Name: מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למד מידול חיסונית חזוי של גידולים מוצקים באמצעות RNA ולכידה מכוונת. שיטה זו מאפשרת מדידה רגישה של תאים חיסוניים וגילוי ביומרקרים רב-ממדיים לחקר אימונו-אונקולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מעוניינים להכיר בקבוצת הטכנולוגיה TriStar למתן את הדגימות הביולוגי לתוצאות הנציגים, כמו גם את מולקולרית, ניתוח, מוצר, צוותי מסחרי ב קופקטור גנומיקה עבור המומחיות הטכנית שלהם תמיכה.

<ol><li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-infiltrating+lymphocytes%2C+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients%3A+clinicopathological+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li>
<li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li>
<li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+in+Cancer%3A+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li>
<li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+From+visual+estimation+to+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li>
<li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18(2017).</li>
<li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xCell%3A+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220(2017).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li>
<li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218(2016).</li>
<li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128(2017).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154(2018).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612(2013).</li>
<li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis%3A+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482(2019).</li>
<li>PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).</li>
<li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535(2019).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).</li>
<li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+%28TILs%29+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25(2018).</li>
<li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4%2FCD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li>
<li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).</li>
</ol>

כל המחברים מועסקים על ידי קופקטור גנומיקה, Inc., החברה שפיתחה ומייצרת את הציוד המגיב הimmunoprism והכלים המשמשים במאמר זה. המלון מיועד לשימוש מחקרי בלבד, ואינו מיועד לשימוש בהליכי אבחון.

