מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים

אפיון מקיף של המיקרו-וירוס הגידולי חיוני במחקר אימונו-אונקולוגי. המבחן הזה הוא הראשון להשתמש במודלים מבוססי RNA לביטוי בריאותי למדידת תאים חיסוניים ברקמת גידול מוצקה. בדיקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג מדידות רגישות וספויות מאוד של ההקשר החיסוני ברקמות גידול מוצקות FFB ולשלב תוצאות אלה לתוך סמן ביולוגי רב מימדי.

כל הטיפולים בסרטן, לא רק immunotherapies, לירות תגובה חיסונית באתר של הגידול מוצק. מדידת תגובה חיסונית זו חשובה להבנת התקדמות המחלה ותגובות הטיפול. פרוטוקול זה משלב טכניקות הכנה מסורתיות של ספריית RNA עם לכידה ממוקדת.

בעוד זמן רב, ביצוע צעדי שטיפה וניטור נקודות הביקורת איכות כפי שהוצע חשוב מאוד להצלחה. עבור RNA מושפל מאוד מדגימות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין, להרכיב את תגובת סינתזת הגדיל הראשון על הקרח על פי השולחן. מערבבים ביסודיות את התגובות על ידי צינור למעלה ולמטה מספר פעמים לפני לזמן קצר מסתובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה.

בסוף הצנטריפוגה, מיד למקם את הדגימות לתוך מחזור תרמי שחומם מראש בעקבות תוכנית מספר שלוש מהשולחן. עבור RNA שלם באיכות גבוהה, להרכיב את תגובת סינתזה גדיל הראשון על קרח בצינור PCR ללא גרעין כפי שמתואר בשולחנות. כדי להתחיל בהליך זה, לערבב 200 ננוגרם של הספרייה ברקוד של עניין עם שני מיקרוגרם של COT-1 DNA ושני microliters של חסימת אוליגוס בצינור PCR ללא גרעין.

לאחר מכן השתמש רכז ואקום להגדיר 30 עד 45 מעלות צלזיוס כדי לייבש את התוכן של הצינור. לאחר ההכלאה, להסיר את הדגימות מן האופניים התרמיים ולהגדיר את האופניים התרמיים כדי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס עם המכסה מחומם להגדיר 70 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 17 microliters של חרוזים הומוגניים לחלוטין לדגימות פיפטה ביסודיות למעלה ולמטה 10 פעמים.

כדי לקשור את ה- DNA לתוך חרוזים, למקם את הצינורות לתוך האופניים התרמיים בעקבות תוכנית 10 לזמן קצר הסרת הצינורות הפשיטו כל 10 עד 12 דקות במשך שלוש שניות של מערבולת עדינה כדי לשמור על חרוזים מחדש. מיד לאחר הדגירה מחייב, להסיר רצועה אחת של צינורות מן האופניים התרמיים ולהוסיף 100 microliters של חיץ לשטוף שחומם מראש אחד לצינורות. פיפטה ביסודיות למעלה ולמטה 10 פעמים ומ מניחים את הצינורות על מתלה מגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיפרד לחלוטין מתסכון לשטוף לפני שאיפה DNA מאוגד המכיל על טבעי.

מוציאים את הצינורות מהמדף ומוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה מחמיר שחומם מראש עם ערבוב יסודי כדי למחוץ לחלוטין את חרוזים דואגים כדי למנוע בועות. מניחים את הצינורות בחזרה לתוך האופניים התרמיים ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני הצבת הצינורות בחזרה על המדף המגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיפרד לחלוטין מן העל טבעי. להשליך את ה-DNA מאוגד המכיל supernatants, לשטוף את חרוזים שוב עם חיץ כביסה מחמיר שחומם מראש כפי שהוכח רק עבור סך של שתי שטיפות מחמירות.

לאחר הכביסה האחרונה, להסיר את supernatant ולהוסיף 150 microliters של מאגר לשטוף טמפרטורת החדר אחד לצינורות. פיפטה לשטוף 10 עד 20 פעמים כדי לחלוטין resuspend את חרוזים להדגור את הדגימות עם המכסה אטום במשך שתי דקות לסירוגין בין מערבולת במשך 30 שניות נח במשך 30 שניות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה בקצרה מניחים את הצינורות על המדף המגנטי ומסירים את העל-טבעי ברגע שהחרוזים דבקים באופן מלא במגנט.

