Name: ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: חקור שיטת ציטומטריית זרימה לניטור נוגדני חסימת PD-1 המאוגדים לתאי T בדגימת טיפת דם היקפי מינימלית. השיטה מאפשרת זיהוי תת-אוכלוסיות תאי חיסון הקשורות לתגובות נוגדות גידול ולאירועים לוואי חיסוניים בחולי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים S.K. מן החברה היפן לקידום המדע KAKENHI (JP17K16045) ואת הסוכנות היפן למחקר ופיתוח רפואי (JP18cm0106335 ו-19cm0106310).

הדגימה בוצעה במהלך הליכים קליניים שגרתיים. כל הדגימות האנושיות הושגו לאחר הסכמה מושכלת נמסר על ידי הנושאים, בהתאם להצהרת הלסינקי ובאישור של הוועדה המוסרית הביקורת של בית הספר לרפואה בוגרת, אוניברסיטת אוסקה, יפן (15383 ו-752).
1. הכנה לדגימת דם מלאה וצביעת
<ol><li>לאסוף דגימות דם שלם לתוך צינורות איסוף דם המכיל אתילן diamine טטרה חומצה אצטית (EDTA). הערה: ניתן לבצע את איסוף הדם באמצעות מחט רגילה או מחלת דם.</li>
	<li>העברה 20 μL של דגימות דם שלמות כדי 5 מ ל הקלקר עגול-התחתון הזרימה הצינורות cy, לנסות. הערה: כדי להקטין את הכריכה הלא ספציפית של תאים לצינורות, 1 מ ל של 2% סרום של שור עוברי (FBS) ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) מתווסף לצינורות, והורטתו עבור 10 s לפני היישום כדי דגימות.</li>
	<li>הוסף 20 μL של 2% FBS ב-PBS.</li>
	<li>הוסף 10 μL של מגיב מיוחד לחסימת FcR של האדם. מערבבים היטב ומשלבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר פירוק של תא דם אדום. מערבבים היטב ומשלבים בטמפרטורה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 4 מ ל של 2% FBS ב PBS ו ספין למטה תאים ב 400 x g (1,500 rpm) עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט על ידי השאיפה.</li>
	<li>חזור על תהליך השטיפה והשאיפה המתואר בשלב 1.6.</li>
	<li>השהה מחדש תאים ב-100 μL של 2% FBS ב-PBS וחילוק לשתי שפופרות של 50 μL כל אחד.</li>
	<li>הוסף נוגדנים לסמן פני השטח (טבלה 1). מערבבים היטב ומשלבים את הטמפרטורה 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה. הערה: בשעת יצירת פרופיל למצב החיסוני של תא T, ניתן להגדיל את מספר הסמנים בהתאם לאיכות המחשב של הזרימה cy, try.</li>
	<li>לשטוף דגימות 2x כפי שמתואר בשלב 1.6.</li>
	<li>השהה תאים מחדש ב-200 μL של 2% FBS ב-PBS.</li>
</ol>2. ניתוח ציטומטלי זרימה
<ol><li>הכנס צינורות לתוך cytometer לרכוש תאים, בעצם לאחר הפרוטוקול המומלץ9.</li>
	<li>רשום 10,000 אירועים כשער לימפוציטים (איור 1א) וייצא נתוני זרימה כקבצי fcs לצורך ניתוח.</li>
	<li>פתח קבצים בתוכנת הניתוח. המחש את התאים הנמצאים על מגרש פיזור קדמי (FSC) (A) לעומת לימפוציטים של שער (a) (A) (A) (a) (a) (איור 1א).</li>
	<li>לאחר בחירת תאים בודדים באמצעות FSC (H) לעומת FSC (W) ו-אס. אס. לעומת הבנק הקיסרי (W) (איור 1B) ומציג אותם על CD3 VS. CD8 או CD3 vs. CD4 העלילה, לשער את התאים הCD8 T ותאים CD4 t, בהתאמה (איור 1ג).</li>
	<li>לאחר בחירת התאים מגודרת והצגתם על מחלקה PD-1 לעומת האדם IgG4 העלילה, לזהות PD-1 – חסימת נוגדן-CD8 bound ו CD4 T מבוסס על בקרת isotype (איור 1ד).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה באמצעות cytometer זרם כדי לזהות PD-1-חסימת נוגדנים מאוגד תאים T נגזר טיפת דם היקפי, אשר פיתחנו במקור עבור nivolumab זיהוי10. למרות שטכניקה זו פשוטה מאוד וקלה לביצוע, יש לציין שתי נקודות חשובות כדי לקבל תוצאות מדויקות. אחד הוא כי כדי לזהות PD-1 מולקולות, הנוגדן המתאים המתחרה עם nivolumab ו-פרוביזואב יש להשתמש. בעיה זו הוערכו במחקר הקודם11. השני הוא הליזה RBC יש לבצע ביסודיות לפני כתמים פני השטח. כל עוד פקד isotype מבוסס על כל אחד מהתפקודים כדי ל...