הפרוטוקול דורש 20 ng או 40 ng מאוד מושפל (FFPE) RNA. דוגמת ה-RNA צריכה להיות חופשית מ-DNA, מלחים (g., Mg2 +, או guanidinium מלחים), סוכני הקטיון בעלי כלים (למשל, EDTA, egta, ציטראט), או אורגניקס (למשל, פנול ו אתנול). לא מומלץ להמשיך עם דגימות RNA בעלי DV200 < 20%. השימוש ב-kit בקרת RNA מומלץ מאוד כמו אלה שולטת לספק אמצעים כדי להעריך את הביצועים ברחבי הפרוטוקול כולו, מתוך הכנת הספרייה לניתוח.
הפרוטוקול נועד להתבצע באמצעות צינורות הסטריפ 0.2 mL. אם המועדפת, ניתן לבצע את הפרוטוקול גם באמצעות הבארות בצלחת 96-PCR. פשוט להשתמש בבארות של הצלחת 96-היטב PCR במקום כל ההפניות צינורות PCR או צינורות רצועה. השתמש בלוחות PCR עם בארות ברורות בלבד, מכיוון שהוא קריטי לאישור חזותי של השעיה מלאה של חרוזים במהלך מטהר החרוזים ולשטוף את הצעדים.
במהלך הפרוטוקול, לשמור על ריאגנטים קפוא או על קרח אלא אם צוין אחרת. אין להשתמש ריאגנטים עד שהם מופשרים לחלוטין. הקפד לערבב ביסודיות את כל הריאגנטים לפני השימוש.
שמור על אנזימים ב-20 ° c עד שיהיה מוכן לשימוש וחזור ל-20 ° c מייד לאחר השימוש. השתמש במים ללא שכירות מולקולריים בלבד; לא מומלץ להשתמש במים שטופלו ב-DEPC. בעת ליטוף כדי לערבב, בעדינות מלטף ומוותר לפחות 50% של הנפח הכולל עד הפתרונות מעורבים היטב. פיפטה מערבב את כל. התערובות המכילות אנזימים שימוש במערבולת לערבב את האנזימים יכול להוביל לדנטורציה ולהתפשר על הביצועים שלהם. במהלך מטהרי חרוז, השימוש טרי עשה 80% האתנול פתרונות מאתנול כיתה מולקולרית. שימוש בפתרונות אתנול שאינם טריים עלולים לגרום לתשואות נמוכות. להימנע מייבוש את החרוזים, כמו זה יכול להפחית את יעילות הימנעות (חרוזים נראה סדוק אם מעל יבש).
כפי שמתואר בשלב 10, התחל האינדקס הייחודי מתווסף לכל תגובה. בהתאם לרצפים של מדדים אלה, עבור ריבוב ברמה נמוכה, שילובי אינדקס מסוימים הם אופטימליים. רצפי מדדים אלה נדרשים כדי לחלק את רצף הנתונים שלאחר העריכה. הרצפים ושילובי הריבוב המומלצים ניתנים בטבלה משלימה 3. באותו שלב, חשוב לציין כי מספר מחזורי ה-PCR המומלצים משתנה בהתאם לאיכות ה-RNA שבשימוש, ומיטוב מסוים עשוי להידרש כדי למנוע הגברה מרבית של ה-PCR. עבור האימונוopsm שליטה ללא שינוי RNA ואחרים RNA באיכות גבוהה, להתחיל אופטימיזציה עם 10 מחזורי PCR. עבור שליטה מרבית של rna ושאר RNA מאוד מושפל/FFPE, התחל במיטוב עם 15 מחזורי PCR. הפקת ספריית בדיקות באמצעות הנציג RNA של החומר כדי להיות מנותח על מנת לייעל מחזורי PCR מומלץ. יש להשתמש במספר המינימלי של מחזורי ה-PCR המובילים בעקביות את תשואות הספרייה לפני לכידה מספיקות (> 200 ng). שיא משני סביב 1000 bp על המעקב Bioanalyzer מעיד על הגברה מעל (איור 4). יש למזער את הגברה הרבה יותר, אך הנוכחות של שיא משני קטן לא תפריע לתוצאות התידקות.
כדי למזער את ההפסד לדוגמה ולהימנע מהחלפת צינורות, שלב 13 ניתן לבצע ב-PCR צינורות, שפופרות רצועה, או צלחת 96-היטב PCR במקום 1.5 mL מיקרו צינורות, אם מרכז ואקום שלך מאפשר. ניתן להסיר את הרוטור על ריכוז רבים. זה מאפשר את צינורות הרצועה או לוחות כדי להתאים את הוואקום. ריכוז ואקום ניתן להפעיל באמצעות הגדרת התייבשות מימית ללא צנטריפוגה. עיין במדריך עבור מרכז הואקום לקבלת הוראות. אם הדגימות מיובשות בצינורות חשפנות או בצלחת 96-באר, ניתן לבצע את שלב ההכלאה באותו כלי.
במהלך שלב 17, להיות בטוח מערבולת כל 10-12 דקות כדי להגדיל את היעילות לכידת חרוז. בזהירות להחזיק את כובעים של צינורות הרצועה חם כאשר ערבוב כדי למנוע את הפתיחה של צינורות.
שוטף המתואר בשלב 18 הם קריטיים כדי למנוע זיהום גבוה לא ספציפי ויש לעקוב מקרוב. יש להקפיד להשהות מחדש את החרוזים בכל כביסה, להסיר לחלוטין את מאגרי הכביסה, ובמהלך שטיפת מאגר הכביסה 2, העבירו את הדגימות לצינור חשפנות טרי (Step 18.6.5). ודא כי החרוזים streptavidin לחלוטין מושעה ולהישאר ההשעיה במהלך הדגירה כולה. התזת על כובעי הצינור לא תשפיע לרעה על הלכידה. במהלך שטיפת הטמפרטורה בחדר, מערבל מערבולת מיקרופלייט עשוי לשמש למערבולת הדגימות עבור כולו של תקופת דגירה של שתי דקות עבור השעיה קלה יותר. אל תתנו חרוזים streptavidin להתייבש. במידת הצורך, הרחב את incubations במאגרים כדי להימנע מייבוש החרוזים. אם באמצעות יותר מצינור רצועה אחד, לעבוד עם שפופרת רצועה אחת בכל פעם עבור כל כביסה בעוד צינורות הרצועה האחרים לשבת התרמוטרטרנר. זה יכול לעזור להימנע מייבוש החרוזים או ממהרים, וכתוצאה מכך מושהה עני או טכניקות משנה אופטימלית אחרות. עבור משתמשים בפעם הראשונה, לא מומלץ לעבד יותר מ-8 תגובות ספריה בכל פעם.
שיטות נוכחיות לפרופיל המערכת החיסונית מספקים רצף של מידע-מאלפי נקודות נתונים הדורשות פרשנות משמעותית (רצפי RNA) לנקודת נתונים אינדיווידואלית, בודדת-plex. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג גישה שנמצאת באמצע, עם היקף ממוקד המאפשר רגישות גבוהה, אך לוכד רק תת מערכת של נתונים רלוונטיים הטרנססקריפט. בשל הטבע של חילוץ בצובר RNA, פרוטוקול זה אינו מספק מידע על היחסים המרחבית בין תאים חיסוניים לבין מיקרוסביבה הגידול, עם זאת, תוצאות עשויות להיות השלימה עם טכנולוגיות הדמיה כדי להוסיף מידע זה. ישנם מספר רב של יישומים עבור הנתונים שנוצרו על ידי פרוטוקול זה, כפי שיש הרבה ללמוד על ביולוגיה של סרטן כמחלה, ואת הטיפולים שפותחו כדי לטפל בו. כפי שמוצג בתוצאות הנציג, דו ח החיסון הפרטני שימושי להבנת האופן שבו הפרופיל החיסוני של המטופל עשוי להשתנות בתגובה לאירועים כגון התקדמות או טיפול במחלות. בעוד התוצאות המוצגות כאן לספק כמה מקרים להשתמש למשל, יישומים אחרים כולל חקירת מנגנון הפעולה של טיפול וזיהוי בסמנים ביוטיבית של תוצאות קליניות כגון התקדמות חינם הישרדות כוללת גם מעשי. בעת שימוש בפרוטוקול זה ליישומי גילוי ביוגניים, חשוב לתרגל עיצוב לימוד טוב כדי להבטיח אוכלוסיות הומוגניים, מספיק דגימות כלולות בכוח סטטיסטי, ומקורות הטיה נחשבים. בשל אופיו הממוקד והיעיל של הטיפול, ניתן לדמיין דרך לקראת אימות קליני ויישום במורד הזרם של הסמנים הללו התגלו פעם.

