כולל שימוש במיכל משני. להיזהר לא להעביר או לשחרר מצעים בעלי חיים במהלך העברת העכבר לחדר אינדוקציה או מכשיר הדמיה.</li>
	<li>לגרום הרדמה של העכבר עם שאיפה 1% – 3% isofלוריאן בחדר אינדוקציה כמתואר בשלב 3.1.</li>
	<li>לאחר העכבר מורדם, למקם אותו במיקום נוטה בחדר ההדמיה של מערכת הדמיה אופטית עם האף בקונוס של האף isofהלוראן.</li>
	<li>פתח את תוכנת התוכנה.</li>
	<li>פרמטרי הרכישה ישתנו בהתאם למספר בעלי החיים המבוססים בו ובאינטנסיביות של ביולומינסנציה. הפרמטרים הבסיסיים להגדרה כוללים זמן חשיפה, ביננג, f/stop ושדה תצוגה (FOV). הגדרות ההתחלה המהווה ברירת מחדל הן בזמן החשיפה 30 שניות, בניה נמוכה (2), f/stop 1.2 ו-FOV 25. התאם הגדרות אלה לפי הצורך, בהתאם לצורכי החוקר.</li>
	<li>ניתוח נתונים באמצעות תוכנית הדמיה (ראה טבלת חומרים). לומינסנציה תהיה מיוצגת כתמונת צבע מדומה הצופה על תצלום צבע של העכברים.<ol>
<li>צור אזור של עניין (ROI) באתר הפצע ולמדוד שטף הממוצע (פוטונים/שנייה) זוהה. שים לב כי ניתן גם לדווח על נתונים כזוהר (פוטונים/שנייה/cm ²/סטרדיאן), אבל כל עוד המרחק של פלטפורמת ההדמיה מן המצלמה נשאר קבוע בין הדמיה, שטף מספיק.</li>
		<li>למדוד את הרקע על ידי יצירת ROI באזור אקראי בפלטפורמת ההדמיה. הפחת את מספר הרקע של פוטונים/שניה.</li>
		<li>יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע הדמיה כמתואר לעיל לעתים קרובות כיום כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום.</li>
</ol>7. ניהול פוסט-פעיל
<ol><li>לנטר עכברים לפי קווים מנחים שנקבעו על-ידי פרוטוקול IACUC של החוקר. אנו מפקחים על כל העכברים מדי יום במשך ארבעת הימים הראשונים, ואז כל יומיים עד סוף הניסוי. שקול את העכברים פעם ביום במשך 4 הימים הראשונים שלאחר הניתוח בתואר ראשון. הכנס 250 μL של 0.9% נתרן כלוריד תת-עורי בימים שלאחר ההדבקה 1 ו-2.</li>
	<li>בדקו סימנים של כאב/מצוקה בעכברים, כולל תנוחה מוזנחת, מעיל מוזנח, עייפות, קשיי נשימה, הפנים וירידה במשקל.</li>
	<li>אם בעלי חיים מציגים סימני בריאות מתדרדרים, התייעצו עם וטרינר. כל עכבר שנראה להראות מחמיר סימנים של כאב/מצוקה וירידה במשקל של 20% או יותר צריך להיות מורדמים.</li>
</ol>8. כריתה של הפצע
<ol><li>בסוף הניסוי, להקריב את העכברים באמצעות שאיפת CO2 , ואחריו פריקה צוואר הרחם. היפטר מגופת החיה בהתאם. לפרוטוקולים של המוסד</li>
	<li>מיטות של פציעת בלו באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים בתואר ראשון. מניחים כל מיטת הפצע ב-1 מ ל סטרילי בתוך צינור פוליפרופילן 1.5 mL. . הללו את רקמת הפצע עם מספריים יש לטפל בכל הפצעים כ-ASBL-2, גם אם אינם נחשבים לנגועים.</li>
	<li>דגירה על שייקר ב 300 סל ד עבור 2 h ב 4 ° c. . ומדלל את השפכים החיידקיים בערוץ הPBS צלחת הקולחים בקטריאלי מדולל על LB אגר כדי לספור את הנטל החיידקי.</li>
	<li>שקול פצעים נגועים אם האות זורח בפצע הוא מעל לאור הרקע חיידקים יותר מזוהים הפצע בקולחים מאשר פצעים שחוסנו עם PBS כמו שליטה.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לגלות.