PD-1 – חסימת נוגדנים הפכו את הבחירה הסטנדרטית לטיפול בסוגים שונים של סרטן, כולל סרטן ריאות תא קטן (nsclc)1,2,3,4. הם מראים השפעה טיפולית יוצאת דופן בקבוצת משנה של חולי סרטן אשר לא הגיבו כימותרפיות קונבנציונאלי ציטוטוקסיים. עם זאת, מעכבי המחסום החיסונית (ICIs), הכוללים PD-1 – חסימת נוגדנים, יכול לגרום לספקטרום ייחודי וברור של אירועים לוואי, כינה החיסונית הקשורות אירועים לוואי (irAEs)5. למרות iraes יכול להשפיע על כמעט כל הרקמות, הם נצפו בדרך כלל במערכת העיכול, בלוטות אנדוקריניות, העור, והכבד, והם יכולים לגרום הפרודדוקטוס, פריחה, בחילות, שלשול, והפרעות בלוטת התריס6,7. באופן כללי, רוב irAEs מופיעים בתוך 1 עד 2 חודשים לאחר החניכה של ICIs. עם זאת, במקרים מסוימים, הם יכולים להתרחש מאוחר יותר מ 1 שנה לאחר תחילת הטיפול או אפילו לאחר הפסקת הטיפול6,7. הם גם לגרום לתסמינים שונים שעשויים להיות קשה להפלות של פתווגיות אחרות. לפיכך, זה יכול להיות מאתגר כדי לאבחן במהירות irAEs ולהתייחס אליהם כראוי. irAEs יכול להשפיע על כל הרקמות, התפרצות שלהם מושפע מאוד על ידי במחזור תאים חיסוניים, במיוחד תאי T המאוגדים PD-1 – חסימת נוגדנים. לכן, שיטה פשוטה מינימלית פולשנית כדי לפקח על נוגדנים ממוקדות תאים T חשוב בהגדרות קליניות.
כאן, פיתחנו שיטה פשוטה כדי להעריך את הכריכה של PD-1 – חסימת נוגדנים לתאי T באמצעות טיפת דם היקפי מחולי סרטן שקיבלו nivolumab או פמרופזזואב. באמצעות גישה זו, היינו מסוגלים לנטר כל אחת מהפעולות הבאות: 1) המשך של כריכת נוגדנים לתאי T, 2) התפוסת של מולקולות תא T-1 של התא על ידי נוגדנים טיפולית, ו 3) מצב ההפעלה ותכונות אימונולוגיים של תאי T. שיטה זו היא שינוי של טכניקה שדווחה בעבר8. כמות הדם הדרושה היא כמעט זהה לזה הדרוש לבדיקת גלוקוז, והגישה אינה דורשת העשרה תאים מוננובית או שיתוף פעולה עם PD-1 – חסימת נוגדנים. אנו מאשרים כי שיטה זו יכולה להתבצע גם באמצעות דגימות קפואות, כולל דם היקפיים תאים מונוליתים (PBMCs) ותאים מתוך היתוך, הפחתת קרום הלב, נוזל השטיפה ברונכמכתשי, ונוזל מוחי שדרתי, הרומז כי אסטרטגיה זו עשויה להיות שימושית בהקשר של מחקר להיכנס למחקר. שיטה זו עשויה להקל על האבחנה המוקדמת של irAEs, וגם לעזור לקבוע את הטיפולים החיסוני המתאים כדי לשלוט על הסימפטומים שלהם לזהות את הזמנים האופטימליים ליזום טיפולים הבאים לאחר PD-1 מעכבי.

