קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים
21 במאי 2020
מוצגת שיטה ליצירת פרופיל של דגני בוקר. ביטוי גנטי מבוססי מיקרוarray הפרופיל מתחיל עם בידוד של RNA הכולל באיכות גבוהה מדגנים דגנים וממשיך עם הדור של cDNA. לאחר היברידינה של cRNA והכלאה מיקרוarray, ההמלצות ניתנות לזיהוי אותות ולבקרת איכות.
שיטת הכלאה microarray זה שימושי להשוואת מספר רב של דגימות אורגניזם עם גנום ידוע. בהשוואה לגישה של רצף תפוקה גבוהה, כמות הנתונים שנוצרת על ידי שיטה זו היא הרבה יותר קלה לטיפול ועוד, ניתן לנתח אותה בצורה חסכונית יותר. הפגנת ההליך תהיה ד"ר כריסטיאן סיילר, פוסט-דוקטורט, שעובדת בקבוצת המחקר ברוזיס ב-IPK בגאטרסלבן.
לפני ביצוע הכלאה microarray באמצעות ערכת הכלאה ביטוי גנים, להכין סוכן חסימה 10X על פי מפרט היצרן aliquot סוכן חסימה וכתוצאה מכך 200 כרכים microliter. לאחר מכן, לאחסן את סוכן החסימה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש. ביום ההכלאה microarray, להפשיר אחד 200 aliquot microliter של סוכן חסימה 10X על קרח לפני המלחמה את תנור ההכלאה ל 65 מעלות צלזיוס וגוש חום ל 60 מעלות צלזיוס.
הכינו את תערובת הפיצול לכל דגימה כפי שתוארה על ידי היצרן וערבבו את הדגימות בעדינות על מערבולת. לאחר מערבולת, לזמן קצר לסובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה לפני הדגירה בדיוק 30 דקות בבלוק חום 60 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מיד לקרר כל צינור על קרח במשך דקה אחת לפני עצירת הפיצול עם 25 microliters של חיץ הכלאה ביטוי גנים 2X, מהפכות גבוהות לדקה לכל צינור.
מערבבים עם צינורות עדינים, דואגים מאוד לא להציג בועות, וצנטריפוגה הצינורות בטמפרטורת החדר הסביבה. בסוף הספין מיד מניחים את כל הצינורות על הקרח ועומסים כל דגימה לתוך מגלשת המיקרו-ריי מהר ככל האפשר. לאחר מכן, מחלקים באיטיות 44 מיקרוליטרים של כל תערובת הכלאה למרכז כל באר אטם, דואגים להימנע מהכנסת בועות, ומוסיפים 44 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה לתוך כל בארות שאינן שימוש.
מיד למקם את השקופית microarray בכיוון הנכון על גבי מגלשת אטם, דואג לא לשפוך כל נוזל, ולסגור בחוזקה את הרכבה הכלאה. סובב את ההרכבה כדי לאשר את המחסור בבועות אוויר נייחות והצב את הרכבת תא ההכלאה לתוך מסובב תנור ההכלאה. הגדר את מהירות הסיבוב ל 10 מהפכות לדקה, ולאחר מכן להתחיל את ההכלאה ב 65 מעלות צלזיוס בדיוק 17 שעות.
בזמן שהדגימות היברידיות, הכינו שלוש הרכבות של כלי שטיפה במאגרי הכביסה המתאימים כמתואר בשולחנות. לאחר 17 שעות בדיוק של הכלאה, לפרק תא הכלאה אחד על ספסל מעבדה מרופד נייר מוך חינם ולהעביר כריך microarray אחד לצלחת המכילה חיץ לשטוף אחד עם ברקוד microarray פונה כלפי מעלה בתנוחה מלוטה מבלי להטביע את כל השקופית במאגר. באמצעות מדפים, להפריד את שתי מגלשות זכוכית ולתת את הגלישה אטם טיפה בעדינות לתוך החלק התחתון של המנה תוך שמירה על אחיזה איתנה על שקופית microarray.