פיתחנו רומן מתעכב . במודל לזיהום בפצע האסטרטגיה של עיכוב הידבקות בחיידקים עד 24 שעות לאחר פציעה מהצועית מאפשרת הערכה של דלקות פצעים במשך שבוע אחד. באמצעות זן זורח של P. aeruginosa, ניתן לעקוב אחר התקדמות הזיהום במהלך הקורס זיהום. מסלול ארוך יותר של זיהום לעומת אחרים P. aeruginosa מודלים זיהום יאפשר הזדמנויות חדשות ללמוד אינטראקציות הפתוגן המארחים וטיפולים הרומן מיקוד P. aeruginosa הפצע זיהומים. לדוגמה, כבר השתמשנו במודל זה כדי להדגים את התפקיד של בקטאוגיה Pf בעירור תגובה חיסונית אנטי <...

פסאודומונס aeruginosa (P. aeruginosa) הוא חיידק שלילי בצורת מוט עם רלוונטיות גוברת לבריאות האדם ומחלות. הוא אחראי על תחלואה נרחבת תמותה בהגדרות מחלה נוזוקומיאלית, במיוחד מעורבים דלקות פצעים בחולים חיסוני1,2. הופעתה של זנים עמידים בפני סמים מרובים של פתוגן זה סיפק תנופה נוספת לחקירת גורמים לתרום P. aeruginosa התקפה אלימה, מנגנונים של P. aeruginosa עמידות לאנטיביוטיקה, ושיטות חדשות למניעה וטיפול של זיהום זה קטלני3. ככזה, הצורך במודלים של בעלי חיים של זיהום הפצע כרונית כמו כלים לחקירת שאלות מחקר אלה מעולם לא היה גדול יותר.
למרבה הצער, דגמים רבים של בעלי חיים של P. aeruginosa זיהום נוטים לדמות זיהום אקוטי עם רזולוציה מהירה של זיהום או ירידה מהירה עקב אלח דם4,5, אשר אינה מהווה הדמיה מספקת של הטבע הכרוני לעתים קרובות של זיהומים אלה. כדי לטפל בחיסרון זה, כמה דגמים לנצל את ההשתלה של גופים זרים כגון חרוזים אגר, סיליקון שתלים, או קילוף פלסטיצידיות ג ' לים6,7,8. דגמים אחרים להשתמש בעכברים כי הם בסיכון חיסוני בשל גיל מתקדם, השמנת יתר, או סוכרת, או באמצעות אמצעים תרופתי כגון נויטרופילים המושרה הנגרמת כציקלופומיה9,10,11,12. עם זאת, או השימוש בחומרים זרים או מארחים החיסונית פרוצים כנראה משנה את התהליך הדלקתי המקומי, מה שמקשה להשיג הבנה של הפתופסולוגיה מעורב זיהומים הפצע כרונית במחשבים מארחים עם מערכות חיסונית נורמלית אחרת.
פיתחנו מודל כרוני של P. aeruginosa זיהום הפצע בעכברים הכרוכים החיסון מתעכב עם חיידקים לאחר שפצעו. החיסון העיכוב מאפשר ניסויים בהערכת נטל חיידקי הנמשך לפחות 7 ימים. מודל זה פותח הזדמנויות חדשות עבור חקירת הן פתוגנזה טיפולים חדשים של P. aeruginosa זיהומים כרוניים.

<table><tbody><tr><td>0.9% הזרקת נתרן כלורי</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם x 1 מחט סטרילית</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם x 1 1/5 מחט סטרילית</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>ספוגית אלכוהול</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Betadine Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים זכרים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה חד פעמי, 6 מ"מ</td><td>אינטגרה</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים - טונגסטן קרביד</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>מעקר יבש חרוזי זכוכית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr>אגר <td>פישר ביו-ריאגנטים</td> <td>מגורענים</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>מיליארד</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X מערכת הדמיה</td><td>מכשירים ספקטרליים הדמיה</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB פישר</td><td>ביו-ריאגנטים</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Leur-Lok 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Animal Trimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair תחליב להסרת שיער עם כנסיית שמן תינוקות</td><td>ודווייט</td><td>n/a</td><td>זמין בכל בית מרקחת</td></tr><tr><td>מלקחיים מתומן</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11041-08</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>עיתונות וחותם עטיפה נצמדת</td><td>שמחה n</td><td>/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide מזרק אינסולין עם 30 גרם מחט</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין Safetyglide, 1/2 מ"ל, 30 גרם x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>סולם</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תזונה מספק</td><td>הנרי שיין בריאות</td> <td>בעלי חיים29908</td><td></td></tr><tr><td>טגאדרם, 6 ס"מ x 7 ס"מ</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

