ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

מכיוון ששיטת זו קובעת תאים הקשורים לנוגדנים חוסמי PD-1 באמצעות דם היקפי מחולים, ניתן לזהות את תת-הקבוצה הספציפית האחראית להשפעות אנטי-טמור ולתופעות לוואי הקשורות למערכת החיסון. שיטה זו זקוקה רק לכמות זעירה של דגימת דם ותהליך הניתוח הוא פשוט ומהיר למדי. הוא רק צריך מכונת ציטומטריית זרימה.

כדי להתחיל, לאסוף דגימות דם שלמות לתוך צינורות איסוף דם המכילים EDTA. פנקו בכל צינור ציטומטריה של זרימת פוליסטירן עגולה של חמישה מיליליטר עם מיליליטר אחד של סרום בקר עוברי של 2% ב-PBS. וורטקס למשך 10 שניות.

ואז להעביר 20 microliters של דגימות דם שלם לצינורות התחתונים העגולים שטופלו חמישה מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטרים של 2%FBS ב- PBS ו- 10 מיקרוליטרים של קולטן FC ספציפי לאדם החוסם את רגנט. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ תות דם אדום. מערבבים היטב ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיליליטר של 2%FBS ב PBS ולסובב את התאים ב 400 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה. חזור על תהליך הכביסה והשאיפה. תן שימוש חוזר בתאים ב-100 מיקרוליטרים של 2%FBS ב-PBS והתחלק לשני צינורות של 50 מיקרוליטרים כל אחד.

הוסף נוגדנים לסמן פני השטח. מערבבים היטב ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף דגימות פעמיים ב 2%FBS ב PBS כבעבר.

תן שימוש חוזר בתאים ב-200 מיקרוליטרים של 2%FBS ב-PBS. הכנס את הצינורות לציטומטר הזרימה ורכוש תאים בהתאם לפרוטוקול המומלץ. שיא 10, 000 אירועים כמו שער לימפוציטים וייצוא נתוני זרימה כקבצי FCS לניתוח.

פתח קבצים בתוכנת הניתוח ולחץ על הקובץ של בקרת isotype כדי לדמיין את התאים על פיזור קדימה לעומת חלקת פיזור בצד לימפוציטים שער. בחר תאים בודדים באמצעות FSCH לעומת FSCW ו- SSCH לעומת SSCW והצג אותם בתווית CD3 לעומת CD8 או CD3 לעומת CD4. שער CD8 תאי T ו CD4 T-תאים בהתאמה.

בחר את התאים המגודרים והצג אותם בעלילה PD-1 לעומת IgG4 אנושית. ולאחר מכן, בהתבסס על בקרת אילוטיפ, בחר Q3 כדי לזהות תאי CD8 ו-T של CD8 ו-CD4 הקשורים לנוגדנים PD-1. במחקר זה, אסטרטגיית gating וניתוח cytometry זרימה זיהה PD-1 חסימת נוגדנים מחייב לתאי T המתקבלים טיפה של דם היקפי החולה.

העלילה PD-1 לעומת IgG4 האנושי מראה את המצב מחייב של PD-1 חסימת נוגדנים על תאי T. נקודות כתומות ונקודות שחורות מצביעות על צביעת נוגדנים ואיסוטיפים נגד IgG4 בהתאמה. לפני שניתן נוגדן חוסם PD-1, לא היו תאי CD8 או CD4 T חיוביים של IgG4 אנושיים וביטוי PD-1 אושר על ידי נוגדן גילוי PD-1.

לאחר ניהול nivolumab או pembrolizumab, IgG4 ניתן לזהות על תאי T על ידי נוגדן אנטי IgG4 ואילו PD-1 גילוי נוגדן EH12.1 אינו מזהה כל PD-1 על תאי T. השערים האדומים, הכחולים והירוקים מצביעים על כריכה מלאה, כריכה חלקית ואובדן כריכה בהתאמה. לאחר חולים הופסק nivolumab ו pembrolizumab, המצב של PD-1 חסימת נוגדנים מחייב CD8 T-תאים ירד.

היה מחייב חלקית ולבסוף אובדן מוחלט של הכריכה. אנא הקפד לערבב את דגימת הדם עם ת ליסיס RBC גם כן. כמו כן, ערבוב תות RBC לפני הכתמת סמן פני השטח הוא צעד המפתח בשיטה זו.

אם לחוקר יש גישה למכונת ציטומטריית זרימה מתקדמת, ניתן להעריך תאי T הקשורים לנוגדנים הקשורים לנוגדנים PD-1 עם יותר ויותר סמנים הקשורים לאסטרטגיה זו עבור פרופיל פנוטיפים של תאי T האחראים לאירועים שליליים הנגרמים על ידי נוגדנים חוסמי PD-1. דגימה מחולים עם תופעות לוואי מפותחות חשוב להעריך את התועלת של אסטרטגיה זו.