כימות של לימפוציטים הסתננות הגידול (TILs) ומולקולות אחרות הקשורות החיסונית ב-formalin-קבוע ו פרפין מוטבע (ffpe) גידול מוצק הגוף האנושי דגימות הוכיחה ערך במחקר קליני1,2,3. טכניקות נפוצות כגון זרימה cy, החומצה החד תא ריבונוקלאית (RNA) רצף שימושי עבור רקמה טרייה דם4, אבל הם לא מתאימים לניתוח של חומרים ffpe בשל חוסר יכולת ליצור השעית תאים קיימא. שיטות נוכחיות ששימשו לכמת תאים אלה ברקמת FFPE סובלים מאתגרים גדולים. אימונוהיסטוכימיה (IHC) וזרימות עבודה דומות אחרות של הדמיה דורשות נוגדנים ספציפיים כדי לזהות חלבונים של פני השטח, אשר יכולים להיות קשים לתקנן על פני מעבדות כדי לאפשר כימות לחות5. פלטפורמות כגון מערכת nCounter להסתמך על הביטוי של גנים בודדים כדי להגדיר תאים חיסוניים מפתח6, הגבלת רגישות וספציפיות של זיהוי. שיטות כלליות יותר לרצפי RNA, ביחד עם כלי תוכנה עצמאיים, זמינים אך דורשים אופטימיזציה ואימות משמעותיים לפני השימוש7,8,9,10,11,12. ההתפתחויות האחרונות בשילוב לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LCM) עם רצפי RNA עבור רקמת FFPE הראו הבטחה; עם זאת, התפוקה הגבוהה יותר, פתרון סוהר הוא נדרש עבור מחקרים טרנסלtional מכוון לזיהוי סמנים חזקים13,14. שיטות ליצירת ביורים רב ממדיים, כגון מידול החיסונית חזוי, המגדירים כנופיית החולה כולל המגיבים תרפיה, סוגי סרטן, או תוצאות הישרדות עם דיוק ניבוי גבוה משמעות סטטיסטית נעשים יותר ויותר חשוב בגיל של רפואה מדויקת וחיסוני15,16.
כדי לטפל בצורך זה, שיטת הפרופיל החיסונית פותחה כדי לאפשר כימות רגיש וספציפי של תאים חיסוניים ברקמת הגידול מוצק FFPE באמצעות הריאגנטים RNA-רצפי מתוקננת ומבוססי ענן מבוסס-. בנוסף כדי לאכלס RNA מושפל מרקמת FFPE, הפרוטוקול הוא מסוגל להכיל RNA נגזר מהגבלת דגימות רקמות כגון ביופסיות מחט הליבה, המחט מורקמת, מיקרו או מאקרו לגזור רקמות. ה-RNA נתונים מכל מדגם מושווה למסד נתונים של מודלים ביטוי גנים של תאים חיסוניים, הנקרא בריאות החיסונית ביטוי מודלים, כדי לכמת את התאים החיסוניים כאחוז של תאים סה כ נוכח המדגם. בקצרה, מודלים אלה נבנו באמצעות שיטות לימוד מחשב כדי לזהות תבניות ייחודיות של ביטויים רב-מגנטיים מנתונים שלמים הנוצרים מפני אוכלוסיות תאים החיסונית מטוהרים (מבודדים באמצעות סמנים תא משטח קאנוני)17,18. ביטוי בריאות רב מימדית מודלים בבסיס הטכנולוגיה מאפשרת את האפשרות לכמת כל תא החיסון כאחוז התאים הכולל נוכח בתערובת הטרוסוגני. הדבר מאפשר לחוקר ליצור השוואות בין תאים המערכת החיסונית הפנים-לדוגמה, אשר הוכחו כבעל ערך קליני19,20. יישומים אחרים כוללים כימות התגובה החיסונית לפני ואחרי הטיפול, כפי שמתואר בתוצאות הנציג. מדווחים על תכונות מרובות של מרקם החיסון של הגידול מיקרוסביבה הגידול כולל את האחוזים המוחלט של שמונה סוגי תא החיסונית (נגזר מודלים ביטוי גנים): CD4+ t תאים, CD8+ t תאים, CD56+ טבעי הרוצח תאים, CD19+ B תאים, CD14+ מונוציטים, tregs, מקרופאגים M1, ו בנוסף, הדו מדווח על הביטוי (בתעתיקים למיליון, או TPM) של עשר גנים בריחה חיסונית: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1, ו ARG1.
הערכה הכימית משמשת להכנת ספריות איכותיות מוכנות לרצף בפלטפורמת המאייר בעקבות שיטת הכנה ללכידה היברידית המבוססת על לכידה, כפי שמוצג באיור 1. אם לחוקר אין פלטפורמת הרצף של המאייר במעבדה שלהם, הם עשויים להגיש דגימות שלהם למעבדת ליבה לרצף. לאחר שנוצר, נתוני רצף מועלה לפורטל הפריזמה לניתוח אוטומטי, ופרופיל מקיף וכמותי לכל מדגם בודד, בצורת דוח המערכת (איור 2א), מוחזר למשתמש. משתמשים יכולים גם להגדיר קבוצות לדוגמה בפורטל הפריזמה כדי ליצור דוח ביוארקר (איור 2ב), הדגשת סמנים משמעותיים מבחינה סטטיסטית המבדילים בין שני גדודים החולה. חשוב מכך, הנתונים שנוצרו על-ידי הערכה הכימית הם לשימוש מחקרי בלבד ולא ניתן להשתמש בהם למטרות אבחון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> איור 1: מבט כולל על זרימת עבודה. בפרוטוקול זה, RNA מומר לראשונה ל-cDNA. מתאמי הרצף הם ליגבים, ומתאם cDNA המתאם מוגבר ומקודד על ידי ה-PCR כדי ליצור ספריית טרום לכידה. בדיקות biotinylated מהוכלא אז למטרות cDNA ספציפיים אשר נלכדו אז באמצעות חרוזי streptavidin. מאוגד, לא ממוקד cDNA מוסר על ידי שטיפת. . מוכנה לרצף * סך RNA חייב להיות מדגימות אנושיות; עלול להיות שלם או מושפל (FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> איור 2: הנציג דוחות החיסונית. זרימת העבודה מפיקה שני דוחות, דוח חיסוני בודד (A) עבור כל מדגם מעובד, ודוח ביוארנקר (B) עבור כנופיית מטופלים מוגדרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרוטוקול דורש כ 16 h של זמן הכנה (מ-RNA סה כ לספריות מוכן לרצף); עם זאת, קיימות מספר נקודות עצירה אופציונליות, כפי שצוינו בפרוטוקול. הטיפול עושה שימוש העשיר, דינמי האופי של הטרנססקריפט לעבור מעבר מורשת חד מימדית ביטויים למודלים גנים רב ממדיים, ובכך לאפשר אפיון ביולוגי מקיף של דגימות רקמה עם סטנדרטית ריאגנטים וכלי תוכנה קלים לשימוש. זה מעצים את החוקרים לנצל טכנולוגיה עכשווית במעבדה שלהם, על ידי מינוף מחשב למידה ומסד נתונים של ביטוי בריאות מודלים לגזור מדויק יותר, פרופילי החיסון הכמותי של דגימות קליניות יקרות, ולגלות רב-ממדי RNA ביוארקרס עם אנליזה סטטיסטית מלאה.