פסאודומונס aeruginosa (P. aeruginosa) הוא פתוגן מחלה נוזוקומיאלית העיקריים של רלוונטיות הגוברת לבריאות האדם ומחלות, במיוחד בהגדרה של זיהומים הפצע כרונית חולי סוכרת ומאושפזים. יש צורך דחוף מודלים זיהום כרונית כדי לסייע בחקירת הפתוגנזה הפצע ופיתוח של טיפולים חדשים נגד פתוגן זה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שעושה שימוש בחיסון מושהה 24 שעות לאחר שפצעו מלאה במלוא הנסיבות. הזיהום של מטריצה הפצע הזמני נוכח בזמן זה מפורקים או הפצה מהירה או הפצת זיהום ובמקום זאת יוצר זיהום כרוני נמשך 7 – 10 ימים ללא צורך השרשה של חומרים זרים או הדיכוי החיסונית. פרוטוקול זה מחקה קורס זמני טיפוסי של זיהום שלאחר הניתוח בבני אדם. השימוש של הזנים P. aeruginosa מאיר (PAO1: lux) מאפשר הערכה יומית כמותית של נטל בקטריאלי עבור P. aeruginosa זיהומים הפצע. זה מודל הרומן עשוי להיות כלי שימושי בחקירת הפתוגנזה חיידקי ופיתוח של טיפולים חדשים עבור כרונית P. מחלות הפצע.

באמצעות זן זורח של PAO1 עם קידוד פלבאמצע מערכת הכתבת היוקרה (PAO1: lux), אנו ביצעו פציעה מוטעית על עכברים, חוסנו פצעים אלה עם P. aeruginosa 24 שעות מאוחר יותר, ומדד נטל חיידקי לאורך זמן (איור 1 ואיור 2). תמונה ייצוגית שהושגה באמצעות מערכת הדמיה אופטית ממחישה כי מודל זה מביא לאור לגילוי (איור 3א). הזיהום הגיעה ביום 3 לאחר החיסון והמשיך 7 ימים לאחר החיסון המבוסס על שני ביולומי...