הרם באיטיות את החלקת המיקרו-ריי הצידה להעברה מיידית לתוך מתלה המיקרו-ריי בצלחת 2 עם חשיפה מינימלית לאוויר. כאשר כל שמונה השקופיות הונחו באופן שווה לאורך המדף, חבר את מחזיק המדף והעבר את כל המנה 2 לערבב המגנטי. מערבבים את ההתקנה בעדינות במשך דקה אחת בדיוק.
בזמן שהדגימות מעורבבות, מעבירים את המנה השלישית מהאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס על גבי ערבוב מגנטי שני. לאחר מכן מוסיפים בעדינות 37 מעלות צלזיוס לשטוף את המאגר 2 כדי צלחת שלוש מבלי להרכיב בועות. בסוף הדגירה המרגשת, מעבירים בעדינות ובאט לאט את מתלה השקופיות לצלחת שלוש ומסירים את מחזיק המדף.
לאחר ערבוב של דקה אחת בדיוק, מסירים באיטיות ובעדינות את מתלה השקופיות מהצלחת ולהשתמש בנייר חופשי מוך כדי לייבש בזהירות את שני הצדדים של כל שקופית, הצבת כל שקופית לתוך תיבת שקופית כפי שהוא מיובש. לאחר מתן אפשרות לשקופיות להתייבש למשך 15 דקות, העבר כל שקופית microarray למחזיק שקופית כאשר הברקוד פונה כלפי מעלה וטען את מחזיקי השקופיות שהורכבו לקרוסלה ורצף סריקה בהתאם למספר הברקוד. לאחר מכן, סרוק מיד את השקופיות.
בנתון זה, תוצאה מייצגת של ריצה כדי לבדוק את האיכות של מיצוי RNA מוצג. בניתוחים אופייניים של דגימות תוכן עמילן נמוך, כגון עלי שעורה, להקות RNA ריבוזומליות נוספות מכלורופלסטים ניכרות. דגימות תוכן עמילן גבוה, כגון זרעי שעורה, התערוכה 18 ו 28S ריבוזומלי RNA.
שים לב כי לא ניתן לחשב ערך אוטומטי של מספר שלמות RNA עבור רקמות צמחיות ירוקות, כגון דגימות עלים, עקב RNA ריבוזומלי כלורופלסט. בניתוח מייצג זה, הכנת RNA והכלאה לשבב microarray שעורה מותאם אישית בוצעו כפי שהוכח. הרשת מציגה דוגמה לאותות נגזרים מכל פינה של השבב, כולל רקע ודקר בנקודות קריאה המשמשות לכיול.
ההיסטוגרמה מציינת את הסטייה של נקודות הניתנות לגילוי עם עוצמת אות בהתאמה. כפי שנצפה, הכלאה מוצלחת מעניקה עקומה רחבה בצורת גאוסיאנית עם חריגים קטנים בלבד. מוצג כאן דוח בקרת האיכות עבור אותות שזוהו.
הערכים עבור השקופית הכלאית ניתנים בעמודה 2 וטווח הערכים הקביים מוצג בעמודה ארבע. שיטה זו יכולה לשמש לטיפול בכל הגדרה ניסיונית עבור כל אורגניזם שבו מידע משמעותי על הגנום זמין. שימוש בטכניקה זו במעבדה שלנו אפשר לנו להשוות ולנתח שינויים תעתיק באורז ושורה המתרחשים לאחר אינדוקציה מתח הצמיחה.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה מבוססת מיקרו-מערך לפרופיל טרנסקריפטום של דגנים, המתמקדת בבידוד RNA באיכות גבוהה ויצירת cDNA עוקבת. הנוהל כולל המלצות מפורטות לגילוי אותות ובקרת איכות במהלך הכלאה של מיקרו-מערך.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של צמחים
- ניתוח ביטוי גנים
רקע
- הכלאה של מיקרו-מערך מאפשרת השוואה של דגימות מרובות מאורגניזמים עם גנומים ידועים.
