בדיקות הומותאימות של דם-יצירת קשר שתלים בלופ זרימה לולאה דגם מחקה זרימת הדם האנושית

פרוטוקול זה מציג מודל לחקירת תאימות דם של מכשירים ליצירת קשר עם דם בהתאם להנחיות הארגון הסטנדרטי הבינלאומי. המודל אידיאלי לחיקוי התנאים הפיזיולוגיים התואמים את השתל שכן הרקע הנמוך לאירועים תרומבוטיים והריכוז הנמוך של נוגדי קרישה מאפשרים ניתוח רחב של פרמטר הדם. שיטה זו אידיאלית למחקר ביו-חומרי שכן היא מספקת דרך פשוטה להעריך את יכולת ההמו-תאימות.

יתר על כן, זה יכול לשמש למחקרים פרה-קליניים. להעמסת הפרין יש לערבב תחילה 5,000 יחידות בינלאומיות של הפרין לא מזוהם עם 0.9% נתרן כלורי כדי להשיג 15 יחידות בינלאומיות למיליליטר של ריכוז הפרין. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של פתרון הפרין המדולל לשלוש מונובטים ניטרליים ושלוש מונובטים שמורים לכל תורם ואחסנו את המונובטים הטעונים בהפרין בארבע מעלות צלזיוס.

30 דקות לפני איסוף דגימת הדם, מניחים את המונובטים בטמפרטורת החדר. כאשר המונובטים התחממו, לאסוף תשעה מיליליטר של דם לתוך כל אחד משלושה מונובטים לכל תורם לפני בריכת כל 27 מיליליטר של דם מכל תורם לתוך מיכל פלסטיק אחד. כדי להכין את לולאת הזרימה, לטעון לפחות צינור אחד לכל תנאי עם שתל לייזר neurovascular לחתוך עניין ולמקום קצה אחד של כל צינור במאגר מלא 0.9% נתרן כלורי.

מניחים צינור לא טעון לתוך המאגר ולחבר את כל הצינורות לראש המשאבה. לאחר מכן הכנס את הקצה השני של כל צינור לתוך גליל מדידה ולהתאים את ההגדרות של המשאבה peristaltic לקצב זרימה של 150 מיליליטר לדקה באמצעות טיימר תוך בדיקת רמת המילוי בצילינדר המדידה. לבדיקת תאימות, השתמש במזרק 12 מיליליטר כדי למלא כל צינור בשישה מיליליטר של דם.

לאחר יצירת מעגל, השתמש באורך של 0.5 ס"מ של סיליקון המחבר צינורות כדי לסגור את הצינורות בחוזקה ולמקם את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ואז להתחיל את הצינור 60 דקות. לניתוח ספירת דם שלם, יש להוסיף 1.2 מיליליטר של דם לא מקובץ או 1.2 מיליליטר דם מכל צינור לאחר ההטבה למונובטים בודדים המכילים EDTA.

בזהירות להפוך את monovettes חמש פעמים לטעון את הבקבוקונים לתוך מנתח דם לניתוח ספירת דם של כל דגימה. בסוף הניתוח, מניחים את המונובטים על קרח במשך 15-60 דקות. עבור אוסף פלזמה ציטראט, למלא מונובטים המכילים ציטראט עם 1.4 מיליליטר של דם לא מתובל או מנוון בזהירות להפוך כל monovette חמש פעמים.

להפריד את הפלזמה על ידי צנטריפוגה ולהעביר שלושה 250 aliquots microliter של שבר הפלזמה לתוך צינורות תגובה בודדים 1.5 מיליליטר. ואז להקפיא את דגימות הפלזמה בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד הניתוח שלהם. עבור אוסף פלזמה EDTA, לאחר דגירה ארבע מעלות צלזיוס לאחר מדידת ספירת הדם, להפריד את הפלזמה על ידי צנטריפוגה ולהעביר שלושה 250 aliquots microliter של שבר הפלזמה לתוך צינורות תגובה בודדים 1.5 מיליליטר.