<table><tbody><tr><td>0.2 מ"ל PCR 8 רצועת צינור</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>USA Scientific 0.2 מ"ל PCR רצועת 8 צינורות</td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>MilliporeSigma</td><td>EX0276-1</td><td>הכן 80% על ידי ערבוב עם מים נטולי נוקלאז ביום הניסוי</td></tr><tr><td>מחזורים תרמיים 96 בארות</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI)</td><td>בקמן-קולטר</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP &ndash; חרוזי טיהור PCR</td></tr><tr><td>שבבים וערכת אלקטרופורזה דיגיטלית</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Agilent High Sensitivity DNA שבבים וערכה</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה דיגיטלית</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65306</td><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td></tr><tr><td>ImmunoPrism Kit & ndash; 24 תגובה</td><td>קופקטור גנומיקה</td><td>CFGK-302</td><td>קופקטור ImmunoPrism ערכת פרופיל חיסוני &ndash; 24 תגובות</td></tr><tr><td>אנושי Cot-1 DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Invitrogen מותג</td></tr><tr><td>מתלה הפרדה מגנטית</td><td>Alpaqua/Invitrogen</td><td>A001322/12331D</td><td>96-well מעמד טבעת מגנטית</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1415-2600</td><td>ארה"ב סיינטיפיק 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה בעל הידבקות נמוכה</td></tr><tr><td>הבאSeq550</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>ניתן להשתמש בכל רצף Illumina לפרוטוקול זה</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי פריזמה</td><td>קופקטור גנומיקה</td><td>CFGK-401</td><td>קופקטור פריזמה ערכת מיצוי FFPE & ndash; 24 דגימות</td></tr><tr><td>RNA מטוהר</td> <td>-</td><td></td> <td>מטוהר מדגימות רקמה אנושית</td></tr><tr><td>פלואורומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Qubit 4</td></tr><tr><td>System צינורות בדיקה פלואורומטריים</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>0.5 מ"ל צינורות PCR בקיר דק עם כובעים שטוחים</td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים פלואורומטריים ברגישות גבוהה</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>ערכת בדיקה</td></tr> <tr><td>של Qubit dsDNA HSרכז ואקום</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>VacufugePlus</td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים או בלוק חימום</td><td>VWR / ארה"ב Scientific</td><td>NA / 2510-1102</td><td>אמבט מים VWR / ארה"ב בלוק חימום מדעי</td></tr></tbody></table>

מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

חיסוני להראות הבטחה בטיפול של חולי אונקולוגיה, אבל טרוגניות מורכבת של מיקרוסביבה הגידול גורם לניבוי תגובת הטיפול מאתגרת. היכולת לפתור את האוכלוסיות היחסיות של תאים חיסוניים נוכח וסביב רקמת הגידול הוכח קלינית-רלוונטי לתגובה הבנה, אבל הוא מוגבל על ידי טכניקות מסורתיות כגון הזרמת cy, ואימונוהיסטוכימיה ( IHC), בשל כמות גדולה של רקמות נדרשות, היעדר סמנים מדויקים לסוג תא, ומכשולים טכניים ולוגיסטיים רבים. שיטת אחד (למשל, החיסון ליצירת פרופיל החיסונית) מתגבר על האתגרים הללו על ידי הקלה הן כמויות קטנות של RNA ו-RNA מושפל מאוד, תכונות נפוצות של RNA שחולצו מרקמת הגידול המוצק המאוחסן בארכיון. הגישה מתבצעת באמצעות ערכה מגיב ואינפורמטיקה המבוססת על ענן צמתים המספקת פתרון ליצירת פרופיל מקצה-לקצה כמותי, בעל תפוקה גבוהה, לפלטפורמות רצף הארה. החוקרים להתחיל עם מעטים כמו שני חלקים של formalin קבוע-מוטבע הרקמה (FFPE) או 20-40 ng של RNA סה כ (בהתאם לאיכות המדגם), ואת הפרוטוקול יוצר דוח פרופיל החיסון ככמת שמונה סוגי תא החיסונית עשר החיסונית בריחה גנים, לכידת תצוגה מלאה של מיקרוסביבה הגידול. אין צורך לבצע ניתוח ביולוגי נוסף כדי להשתמש בנתונים שיתקבלו. עם הקבוצה המתאימה לדוגמה, הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי לזהות סמנים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בתוך אוכלוסייה החולה של עניין.