- שיטה זו ניתנת לניהול וחסכונית יותר בהשוואה לרצף גבוה-תפוקה.
- היא שימושית במיוחד לניתוח שינויים טרנסקריפטומיים בדגנים כמו אורז ושעורה.
- מדידות בקרת איכות חיוניות להבטחת תוצאות אמינות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה חזקה לפרופיל טרנסקריפטום בגרגרי דגנים.
- לספק פרוטוקול מפורט לבידוד RNA והכלאה של מיקרו-מערך.
- להקל על ניתוח שינויים בביטוי גנים בתנאי גידול שונים.
שיטות ששימשו
- בידוד RNA כולל מגרגרי דגנים.
- יצירת cDNA וסימון cRNA.
- הכלאה של מיקרו-מערך עם פרוטוקולים ספציפיים להכנת דגימות.
- הערכות בקרת איכות במהלך ואחרי ההכלאה.
תוצאות עיקריות
- הכלאה מוצלחת מניבה עקומת אינטנסיביות אותות בצורת גאוס רחבה.
- דוחות בקרת איכות מצביעים על טווחי אותות מקובלים עבור שקופיות מוכלאות.
- תוצאות מייצגות מדגימות את איכות חילוץ ה-RNA ויעילות ההכלאה.
- השיטה מאפשרת ניתוח השוואתי של שינויים טרנסקריפטומיים בתגובה למתח.
מסקנות
- שיטת מיקרו-מערך זו יעילה לפרופיל טרנסקריפטום בדגנים.
- היא מספקת גישה אמינה לניתוח ביטוי גנים בתנאים שונים.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב לאוורגניזמים אחרים עם מידע גנומי זמין.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds is critical for target validation in agricultural biotechnology, where starch and sugar content often compromise RNA integrity. This method enables reliable gene expression profiling under varying developmental and stress conditions, supporting mechanistic de-risking of trait-associated targets. By delivering quantitative, reproducible transcriptomic measurements, it strengthens predictive confidence in early discovery workflows for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses in cereal models with known genomes, clarifying pathway involvement in stress response.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and hybridization workflows that reduce variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports identification of differentially expressed genes (DEGs) and gene regulatory networks, improving confidence in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates transcriptome-wide data suitable for biomarker discovery and phenotypic screening in grain development models.
- Operational Value: Delivers consistent signal intensity profiles with quality control metrics, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Compatible with microarray platforms allowing parallel processing of multiple seed genotypes or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular phenotypes in developing seeds to field-relevant traits through transcriptome-wide association study (TWAS) readiness.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene expression dynamics during germination and abiotic stress, reducing uncertainty in target mechanism.
- Predictive Confidence: Enables cross-condition comparison of transcriptomic changes, supporting go/no-go decisions in trait validation pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in crop trait validation where genomic resources exist.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via DEG analysis and gene network characterization in cereal models under stress or developmental cues.
- Screening: Enables assay-ready transcriptome profiling with quality-controlled cRNA labeling and hybridization outputs suitable for comparative screening.
- Analytics: Produces signal intensity data with Gaussian distribution and spike-in controls, allowing statistical comparison of expression levels across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and TWAS applications by providing high-quality transcriptome data from germinating, developing, and mature seeds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across cereal species with available genome sequences, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from low-quality RNA in high-starch tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking agent use, fragmentation timing, and wash buffer protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling cost-effective transcriptome analysis compared to sequencing, especially for large sample sets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing reliable expression data for prioritizing targets in abiotic stress tolerance or yield improvement programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and microarray techniques to prevent degradation and ensure proper fragmentation.
- Dependent on access to hybridization ovens, magnetic stirrers, slide scanners, and microarray-compatible consumables.
- Necessitates cross-team standardization of RNA quality metrics and hybridization timing for multi-site reproducibility.
- Adaptation to non-cereal models may require validation of RNA extraction efficacy due to varying starch, sugar, or secondary metabolite content.
- Practical limitation: Manual slide handling increases risk of bubble introduction or cross-contamination during hybridization assembly.