<table><tbody><tr><td>10X RBC Lysis Buffer (רב מינים)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 אנטי אנושי CD4 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>שיבוט RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II זרימה ציטומטר</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סגול מבריק 510 אנטי אנושי CD8a נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>שיבוט RPA-T8</td></tr><tr><td>פוספט של Dulbecco Buffered Saline</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Falcon צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>FcR חוסם ריאגנט, אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 מ"ל</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר 12676029 מדעי</td><td></td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>עכבר IgG1 חד שבטי - איזוטיפ שליטה</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי אנושי IgG4 Fc</td><td></td><td>abcam ab99825</td><td>שיבוט HP6025</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול עכבר אנטי אנושי CD3</td><td>BD</td><td>558117</td><td>שיבוט UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 עכבר אנטי אנושי CD279 (PD-1)</td> <td>BD</td><td>561272</td><td>שיבוט EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 עכבר IgG1 &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור pd-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי t נגזר טיפת דם היקפי

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

מעכבי המחסום החיסונית, כולל PD-1 – חסימת נוגדנים, יש שיפור משמעותי בתוצאות הטיפול בסוגים שונים של סרטן. היעילות הפרמקולוגית של טיפולים אלה מתמשך לאורך זמן, הרחבת אפילו מעבר הפסקת הזריקות שלהם, בשל ריכוזי דם מתמשך. כאן פיתחנו מערכת פשוטה cy, מנסה להעריך את הסטטוס של כריכת התא T של PD-1 – חסימת נוגדנים nivolumab ו-פרומוליזואב. כמו בדיקת גלוקוז, הצורך הזה דורש רק טיפה אחת של דם היקפי. ויזואליזציה כריכת נוגדנים על תאי T הוא אמין יותר מאשר מדידת ריכוזי דם נוגדנים. בנוסף, במידת הצורך, אנו יכולים לנתח סמנים ייחודיים הקשורים החיסונית בתאי T מאוגד PD-1 – חסימת נוגדנים. Thus, זוהי אסטרטגיה פשוטה ופולשנית כדי לנתח את ההשפעה הפרמקולוגית של PD-1 – חסימת נוגדנים בחולי סרטן.

את האסטרטגיה והזרימה cy, לנסות הניתוח (איור 1) יכול לזהות PD-1 – חסימת כריכת נוגדנים לתאי T שהתקבלו טיפה של החולה NSCLC דם היקפי. לפני PD-1-חסימת נוגדן מנוהל, אין אדם IgG4-חיוביות CD8 או CD4 T התאים נמצאים, ו-PD-1ביטוייכול להיות מאושר על ידי pd-1-זיהוי נוגדן (eh 12.1) (איור 2א). לאחר nivolumab או הממשל, IgG4 (nivolumab) ניתן לזהות על תאי T על ידי anti-IgG4 נוגדן (HP6025) בעוד PD-1-זיהוי נוגדן EH 12.1 אינו מזהה כל PD-1 על התאים T כי הרפואי PD-1 נ...

פיתחנו זרימה פשוטה cy, לנסות הערכה להערכת האיגוד של PD-1-חסימת נוגדנים לתאי T, המחייב רק טיפה של דם היקפי מחולי סרטן.

ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

מכיוון ששיטת זו קובעת תאים הקשורים לנוגדנים חוסמי PD-1 באמצעות דם היקפי מחולים, ניתן לזהות את תת-הקבוצה הספציפית האחראית להשפעות אנטי-טמור ולתופעות לוואי הקשורות למערכת החיסון. שיטה זו זקוקה רק לכמות זעירה של דגימת דם ותהליך הניתוח הוא פשוט ומהיר למדי. הוא רק צריך מכונת ציטומטריית זרימה.כדי להתחיל, לאסוף דגימות דם שלמות לתוך צינורות איסוף דם המכילים EDTA. פנקו בכל צינור ציטומטריה של זרימת פוליסטירן עגולה של חמישה מיליליטר עם מיליליטר אחד של סרום בקר עוברי של 2% ב-PBS. וורטקס למשך 10 שניות.ואז להעביר 20 microliters של דגימות דם שלם לצינורות התחתונים העגולים שטופלו חמישה מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטרים של 2%FBS ב- PBS ו- 10 מיקרוליטרים של קולטן FC ספציפי לאדם החוסם את רגנט. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ תות דם אדום. מערבבים היטב ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיליליטר של 2%FBS ב PBS ולסובב את התאים ב 400 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה. חזור על תהליך הכביסה והשאיפה. תן שימוש חוזר בתאים ב-100 מיקרוליטרים של 2%FBS ב-PBS והתחלק לשני צינורות של 50 מיקרוליטרים כל אחד.הוסף נוגדנים לסמן פני השטח. מערבבים היטב ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף דגימות פעמיים ב 2%FBS ב PBS כבעבר.תן שימוש חוזר בתאים ב-200 מיקרוליטרים של 2%FBS ב-PBS. הכנס את הצינורות לציטומטר הזרימה ורכוש תאים בהתאם לפרוטוקול המומלץ. שיא 10, 000 אירועים כמו שער לימפוציטים וייצוא נתוני זרימה כקבצי FCS לניתוח.פתח קבצים בתוכנת הניתוח ולחץ על הקובץ של בקרת isotype כדי לדמיין את התאים על פיזור קדימה לעומת חלקת פיזור בצד לימפוציטים שער. בחר תאים בודדים באמצעות FSCH לעומת FSCW ו- SSCH לעומת SSCW והצג אותם בתווית CD3 לעומת CD8 או CD3 לעומת CD4. שער CD8 תאי T ו CD4 T-תאים בהתאמה.בחר את התאים המגודרים והצג אותם בעלילה PD-1 לעומת IgG4 אנושית. ולאחר מכן, בהתבסס על בקרת אילוטיפ, בחר Q3 כדי לזהות תאי CD8 ו-T של CD8 ו-CD4 הקשורים לנוגדנים PD-1. במחקר זה, אסטרטגיית gating וניתוח cytometry זרימה זיהה PD-1 חסימת נוגדנים מחייב לתאי T המתקבלים טיפה של דם היקפי החולה.העלילה PD-1 לעומת IgG4 האנושי מראה את המצב מחייב של PD-1 חסימת נוגדנים על תאי T. נקודות כתומות ונקודות שחורות מצביעות על צביעת נוגדנים ואיסוטיפים נגד IgG4 בהתאמה. לפני שניתן נוגדן חוסם PD-1, לא היו תאי CD8 או CD4 T חיוביים של IgG4 אנושיים וביטוי PD-1 אושר על ידי נוגדן גילוי PD-1.לאחר ניהול nivolumab או pembrolizumab, IgG4 ניתן לזהות על תאי T על ידי נוגדן אנטי IgG4 ואילו PD-1 גילוי נוגדן EH12.1 אינו מזהה כל PD-1 על תאי T. השערים האדומים, הכחולים והירוקים מצביעים על כריכה מלאה, כריכה חלקית ואובדן כריכה בהתאמה. לאחר חולים הופסק nivolumab ו pembrolizumab, המצב של PD-1 חסימת נוגדנים מחייב CD8 T-תאים ירד.היה מחייב חלקית ולבסוף אובדן מוחלט של הכריכה. אנא הקפד לערבב את דגימת הדם עם ת ליסיס RBC גם כן. כמו כן, ערבוב תות RBC לפני הכתמת סמן פני השטח הוא צעד המפתח בשיטה זו.אם לחוקר יש גישה למכונת ציטומטריית זרימה מתקדמת, ניתן להעריך תאי T הקשורים לנוגדנים הקשורים לנוגדנים PD-1 עם יותר ויותר סמנים הקשורים לאסטרטגיה זו עבור פרופיל פנוטיפים של תאי T האחראים לאירועים שליליים הנגרמים על ידי נוגדנים חוסמי PD-1. דגימה מחולים עם תופעות לוואי מפותחות חשוב להעריך את התועלת של אסטרטגיה זו.