ישנם מספר מחסומים במהלך הפרוטוקול המאפשרים למשתמש להעריך את האיכות והכמות של חומרים שנוצרו. לאחר שלב 12 המתואר בפרוטוקול, מופק electropherogram כפי שמוצג באיור 3, נציג של ספריית טרום לכידה טיפוסית עבור מדגם RNA שלמים (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> איור 3: מעקב אופייני של הספרייה טרום לכידת הספריה עבור דגימת RNA שלמה. ספריות טרום לכידה מופיעות כפסגה רחבה סביב 250-400 זוגות בסיס (bp) בגודל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הטיפול צריך להילקח כדי להימנע יתר על המידה, כפי שמצוין על ידי הפסגה השנייה סביב 1,000 bp המוצג באיור 4, הנציג electropherogram של ספריית טרום לכידה שנוצר מדגם ה-RNA ffpe (DV200 = 46). אם שיא זה קטן יחסית לפסגה הראשית (סביב 250-400 זוגות בסיס (bp), כפי שמוצג), הוא לא יפריע לצעדים או לניתוח במורד הזרם. אם הפסגה השנייה היא גדולה יחסית לשיא 250-400 bp, את הספרייה לפני הלכידה ניתן לעשות מחדש עם פחות מחזורי PCR כדי להפחית את הגברה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> איור 4: מעקב אופייני של הספרייה לפני הלכידה של הספריה עבור המדגם של ה-RNA FFPE. הפסגה השנייה סביב 1,000 bp מעיד על הגברה. אם השיא הזה קטן יחסית לשיא הראשי סביב 250-400 bp (כפי שמוצג), הוא לא יפריע לצעדים או לניתוח במורד הזרם. אם הפסגה השנייה היא גדולה יחסית לשיא 250-400 bp, את הספרייה לפני הלכידה ניתן לעשות מחדש עם פחות מחזורי PCR כדי להפחית את הגברה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כפי שמתואר בשלב 12.1.3, יש להעריך את נוכחות דימרס המתאם כדי לקבוע אם יש צורך בניקוי נוסף. Electropherograms המוצגת באיור 5 הם מייצגים של לא מקובל (איור 5A, dv200 = 33) ומקובל (איור 5B, dv200 = 46) רמות של מתאם dimer, המופיעים כפסגה חדה סביב ה128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> איור 5: מקדם לכידת ספריות ביולוגי עקבות. המתאם דיימר מופיע כשיא חדה סביב 128 bp. (a) דיימר מתאם מוגזם נמצאים ב electropherogram זה. (ב) רמות מתאם מקובלות של דיימר מתוארות בסימן זה. שני העקבות מראים עדויות של הגברה מתונה, אך אין להתערב בעניין השיטת הimmunoprism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בסיום הפרוטוקול, לפני העריכה ברצף, הספריות הסופיות מוערכות שוב באמצעות אלקטרופורזה דיגיטלית. ספריות שנעשו מ-RNA FFPE נוטים להיות התפלגות קטנה יותר בגודל הממוצע מאשר ספריות שנעשו מ-RNA שלם. עבור דגימות RNA שלמות, העקבות שהתקבלו צריך להיראות דומה לאיור 6 (RIN = 9.5). עבור מושפל או FFPE RNA, העקבות המתקבלים צריך להיראות דומה לאיור 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> איור 6: מעקב אופייני של הספרייה הסופית ביומנתח עבור דגימת RNA שלמה. ספריות סופיות מופיעות כפסגה רחבה סביב 250-400 זוגות בסיס (bp) בגודל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> איור 7: המעקב הסופי של הספרייה הסופית בדיקת RNA של מדגם FFPE. ספריות שנעשו מ-RNA FFPE נוטים להיות התפלגות קטנה יותר בגודל הממוצע מאשר ספריות שנעשו מ-RNA שלם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כמתואר, התוצאות שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה עשויות להיות מוחלות בשתי דרכים מרכזיות, בדומה למוצג באיור 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> איור 8: שני מקרי שימוש בפרוטוקול. התוצאות שנוצרו על-ידי שיטת הפרופיל החיסונית מוחלות בשני יישומים מרכזיים. (א) מקרה השימוש הראשון מתחיל מרקמת הגידול האנושי מוצק (כולל ארכיון ffpe) ויוצר פרופיל החיסון היחיד עבור המדגם. (ב) שנוצר לאחר הקבוצה של דגימות אנושיות, הנתונים משולבים באמצעות הפורטל הפריזמה כדי ליצור סמנים רב ממדיים ודוח ביוארקר המקביל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי להדגים כל אחד ממקרי השימוש הללו, נתונים מייצגים ממחקר טרנסלאני קטן כלולים21. הדגימות המשמשות במחקר זה הם קבוצה של דגימות מ 7 חולים שאובחנו מטופלים עבור סרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC). הדגימות הן החולה התאמה רקמות הגידול מוצק מ טרום ופוסט ביופסיות טיפול. ראשית, דגימות בודדות נותחו כדי ליצור פרופיל המערכת החיסונית, כגון דוח הדוגמה המוצג באיור 