ואז להקפיא את דגימות הפלזמה בחנקן נוזלי עבור מינוס 20 מעלות צלזיוס אחסון. עבור אוסף פלזמה CTAD, למלא מונובטים המכילים CTAD עם 2.7 מיליליטר של דם שצויר טרי או סוטה בזהירות להפוך את הצינורות חמש פעמים. מניחים את המונובטים על קרח במשך 15-60 דקות לפני איסוף הפלזמה על ידי צנטריפוגה.

להעביר 700 microliters של כל שבר פלזמה באמצע לתוך צינורות תגובה בודדים 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגה צינורות התגובה מלא שוב. לאחר מכן להעביר שני 100 aliquots microliter של השבר האמצעי לתוך צינורות תגובה בודדים 1.5 מיליליטר ולהקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי לאחסון שלהם במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי למדוד את רמות TAT בדגימות פלזמה ציטראט, להוסיף 50 microliters של מאגר מדגם ELISA לתוך כל באר של צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב ו 50 microliters של תקן פלזמה, בקרת פלזמה, ודגימות פלזמה לא מזוהות בכפילויות ל בארות המתאימות של הצלחת.

לאחר איטום הצלחת, הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם רעידות עדינות. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 300 microliters של פתרון כביסה לגם לפני הוספת 100 microliters של נוגדן TAT אנטי אדם הוסיף לכל באר. לאחר דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 300 microliters של פתרון כביסה טרי לכל באר.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תותח כרומגן טרי ל הבאר עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של פתרון עצירה לכל באר ולקרוא את הצפיפות האופטית על פוטומטר ב 490 כדי 500 ננומטר באמצעות נתוני העקומה הסטנדרטית כקו מגמה לחישוב ריכוז TAT של כל מדגם. כדי להכין את השתלים לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, השתמש במלקחיים כדי להסיר את השתלים מהצינורות ולשטוף בקצרה כל שתל שלוש פעמים טרי 0.9% נתרן כלורי לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, לאחסן את השתלים במיכלים בודדים של 2% glutaraldehyde ב PBS ללא סידן ומגנזיום לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להדק את השתלים במיכלים בודדים של PBS במשך 10 דקות לפני התייבשות השתלים בריכוזים עולים של אתנול במשך 10 דקות לכל ריכוז כפי שצוין. מיד לאחר איסוף דם וחיסון, לא מתגלים שינויים במספר תאי הדם הלבנים או האדומים או בערכי ההמטוקריט.

עם זאת, ירידה ברמות המוגלובין מזוהה לאחר חיסון בתוך מערכת לולאת הזרימה. ירידה במספר טסיות הדם הוא ציין גם, כי הוא גדל כאשר סטנט מצופה קיים בתוך צינורות. יש לציין, אובדן זה מצטמצם כאשר הדם הוא דגירה עם סטנט מצופה פיברין-הפרין.

ריכוז TAT מורכב הוא גדל במקצת בתגובה חליטה. כאשר סטנט מתכת חשוף מתווסף, עם זאת, עלייה משמעותית TAT מזוהה המציין הפעלה עמוקה של מערכת קרישה. השימוש בסטנט מצופה פיברין-הפרין מונע הפעלה זו.

תדלוק מוביל להפעלה מוגברת של מפל המחמאה שאינם מושפעים מנוכחותם של סטנטים לא מצופים או מצופים פיברין- הפרין. באופן דומה, גרנולוציטים נויטרופילים מופעלים כפי שמעידים על ידי כימות של רמות אלסטאז נויטרופילים פולימורפונוקלארי. הדמיה על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מגלה כי נוכחות של רשת צפופה של תאי דם וחלבונים על פני השטח של הסטנט הלא מצופה לאחר חיסון כי הוא לא נצפה על סטנטים מצופים פיברין-הפרין.

יש חשיבות עליונה לאשר כי הדם עומד בקריטריוני ההכללה לקבלת דגימות ולהשתמש בדם שנמשך טרי מהר ככל האפשר. דם אנושי עשוי להכיל וירוסים המועברים בדם וסוכנים אחרים ונושא את הסיכון לזיהום כדי להיות בטוח תמיד ללבוש PPE המתאים בעת טיפול בדגימות.