אנו מתארים פרוטוקול חיסונים מושהה ליצירת זיהומים כרוניים הפצע בעכברים המוסמכים.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מתאר מודל לזיהום פצע כרוני Pseudomonas aeruginosa ללא צורך בהשתלת חומר זר או דיכוי חיסוני. חיסון מאוחר עם Pseudomonas aeruginosa 24 שעות לאחר עובי מלא פצע exstalls prostalls סיווג מהיר והפצה של החיידקים, הקמת זיהום שנמשך שבעה עד 10 ימים. מודל ייחודי זה יהיה כלי שימושי לחקירות של פתוגנזה חיידקית, אינטראקציות פתוגן מארח, ופיתוח של טיפולים חדשים עבור זיהומים כרוניים פצע Pseudomonas aeruginosa.לסייע לי בהדגמה של ההליך יהיה דן ליו, סטודנט לרפואה מהמעבדה בוליקי. לפני תחילת ההליך, לשקול עכבר הרדמה בן שמונה עד 12 שבועות כדי לקבל משקל בסיסי ולמקם את העכבר במצב נוטה. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, להזריק תת עורית את העכבר עם 250 microliters של 0.9% נתרן כלורי מחומם מראש על כל אגף.השתמש מכונת גילוח חשמלית כדי להסיר את השיער מהאזור הגבי של העכבר ולהחיל שכבה דקה של קרם depilatory על העור החשוף. לאחר 20 עד 60 שניות, להסיר את השיער קרם עודף עם גזה לחה במים חמים. עבור ניתוח פצע כריתה בעובי מלא, תחילה להשתמש במחט מד 25 להזריק תת עורית 0.6 כדי מיליגרם אחד לקילוגרם של buprenorphine שחרור מתמשך באזור אמצע הגב של העכבר ולנגב את האתר הכירורגי באופן מעגלי עם שלושה באטדין סטרילי חלופי ספוגיות אלכוהול.מניחים וילון ניילון נצמד על האתר הכירורגי ומותוחים את העור בצורה מתוחה. כאשר העור התייבש, השתמש בניקוב ביופסיה סטרילי בקוטר שישה מילימטרים כדי לבצע חתך ראשוני דרך האפידרמיס הגבי השמאלי, ואחריו חתך שני על האפידרמיס הגבי הימני. השתמש מלקחים כדי לאוהל את העור ממרכז אזור הפצע השמאלי קווי המתאר ולהשתמש מספריים כדי excise את השכבות האפידרמיס והדרמלי.לאחר חזרה על החתך באזור הפצע הימני המתואר כדי ליצור פצעי כריתה סימטריים, לשטוף את שני הפצעים עם 50 microliters של מלוחים סטריליים. כאשר האתר הכירורגי והעור שמסביב התייבשו, מכסים את הפצעים ואת הגב עם רוטב סרט שקוף ומ מניחים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום עם ניטור עד שליטה מלאה. 24 שעות לאחר הניתוח, לשקול את העכבר הרדמה מחדש שוב להזריק את החיה תת עורית עם 250 microliters של 0.9% נתרן כלורי מחומם מראש בשני האגפים.לאחר מכן, לטעון 100 microliters של המתלה זן P.aeruginosa זוהר לתוך מזרק כובע בטיחות שחפת 500 מיקרוליטר מצויד מחט מד 27 ולהזריק 40 microliters של השעיית חיידקים דרך הסרט השקוף להתלבש לתוך כל פצע. ודא כי ההשעיה החיידקית מעורבת היטב כי ההלבשה השקופה היא שלמה. הקפד לנקב את ההלבשה השקופה רק פעם אחת עם הצד הלוח מחט למעלה.לאחר מכן להחזיר את העכבר לכלוב שלה על דף חימום עם ניטור ולספק תוסף תזונה עתיר קלוריות להדביק דחוק בין כדורי מזון על הרצפה של הכלוב. צלחת inoculum הנותרים על צלחת אגר LB ולספר את המושבות כדי לאשר את מספר החיידקים שנוהלו. עבור הדמיה in vivo של הפצעים הנגועים, בצע את רמת הבטיחות הביולוגית שני פרוטוקולי בלימה להובלת העכברים אל מכשיר ההדמיה וממו ולמקם את העכבר הרדמה במצב נוטה בתוך תא ההדמיה.בתוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה, binning, f-stop ותחום התצוגה בהתאם לניסוי. לאחר מכן, ליצור אזור של עניין באתר הפצע ולמדוד את השטף שזוהה הממוצע פוטונים לשנייה. כדי למדוד את הרקע, צור אזור מעניין על פני אזור אקראי בפלטפורמת ההדמיה והחסיר את מספר הרקע של פוטונים לשניה.בסוף הניסוי, בארון בטיחות ביו, להשתמש מספריים סטריליים מלקחים כדי למלמל את מיטות הפצע ולמקם כל מיטה במיליליטר אחד של PBS סטרילי בצינור פוליפרופילן 1.5 מיליליטר. טחון את רקמת הפצע עם מספריים ולהדקר את חתיכות הרקמה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס ב 300 סיבובים לדקה במשך שעתיים. בסוף הדגירה, מערבולת כל צינור במשך 10 שניות לפני דילול סדרתי של הקולחים החיידקיים ב- PBS וציפוי קולחים חיידקיים מדוללים על אגר LB לכמת את הנטל החיידקי.תמונה מייצגת זו המתקבלת באמצעות מערכת אופטית הדמיה מדגימה כי מודל זה גורם זוהר לזיהוי. בניסוי זה, הזיהום הגיע לשיאו ביום השלישי לאחר החיסון ונמשך שבעה ימים לאחר החיסון בהתבסס על ספירת הביולומינציה והמושבה. תרבות החיידקים המבודדים מהפצע מוכיחה עוד יותר כי המושבה מכומתת ויוצרת יחידות לכל פצע בקורלציה עם הנוצה שזוהתה.למרות שיש ירידה ראשונית במשקל מהיר מיד לאחר ההזרקה, זריקות מלוחים ותזונה משלימה יכול לשחזר את העכברים למשקולות הראשוניות שלהם. מינון החיסון המחושב של אשר 50% מהפצעים יידבקו באופן משמעותי נקבע להיות כ 7.7 פעמים 10 למושבה השנייה להרכיב יחידות למיליליטר. מינונים גבוהים יותר מפעם אחת 10 למושבה הרביעית להרכיב יחידות למיליליטר לגרום שיעור זיהום 100%..טיפולים אקטואליים מערכתיים שונים ניתן ליישם לאחר נהלי הפציעה והחיסון כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים חדשים עבור Pseudomonas aeruginosa. כל העבודה עם Pseudomonas aeruginosa ועכברים נגועים צריכה להתבצע עם אמצעי זהירות BSL-2 בהתאם להנחיות ועדת הבטיחות הביולוגית והשימוש בבעלי חיים של החוקר.