monitoring-pd-1-blocking-antibodies-bound-to-t-cells-derived-from

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לגרום alloantigen ספציפי anergy בבני אדם בתאי הדם ההיקפיים mononuclear. הטכניקה ניתן ליישם קלינית כדי ליצור אי - alloreactive תאים התורם. עירוי של תאים אלה יכול לשפר את הכינון מחדש החיסון ולהפחית רעילות לאחר השתלה אלוגנאית גזע hematopoietic התא.

אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

פרוטוקול זה מפרט הכנה קלינית ליישום של דגימות PBMC ופלזמה באיכות גבוהה באתר הניסוי הקליני שניתן להשתמש בהן לניתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.

הכנת כדורי תאים מונונוקולריים בדם היקפי ופלזמה מהגרלת דם אחת באתרי ניסוי קליני לניתוח סמנים ביולוגיים

השימוש בריאגנטים ייחוס לבדיקת שחרור ציטוקינים מאפשר פרופילי בטיחות במבחנה הניתנים לשחזור וסטנדרטיים יותר של נוגדנים חד-שבטיים אימונותרפיים. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במבחני שחרור ציטוקינים לצד פאנל ריאגנטים ייחוס כדי לחזות את בטיחותם של כמה נוגדנים חד-שבטיים טיפוליים.

שימוש בריאגנטים ייחוס כדי לאשר את החוסן של מבחני שחרור ציטוקינים לחיזוי בטיחות נוגדנים חד-שבטיים

מעכבי צ'קפוינט הם מטרות חשובות בפיתוח טיפולים למלחמה בסרטן. דו"ח זה מציג חיסון חדשני לסרטן מבוסס פפטיד PDL1, PDL1-Vaxx, אשר גורם לייצור נוגדנים רב-שבטיים מנטרלים החוסמים היווצרות קומפלקס PD-1/PDL1. עבודה זו מפרטת גם את הפיתוח והבדיקות של בדיקה מבוססת חרוזים פלואורסצנטיים לניתוח פעילות זו.

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1

פרוטוקול זה מתאר בדיקת חסימה עבור מעכבי PD-1/PD-L1 באמצעות טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח. היא משתמשת באסטרטגיית אימוביליזציה דו-שלבית ומערכת חיץ מותאמת למדידה מדויקת של יחידות תגובה, מה שמקל על הערכת שיעורי החסימה של תרכובות או תרופות ביולוגיות. בנוסף, הוא תומך בזיהוי תפוקה גבוהה של מעכבי PD-1/PD-L1.

זיהוי מעכבי PD-1/PD-L1 עם טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח

חקור שיטת ציטומטריית זרימה לניטור נוגדני חסימת PD-1 המאוגדים לתאי T בדגימת טיפת דם היקפי מינימלית. השיטה מאפשרת זיהוי תת-אוכלוסיות תאי חיסון הקשורות לתגובות נוגדות גידול ולאירועים לוואי חיסוניים בחולי סרטן.

ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

גלה סרטונים נוספים