צנטריפוגה הצינורות לזמן קצר עם הכובעים סגורים ולהחזיר את הדגימות למדף המגנטי. השתמש פיפטה 10 microliter כדי להסיר כל מאגר לשטוף שיורית ולהוסיף 150 microliters של מאגר לשטוף טמפרטורת החדר שני. פיפטה לשטוף 10 עד 20 פעמים כדי לשימוש חוזר לחלוטין את חרוזים דגירה הדגימות עם המכסים אטום במשך שתי דקות לסירוגין בין מערבולת במשך 30 שניות נח במשך 30 שניות.

לאחר צנטריפוגה קצרה, להעביר את כל נפח של חרוזים מכל צינור לתוך צינורות PCR נקיים ללא גרעין ולה מניחים את הצינורות על המדף המגנטי. לאחר השלכת הדנ"א הלא מאוגד המכיל על-טבעי, צנטריפוגה קצרה של הדגימות שוב ושימוש בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר כל חיץ שטיפה שיורית מהחרוזים בזמן שהם נמצאים במדף המגנטי. הוסף 150 microliters של חיץ לשטוף שלוש לצינורות פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים כדי למחוץ לחלוטין את חרוזים.

דגירה הצינור במשך שתי דקות לסירוגין בין 30 שניות של מערבולת עדינה 30 שניות של מנוחה לפני צנטריפוגה לזמן קצר. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי כדי לשאוף את העל-טבעיים ולזמן קצר לקצרה צנטריפוגה דגימות חרוזים שוב. השתמש פיפטה 10 microliter כדי להסיר כל מאגר לשטוף שיורית מן החמרוזים בזמן שהם במתלה מגנטי לפני הסרת הצינורות מן המדף resuspending את חרוזים ב 20 microliters של מים ללא גרעין לכל צינור.

ואז פיפטה את חרוזים 10 פעמים כדי להבטיח כי כל חרוזים דבוקים לצד של הצינורות כבר resuspended. יש להעריך את נוכחותם של עמעומי מתאם כדי לקבוע אם יש צורך בניקוי נוסף. לדוגמה, אלקטרופרוגרמה זו מציגה רמה מקובלת של עמעום מתאם המופיע כשיא חד סביב 128 זוגות בסיס בעוד אלקטרופרוגרמה זו מציגה רמה בלתי קבילה של עמעום מתאם.

הפרופילים החיסוניים לפני ולאחר הטיפול עשויים לשמש להבנת ההשפעות של טיפול ספציפי על microenvironment הגידול כמו בניתוח מייצג זה שעבורו השינויים באחוזים עבור כל תא חיסוני של עניין ואת התוכן החיסוני הכולל מוצגים לפני ולאחר כימותרפיה עבור חולה אחד. בניתוח זה, דגימות בין קבוצות חולים הושוו בהתאם לזמן שלהם להתקדמות המחלה לאחר הטיפול. תת קבוצה של חולים הראו הישנות המחלה לאחר 18 חודשים בעוד תת קבוצה אחרת התקדמה מהר יותר ב 18 או פחות חודשים.

לאחר מכן ניתן להשוות את ערך הדלתא החציוני עבור כל מדגם כדי לזהות סמנים ביולוגיים putative של התקדמות המחלה. לדוגמה, כאן זוהו שני גנים של בריחה חיסונית כמבילים מובהקים סטטיסטית של קבוצות המדגם. מכיוון שהסמנים הביולוגיים של הגנים הבודדים היו חזקים עם מובהקות סטטיסטית ברורה, הסמן הביולוגי הרב-ממדי לא הוסיף ערך חיזוי משמעותי.

הקפד לבצע את השטיפה המחוממת רצועה אחת בכל פעם כדי למנוע קירור מדגם ולזכור להעביר את חרוזים צינורות טריים, כדי למנוע זיהום מחוץ ליעד. פרוטוקול זה מדגים את השימוש במודלים של ביטוי גנים לכימות תאי מערכת החיסון ורקמות הגידול. מודלים חדשים מפותחים למדידת מצבי תאים כגון תשישות או הפעלה.