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> איור 9: לדוגמה דוח החיסון הפרטני עבור דגימת NSCLC. קו הצינור פריזמה פורטל יוצר דוח גרפי עבור כל מדגם מעובד, עם דוח מייצג שנוצר עבור דגימת גידול מוצק NSCLC המוצג כאן. (א) הצד הקדמי של הדוח מתארבאופןגרפי את פירוק התאים החיסוניים נוכח במדגם RNA שחולצו מרקמת ffpe. (ב) הצד ההפוך של הדוח כולל טבלה של תאים חיסוניים (באחוזים מוחלטים) וביטוי הגנים הנמלטים (בתעתיקים למיליון, או TPM), כמו גם הצהרת ביצועים לצורך הקביעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרופילים החיסונית טרום הטיפול ניתן להשתמש כדי להבין איך טיפול (כימותרפיה או קרינה, במחקר זה) שינה את הסביבה המיקרו הגידול. דוגמה מוצגת באיור 10, כאשר השינויים באחוזים עבור כל תא החיסון ואת התוכן החיסוני הכולל מוצגים טרום וכימותרפיה לאחר, עבור מטופל יחיד.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> איור 10: תוצאות לפני ופוסט טיפול. תא החיסון בודדים ונתוני תוכן החיסון הכולל שנוצרו מראש ודגימות שלאחר הטיפול מחולה NSCLC יחיד מוצגים. בדוגמה זו, המטופל קיבל משטר כימותרפיה כטיפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
חולים עשויים להיות מקובצים לפי קריטריונים כגון תוצאות קליניות או פנוטיפים להשוואה. לדוגמה, באיור 11, הדגימות במחקר NSCLC הושוו על פי הזמן להתקדמות המחלה בעקבות הטיפול. קבוצת משנה של המטופלים הראו הישנות המחלה ב &gt; 18 חודשים, ועוד קבוצה התקדמה מהר יותר, ב ≤ 18 חודשים. ערך הדלתא החציוני (ההפרש בין ערכי טרום-הטיפול לאחר ולאחר הטיפולים) מושווה לכל דוגמה כדי לזהות ביואריטים של התקדמות המחלה.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> איור 11: לדוגמה תוצאות קליניות השוואה. שינויים כמותיים בין אחוזי התאים החיסוניים ב-NSCLC בהתאמה לאחר הטיפול ולאחר מכן חושבו ודווחו כערך "דלתא". אלה המסומנים בצהוב מראים שינויי אות ברורים בין מצב ההישרדות. פסים כחולים מייצגים ערכי דלתא חציון עבור &gt; 18 חודשים עד התקדמות המחלה, פסים כתומים מייצגים ערכי דלתא חציון עבור ≤ 18 חודשים עד התקדמות המחלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בסופו של דבר, קבוצות מדגם דומה עשוי לשמש כדי לחפש באופן ספציפי בדוגמאות טרום טיפול כדי לזהות בסמנים חזוי באמצעות הפורטל הפריזמה כדי ליצור דוח ביוארקר. המוצג באיור 12, אותו הפנוטיפ הקליני (התקדמות המחלה) כפי שמתואר לעיל מגדיר את הקיבוצים לדוגמה. בדוגמה זו, שני גנים בריחה החיסונית זוהו כחלק משמעותי מבחינה סטטיסטית של הקיבוצים לדוגמה (CD47 ו OX40, המוצג בלוח התחתון של איור 12א). בדוגמה זו, מכיוון שהסמנים הבודדים הגנים חזקים בעלי משמעות סטטיסטית ברורה, הסמנים הרב-ממדיים אינם מוסיפים ערך ניבוי משמעותי (ImmunoPrism, כפי שמסומן בתרשים הימני העליון של איור 12ב'). טבלת הנתונים המלאה, כולל תוצאות עבור כל 18 האנליטים עבור הטיפול, מסוכמת בצד ההפוך של הדוח, כולל ניתוח סטטיסטי וסיכום שיטות קצרות.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> איור 12: לדוגמה דוח ביוארקר עבור דגימות NSCLC. קו ההברחה של דיסקברי ביורקר מספק דוח חזותי של סמנים בודדים, ומחשב ביואריקר רב-ממדי ללמידה, עם סטטיסטיקות מפורטות. (א) עבור מחקר זה, הצינור זיהה שני סמנים בודדים (CD47 ו OX40) מבחינה סטטיסטית-משמעותי להגדרת התקדמות המחלה עם סף של 18 חודשים. (ב) פרטים על פעולת השירות והתוצאות המלאות נכללים בצד ההפוך של הדוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: ערכת חומרים מגיב. רשימה של חומרים המסופקים בערכת החיסונית מפורטת ברשימה, יחד עם מספרי החלקים שמפנים לפרוטוקול היצרן. כל הציוד והחומרים הנדרשים מפורטים ברשימת החומרים. בקר <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> עבור גליונות נתוני בטיחות (sds). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>
טבלה משלימה 2: תוכניות הציקלור תרמי. תוכניות הציקלer המומלצות שאליהן מפנה הפרוטוקול מסוכמות לנוחות התיכנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>
טבלה משלימה 3: רצף מדריך אינדקס. האינדקס הראשי המופיע בערכה הכימית מפורטים ברשימה; פריימר ייחודי מתווסף לכל תגובה לאחר רצף deריבוב. שילובים מומלצים של מפלסים ברמה נמוכה מסופקים אף הם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>