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: דה פריס, ס. ר., et.al. מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני של פסאודומונס aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)הווידאו הזה מדגים את ההעברה המאוחרת של Pseudomonas aeruginosa זוהרת לעכבר הנושא שני פצעים עוריים בעובי מלא המכוסים בתחבושת שקופה. דבר זה מסייע ביצירת ביופילם ובהקמת זיהום כרוני. ניטור ביולומינסנציה סדיר מאפשר לכמת את נטל החיידקים ומעקב אחר התקדמות הזיהום לאורך זמן.

פיתוח מודל עכבר של זיהום פצע עור כרוני של פסאודומונס aeruginosa 

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

פיתחנו מודל פגיעה ריאתית של עכבר על ידי הזרקה תוך-קנה של חיידקים Pseudomonas aeruginosa. מודל זה מחקה פגיעה ריאתית במהלך דלקת ריאות והוא רלוונטי מבחינה קלינית.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

כאן נתאר מודל מאתר סוכרתית הרומן ניצול עכברים שיער ניטור בזמן אמת, לא פולשנית, זיהומים בפצע biofilm של ביולומנאסן Pseudomonas aeruginosa. בשיטה זו ניתן להתאים כדי להעריך את זיהום של אחרים חיידקים ומיקרואורגניזמים מהונדסים, כולל biofilms מינים רב, ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות antibiofilm.

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

פצעים כרוניים מפותחים פציעות חריפה על מודל עכבר סוכרתית על ידי גרימת רמות גבוהות של לחץ חמצוני לאחר פצע מלאה בעובי עורית. הפצע מטופל במעכבי לקטלאז ולperoxidase גלוטתיון, והתוצאה היא ריפוי לקוי ופיתוח של ביו, על ידי חיידקים המצויים במיקרובידום העור.

פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית

זיהום מפרק פריפרוסתטי (PJI) הנגרם על ידי פתוגנים מסוכנים נפוץ באורתופדיה קלינית. מודלים קיימים של בעלי חיים אינם יכולים לדמות במדויק את המצב האמיתי של PJI. כאן, הקמנו מודל עכבר PJI הקשור לביופילם קנדידה אלביקנס כדי לחקור ולפתח טיפולים חדשים עבור PJI.

מודל זיהום במפרק פריפרוסתי קנדידה אלביקנס בעכבר

פצעים כרוניים עמידים לאנטיביוטיקה מהווים איום משמעותי על מערכת הבריאות. זיהומי ביופילם הם עקשניים ועוינים ועלולים לגרום לסגירת פצעים תפקודית לקויה. אנו מדווחים על מודל חזירים רלוונטי מבחינה קלינית של פצעים כרוניים בעובי מלא הנגועים בביופילם. מודל זה הוא רב עוצמה למחקרים מכניסטיים, כמו גם לבדיקת התערבויות.

מודל חזירי של זיהום ביופילם ופצעים בלתי נראים

כיום חסרים מודלים in vivo המתאימים לבדיקת תרופות נגד זיהומים חיידקיים כרוניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהום פצע על ידי מבודד קליני של Pseudomonas aeruginosa כדי ליצור זיהום מתמשך בזחלי דג הזברה.

מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

למד פרוטוקול הדבקה מושהה ליצירת זיהום כרוני בפצעים בעכברים בעלי חיסון תקין. שיטה זו מאפשרת חקר Pseudomonas aeruginosa ללא דיכוי חיסוני או שתל חומר זר.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

גלה סרטונים נוספים