השימוש בגישה מבוססת RNA כדי לקבוע פרופילים חיסוניים כמותיים של רקמות הגידול מוצק ומינוף גדודים קליניים עבור גילוי החיסונית-אונקולוגיה בסמנים מתואר באמצעות פרוטוקולים מולקולריים ואינפורמטיקה.

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

אפיון מקיף של המיקרו-וירוס הגידולי חיוני במחקר אימונו-אונקולוגי. המבחן הזה הוא הראשון להשתמש במודלים מבוססי RNA לביטוי בריאותי למדידת תאים חיסוניים ברקמת גידול מוצקה. בדיקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג מדידות רגישות וספויות מאוד של ההקשר החיסוני ברקמות גידול מוצקות FFB ולשלב תוצאות אלה לתוך סמן ביולוגי רב מימדי.כל הטיפולים בסרטן, לא רק immunotherapies, לירות תגובה חיסונית באתר של הגידול מוצק. מדידת תגובה חיסונית זו חשובה להבנת התקדמות המחלה ותגובות הטיפול. פרוטוקול זה משלב טכניקות הכנה מסורתיות של ספריית RNA עם לכידה ממוקדת.בעוד זמן רב, ביצוע צעדי שטיפה וניטור נקודות הביקורת איכות כפי שהוצע חשוב מאוד להצלחה. עבור RNA מושפל מאוד מדגימות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין, להרכיב את תגובת סינתזת הגדיל הראשון על הקרח על פי השולחן. מערבבים ביסודיות את התגובות על ידי צינור למעלה ולמטה מספר פעמים לפני לזמן קצר מסתובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה.בסוף הצנטריפוגה, מיד למקם את הדגימות לתוך מחזור תרמי שחומם מראש בעקבות תוכנית מספר שלוש מהשולחן. עבור RNA שלם באיכות גבוהה, להרכיב את תגובת סינתזה גדיל הראשון על קרח בצינור PCR ללא גרעין כפי שמתואר בשולחנות. כדי להתחיל בהליך זה, לערבב 200 ננוגרם של הספרייה ברקוד של עניין עם שני מיקרוגרם של COT-1 DNA ושני microliters של חסימת אוליגוס בצינור PCR ללא גרעין.לאחר מכן השתמש רכז ואקום להגדיר 30 עד 45 מעלות צלזיוס כדי לייבש את התוכן של הצינור. לאחר ההכלאה, להסיר את הדגימות מן האופניים התרמיים ולהגדיר את האופניים התרמיים כדי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס עם המכסה מחומם להגדיר 70 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 17 microliters של חרוזים הומוגניים לחלוטין לדגימות פיפטה ביסודיות למעלה ולמטה 10 פעמים.כדי לקשור את ה- DNA לתוך חרוזים, למקם את הצינורות לתוך האופניים התרמיים בעקבות תוכנית 10 לזמן קצר הסרת הצינורות הפשיטו כל 10 עד 12 דקות במשך שלוש שניות של מערבולת עדינה כדי לשמור על חרוזים מחדש. מיד לאחר הדגירה מחייב, להסיר רצועה אחת של צינורות מן האופניים התרמיים ולהוסיף 100 microliters של חיץ לשטוף שחומם מראש אחד לצינורות. פיפטה ביסודיות למעלה ולמטה 10 פעמים ומ מניחים את הצינורות על מתלה מגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיפרד לחלוטין מתסכון לשטוף לפני שאיפה DNA מאוגד המכיל על טבעי.מוציאים את הצינורות מהמדף ומוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה מחמיר שחומם מראש עם ערבוב יסודי כדי למחוץ לחלוטין את חרוזים דואגים כדי למנוע בועות. מניחים את הצינורות בחזרה לתוך האופניים התרמיים ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני הצבת הצינורות בחזרה על המדף המגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיפרד לחלוטין מן העל טבעי. להשליך את ה-DNA מאוגד המכיל supernatants, לשטוף את חרוזים שוב עם חיץ כביסה מחמיר שחומם מראש כפי שהוכח רק עבור סך של שתי שטיפות מחמירות.לאחר הכביסה האחרונה, להסיר את supernatant ולהוסיף 150 microliters של מאגר לשטוף טמפרטורת החדר אחד לצינורות. פיפטה לשטוף 10 עד 20 פעמים כדי לחלוטין resuspend את חרוזים להדגור את הדגימות עם המכסה אטום במשך שתי דקות לסירוגין בין מערבולת במשך 30 שניות נח במשך 30 שניות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה בקצרה מניחים את הצינורות על המדף המגנטי ומסירים את העל-טבעי ברגע שהחרוזים דבקים באופן מלא במגנט.צנטריפוגה הצינורות לזמן קצר עם הכובעים סגורים ולהחזיר את הדגימות למדף המגנטי. השתמש פיפטה 10 microliter כדי להסיר כל מאגר לשטוף שיורית ולהוסיף 150 microliters של מאגר לשטוף טמפרטורת החדר שני. פיפטה לשטוף 10 עד 20 פעמים כדי לשימוש חוזר לחלוטין את חרוזים דגירה הדגימות עם המכסים אטום במשך שתי דקות לסירוגין בין מערבולת במשך 30 שניות נח במשך 30 שניות.לאחר צנטריפוגה קצרה, להעביר את כל נפח של חרוזים מכל צינור לתוך צינורות PCR נקיים ללא גרעין ולה מניחים את הצינורות על המדף המגנטי. לאחר השלכת הדנ"א הלא מאוגד המכיל על-טבעי, צנטריפוגה קצרה של הדגימות שוב ושימוש בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר כל חיץ שטיפה שיורית מהחרוזים בזמן שהם נמצאים במדף המגנטי. הוסף 150 microliters של חיץ לשטוף שלוש לצינורות פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים כדי למחוץ לחלוטין את חרוזים.דגירה הצינור במשך שתי דקות לסירוגין בין 30 שניות של מערבולת עדינה 30 שניות של מנוחה לפני צנטריפוגה לזמן קצר. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי כדי לשאוף את העל-טבעיים ולזמן קצר לקצרה צנטריפוגה דגימות חרוזים שוב. השתמש פיפטה 10 microliter כדי להסיר כל מאגר לשטוף שיורית מן החמרוזים בזמן שהם במתלה מגנטי לפני הסרת הצינורות מן המדף resuspending את חרוזים ב 20 microliters של מים ללא גרעין לכל צינור.ואז פיפטה את חרוזים 10 פעמים כדי להבטיח כי כל חרוזים דבוקים לצד של הצינורות כבר resuspended. יש להעריך את נוכחותם של עמעומי מתאם כדי לקבוע אם יש צורך בניקוי נוסף. לדוגמה, אלקטרופרוגרמה זו מציגה רמה מקובלת של עמעום מתאם המופיע כשיא חד סביב 128 זוגות בסיס בעוד אלקטרופרוגרמה זו מציגה רמה בלתי קבילה של עמעום מתאם.הפרופילים החיסוניים לפני ולאחר הטיפול עשויים לשמש להבנת ההשפעות של טיפול ספציפי על microenvironment הגידול כמו בניתוח מייצג זה שעבורו השינויים באחוזים עבור כל תא חיסוני של עניין ואת התוכן החיסוני הכולל מוצגים לפני ולאחר כימותרפיה עבור חולה אחד. בניתוח זה, דגימות בין קבוצות חולים הושוו בהתאם לזמן שלהם להתקדמות המחלה לאחר הטיפול. תת קבוצה של חולים הראו הישנות המחלה לאחר 18 חודשים בעוד תת קבוצה אחרת התקדמה מהר יותר ב 18 או פחות חודשים.לאחר מכן ניתן להשוות את ערך הדלתא החציוני עבור כל מדגם כדי לזהות סמנים ביולוגיים putative של התקדמות המחלה. לדוגמה, כאן זוהו שני גנים של בריחה חיסונית כמבילים מובהקים סטטיסטית של קבוצות המדגם. מכיוון שהסמנים הביולוגיים של הגנים הבודדים היו חזקים עם מובהקות סטטיסטית ברורה, הסמן הביולוגי הרב-ממדי לא הוסיף ערך חיזוי משמעותי.הקפד לבצע את השטיפה המחוממת רצועה אחת בכל פעם כדי למנוע קירור מדגם ולזכור להעביר את חרוזים צינורות טריים, כדי למנוע זיהום מחוץ ליעד. פרוטוקול זה מדגים את השימוש במודלים של ביטוי גנים לכימות תאי מערכת החיסון ורקמות הגידול. מודלים חדשים מפותחים למדידת מצבי תאים כגון תשישות או הפעלה.

predictive-immune-modeling-of-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.

מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי

פרוטוקול זה מתאר את הדור של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS) עבור מחקרים אימונו-אונקולוגיים. הוראות ושיקולים בשימוש במודל זה לבדיקת אימונותרפיה אנושית על גידולים אנושיים המושתלים במודל זה מוצגים בדגש על אפיון התגובה של מערכת החיסון האנושית לגידול.

בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד מתבצע אפיון תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אימונוהיסטוכימיה מרובה.

ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

כאן אנו מתארים שיטת הבידוד של stellate בתאי הכבד מהכבד העכבר. עבור טיהור תא stellate, כבדי עכבר...

שבעה צעדים Stellate תאים

למד מידול חיסונית חזוי של גידולים מוצקים באמצעות RNA ולכידה מכוונת. שיטה זו מאפשרת מדידה רגישה של תאים חיסוניים וגילוי ביומרקרים רב-ממדיים לחקר אימונו-אונקולוגיה.

מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים

גלה סרטונים נוספים